通过静电纺丝技术制备的有序聚乳酸纤维膜生物相容性及抗菌性能

《iScience》：Biocompatibility and antibacterial properties of ordered PLA fiber membranes fabricated via electrospinning technology

　　

摘要
• 有序的聚乳酸（PLA）纳米纤维引导了施万细胞的对齐和增殖
• 载莫西沙星膜在2小时内消灭了细菌
• 多功能膜结合神经引导与抗菌活性

摘要
周围神经损伤仍然是主要的临床挑战，因其自我再生能力有限且术后感染风险高。本研究通过静电纺丝技术制备了高度有序的聚乳酸（PLA）纳米纤维膜，并负载2.0%莫西沙星，以实现轴突导向和局部抗菌的双重功能。形态学表征显示纤维直径均匀、平行取向、孔隙互连，具有优良的机械性能和合适的亲疏水平衡。体外实验表明施万细胞在膜表面保持持续增殖，并沿纤维取向方向呈现显著对齐。抗菌评估显示，载莫西沙星有序PLA膜在2小时内几乎完全消灭细菌，其机制与细菌膜结构破坏和活性氧（ROS）积累诱导密切相关。本工作为兼具神经修复与抗菌功能的多功能支架材料提供了设计策略和实验依据。

图示摘要

引言
周围神经损伤是临床常见的创伤性疾病，其中坐骨神经损伤是最严重的类型之一。此类损伤可导致运动、感觉和自主神经功能障碍，严重影响患者生活质量。尽管周围神经具有一定的再生能力，但在存在较大神经缺损的情况下，自发恢复往往难以实现。传统自体神经移植仍是修复的金标准，但受限于供体稀缺、移植物萎缩和术后瘢痕形成等因素，其临床适用性受到制约。周围神经损伤可由创伤、高能量冲击、手术切除或神经压迫引起，在交通事故受害者和职业损伤患者等高风险人群中尤为常见。鉴于坐骨神经解剖结构复杂且长度较长，其内在再生潜力有限。常规缝合技术往往无法在间隙较大的损伤中实现令人满意的功能恢复，这凸显了在再生医学领域开发更有效、更安全的神经修复策略的迫切需求。

近年来，组织工程为周围神经修复提供了新途径。其中，开发具有优异生物相容性和引导能力的人造神经导管材料已成为主要研究焦点，这些材料作为支架桥接神经断端并促进轴突再生。合成聚合物如聚乳酸（PLA）和聚己内酯（PCL）因其生物相容性、生物可降解性和可静电纺丝加工性而被广泛使用。将PCL与明胶等天然聚合物共混（PCL/Gel）可进一步增强生物活性并支持神经突起生长。脱细胞细胞外基质（d-ECM）基材料提供天然生物化学信号以促进施万细胞迁移和轴突再生；然而，由于其机械性能方面的局限，通常需要与合成支架结合使用。在各种候选材料中，PLA因其良好的生物可降解性、生物相容性和机械性能而在神经组织工程中展现出巨大潜力。在体内，PLA经水解降解为乳酸，最终代谢为二氧化碳和水，已被广泛应用于可吸收缝合线、药物递送系统以及组织工程支架中。然而，传统的随机取向PLA支架在引导有序轴突生长方面存在局限性，而有序轴突生长是确保轴突准确延伸至损伤远端的关键过程。为克服这一局限，近年来静电纺丝技术被广泛用于制备具有高度有序排列的纳米纤维或微纤维膜。该技术利用高压静电场将聚合物溶液拉伸成细纤维，随后沉积到收集器上形成纤维网络。通过控制收集器的构型和电场分布，可获得高度取向的纤维，模拟天然神经组织的结构特征，促进施万细胞沿特定方向的迁移和轴突延伸。大量研究证实了有序静电纺丝纤维在周围神经修复中的有效性。此前研究表明，有序纳米纤维可调节施万细胞取向、促进神经突起延伸，并在体外和体内实验中增强轴突再生。研究发现，与随机纤维相比，有序静电纺丝纳米纤维显著促进神经突起延伸。此外，有序PLA纳米纤维可有效引导神经突起沿纤维轴方向生长。近年来，负载细胞外基质成分或固定生长因子的静电纺丝支架也已开发出来，以进一步增强神经再生。这些研究充分证明了拓扑学信号在神经修复中的重要作用。

然而，细菌感染仍然是制约神经导管临床应用效果的主要因素之一。神经组织一旦受损并经手术暴露，极易受到细菌污染，尤其是金黄色葡萄球菌和 Escherichia coli 等常见病原体，它们可在支架表面形成生物膜，引发持续性局部炎症，阻碍组织再生，严重时甚至需要移除支架。传统的全身抗菌治疗往往无法在局部达到有效的治疗药物浓度，并可能导致耐药性的产生。莫西沙星是一种新型第四代氟喹诺酮类抗生素，具有广谱抗菌活性、高效低毒等特点，广泛用于治疗呼吸道感染、泌尿道感染和术后手术感染，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎链球菌等常见病原体表现出强烈的抑制活性。尽管莫西沙星已被纳入局部药物递送系统（包括水凝胶贴片和创面敷料），但其在神经修复领域的应用尚未得到广泛探索。从组织工程的角度来看，术后感染和轴突再生方向性引导不足仍是现有神经导管的两大主要局限。定向对齐的静电纺丝纤维可提供物理信号，引导施万细胞对齐和迁移，这对轴突再生至关重要；而抗菌剂的局部递送可有效降低感染风险，为神经修复创造有利的微环境。因此，开发兼具促神经再生和抗菌能力的有序PLA纤维支架有望克服传统神经导管结构单一且缺乏有效抗菌性能的限制。许多静电纺丝神经修复支架仍依赖多组分体系、表面固定生物活性分子或细胞外基质衍生物来增强生物活性。虽然这些策略有效，但往往增加了材料制备的复杂性、成本及潜在转化难度。此外，尽管体内实验对于临床转化至关重要，但体外评估在神经修复材料开发早期阶段具有重要价值。体外实验可在受控条件下系统评估材料的细胞相容性、细胞定向引导能力和药物释放行为，有助于阐明材料-细胞相互作用机制，并为后续体内实验提供重要的设计依据。因此，体外研究是复杂动物实验之前的重要筛选和优化步骤。基于上述理由，本研究旨在通过静电纺丝技术制备高度有序的PLA纳米纤维膜并负载莫西沙星以赋予抗菌活性。系统评估了材料的生物相容性、细胞引导效果和体外抗菌性能，为周围神经损伤修复的多功能支架开发提供理论和实验基础，特别针对同时预防术后感染和促进组织再生这一挑战。

结果
静电纺丝有序PLA纤维膜的宏观与微观结构特征
本研究系统表征了静电纺丝纤维膜的制备工艺和结构特征，并通过高压电场下泰勒锥的形成展示了静电纺丝原理。该过程在旋转收集器上实现连续纤维沉积（图1A）。宏观观察显示，所得PLA膜为白色、不透明、均匀的薄片，表面光滑、边缘规整（图1B）。膜可裁剪为各种形状和尺寸，并表现出优异的成膜性和加工性，以满足后续生物实验中对支架完整性和稳定性的要求。在微观层面，扫描电子显微镜（SEM）揭示了膜的取向和多尺度形态特征（图1C）。低倍镜图像显示纤维主要沿统一方向平行排列，排列紧密且无珠状缺陷（图1C）。纤维直径分布均匀，反映了稳定且可重复的静电纺丝过程。纤维形成互连孔隙，具有不同形状和大小，包括不规则多边形孔隙和沿纤维取向方向的细长缝隙（图1C），具有良好的结构连续性，有利于三维（3D）细胞浸润和营养交换。高倍镜图像显示纤维表面光滑、轮廓清晰。多层纤维沿厚度方向交织，形成紧密的三维网络（图1C）。在某些区域，孔隙呈现与纤维取向一致的细长轴。这种有序、多孔的三维结构支持细胞稳定黏附和迁移，引导施万细胞和其他神经相关细胞进行定向轴突生长。它还提供了充足的位点用于负载和释放莫西沙星等生物活性物质，从而实现神经修复与局部抗菌双重功能。综上，该制备方法和所得膜架构为有序PLA纤维膜在神经组织工程和抗菌支架开发中的应用奠定了坚实的结构和形态基础。

图1 有序PLA静电纺丝纤维膜的制备与结构表征
(A) 静电纺丝示意图，显示泰勒锥形成及在高转速收集器上的沉积以产生取向纤维。(B) 均匀光滑的PLA膜宏观外观。(C) SEM图像显示排列紧密、平行取向的纤维，直径均匀且具有互连多孔结构。A1的比例尺为10 μm，A2的比例尺为3 μm。

PLA浓度对纤维形貌和直径分布的影响
静电纺丝有序PLA纤维膜的质量和结构受聚合物浓度显著影响。制备了10%、12%和14%的PLA溶液，并通过SEM表征其膜的对齐性、表面完整性和孔隙结构。在10% PLA条件下，纤维出现珠状缺陷，直径不均匀，表面粗糙，网络松散，这归因于低粘度和较差的射流稳定性（图2A）。在12% PLA条件下，纤维排列均匀、表面光滑、无缺陷，直径一致，孔隙分布均匀，形成致密的三维网络，非常适合机械支撑、细胞黏附、迁移和药物扩散（图2B）。在14% PLA条件下，纤维较粗、不均匀，部分纤维融合或塌陷，孔隙率降低，对齐性略有下降（图2C）。直径分析证实浓度增加导致纤维直径显著增大，三组之间存在统计学显著差异（图S1）。此外，在12% PLA中加入明胶使纤维直径分布变宽，引起纤维卷曲和融合，增加了表面粗糙度，降低了取向性；这些效应可归因于粘度、表面张力和固化动力学的改变（图S2）。虽然明胶提高了亲水性，但损害了结构均匀性和取向性。因此，选择纯12% PLA有序膜进行进一步的生物相容性和抗菌评估。

图2 不同浓度静电纺丝PLA纤维膜的SEM分析
不同浓度PLA膜的SEM图像：10%（A）、12%（B）和14%（C），以不同放大倍数拍摄。从左至右图像比例尺分别为100 μm、30 μm和20 μm。

有序PLA纤维膜性能表征
在优化有序PLA纤维膜的制备参数和结构形貌后，系统表征了其物理化学性能以评估其在神经修复应用中的适用性。载药后纤维形貌发生变化（图3A）。与空白纤维相比，载药纤维平均直径减小。此外，部分纤维表面出现附着物且表面光滑度降低，表明药物掺入影响了纺丝溶液的稳定性。还观察到纤维部分颜色变化，提供了药物负载成功的初步视觉证据（图3A）。与未负载的PLA纤维膜相比，载药纤维直径分布更均匀，保持了良好的连续性，尽管平均直径有所下降。

统计分析显示，空白PLA纤维的平均直径为2.09 ± 0.21 μm，而载药PLA纤维的平均直径为1.47 ± 0.15 μm（图3B）。吸水测试显示，Moxi+PLA纤维膜的吸水率（714.64%）显著高于PLA组（535.56%），表明药物掺入改善了材料的亲水性。水接触角结果与此发现一致（图3C）。接触角从PLA组的122.5° ± 6.1°降至Moxi+PLA组的93.1° ± 1.5°，表明表面润湿性增强（图3D）。降解测试显示，两组在早期阶段表现出相似的降解速率。然而，随着孵育时间的延长，Moxi+PLA组表现出略高的失重速率，表明药物可能促进材料水解或增加水的渗透（图3E）。力学测试显示，Moxi+PLA纤维膜的整体力学性能优于纯PLA膜（图3F）。其表现出更高的应力承载能力和更好的延伸能力。总体而言，这些特性既提供了稳定的结构支撑，又营造了有利的细胞微环境，为后续的细胞相容性和抗菌性能研究奠定了基础。

**图3 PLA及载Moxi的PLA静电纺丝纤维膜的物理化学表征**

(A) 静电纺丝PLA纤维及Moxi+PLA纤维的SEM图像。标尺为20 μm。(B) 纤维直径分布的定量测量（每组n = 50根纤维）。(C) 纤维膜的吸水率测量（每组n = 5个独立样本）。(D) 纤维膜的水接触角测量。(E) 通过随时间变化的失重率评估的体外降解行为。(F) 纤维膜的拉伸应力-应变曲线。数据以平均值 ± 标准差表示（n ≥ 3）。

有序PLA纤维膜表现出良好的细胞相容性并促进施万细胞的方向性生长

为评估有序PLA纤维膜的神经毒性及神经组织相容性，将RSC96施万细胞转导表达绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒，并通过两种方法进行评估。首先，CCK-8检测结果显示，在12、24和48 h时细胞活力随时间增加。各组之间未见显著差异，表明药物加载未对细胞活力造成明显不良影响。在所有组中，细胞在整个培养期间均维持高存活率。光密度（OD）值随时间显著增加并在48 h时达到最大值，表明细胞持续增殖（图4A）。该结果表明，在浸泡过程中，膜未释放出损害细胞活性的有毒物质，证实了良好的细胞相容性且无细胞毒性（图4A）。其次，当RSC96细胞直接培养在有序PLA膜表面时，荧光显微镜观察显示，在24 h时，两组细胞均匀分布，呈纺锤形或伸长状，细胞体明显延伸（图4B）。在PLA和Moxi+PLA组中，细胞表现出明显的定向性，大多数沿纤维方向排列。到48 h时，细胞密度进一步增加，形成了致密的细胞间网络（图4B）。PLA组中的细胞沿膜表面呈更连续的分布，且排列更加均匀，表现出明显的方向性生长（图4B）。对神经突触生长的定量分析显示，在24 h（图4C）和48 h（图4D），PLA和Moxi+PLA组的神经突触长度均显著高于对照组。该结果表明，有序纤维结构可促进施万细胞的突触延伸。同时，药物掺入对神经突触生长的影响极小。药物定量标准曲线显示，吸光度与莫西沙星浓度之间存在强线性关系（R2 = 0.9901），表明检测方法具有良好的准确性和可靠性（图4E）。药物释放动力学结果表明，Moxi+PLA载药纤维膜在30天内维持了相对稳定的日释放速率（图4F）。未观察到明显的突释现象，表明该体系具有良好的缓释性能。这些发现表明，有序PLA纤维膜对施万细胞无毒，为细胞粘附和增殖提供了良好的基质，并具有神经组织相容性和方向引导的强潜力。

**图4 有序PLA纤维膜对施万细胞增殖和形态的影响**

(A) CCK-8检测分析施万细胞在有序PLA膜预处理培养基和标准培养基中的增殖情况。(B) 培养于组织培养板和有序PLA纤维膜上的RSC96细胞的显微图像。标尺为1 mm。(C) 24 h时每细胞神经突触长度的定量分析（n = 20）。(D) 48 h时每细胞神经突触长度的定量分析（n = 20）。(E) 基于吸光度测量的莫西沙星定量标准曲线。(F) Moxi+PLA纤维膜中莫西沙星在30天内的日释放曲线。数据以平均值 ± 标准差表示（n = 3）。数据至少进行了三次生物学重复。统计分析采用单因素方差分析后接Tukey事后检验。n.s.，无显著差异；***p < 0.001。

载2.0%莫西沙星的有序PLA纳米纤维膜表现出广谱强效抗菌活性

为评估抗菌性能并阐明潜在的抗细菌作用机制，将载2.0%莫西沙星的有序PLA纳米纤维膜针对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌29213和革兰氏阴性大肠杆菌25922进行测试。抗菌试验显示对两种细菌均表现出显著的时间依赖性杀菌效应。与对照组相比，在0.5 h时菌落数显著减少，1 h时进一步减少，到2 h时几乎降为零，表明膜能够快速高效地杀灭细菌（图5A）。细菌膜完整性分析显示，随着时间推移，碘化丙啶（PI）荧光显著增加，表明膜完整性逐步丧失。在金黄色葡萄球菌29213中，PI荧光在0.5 h时显著增加，随后在1 h和2 h时进一步升高（图5B）。在大肠杆菌25922中，PI荧光在1 h时显著增加，随后在2 h时达到最大值（图5C）。ROS检测表明，在金黄色葡萄球菌29213中，0.5 h和1 h时ROS水平与对照组相当；然而，在2 h时显著增加（图5B）。在大肠杆菌25922中，ROS水平在1 h时显著升高，并在2 h时进一步增加（图5C）。这些发现表明，抗细菌机制涉及膜破坏伴随ROS积累。对膜表面细菌形态的SEM成像支持了这些观察结果。在对照组中，细菌密集分布，细胞轮廓完整，表面光滑，呈典型的杆状形态（图S3）。相比之下，载莫西沙星的膜组细菌数量显著减少，残留细胞表现出明显的收缩、塌陷、破裂、表面不规则和碎片化，表明结构严重受损（图S3）。综合这些结果，证实载2.0%莫西沙星的有序PLA纳米纤维膜能够通过破坏膜完整性、胞内内容物泄漏和氧化损伤的机制，快速有效地杀灭革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。

**图5 载2.0%莫西沙星的有序PLA纳米纤维膜的抗菌活性**

(A) 不同时间间隔处理后金黄色葡萄球菌29213和大肠杆菌25922的菌落形成。细菌膜完整性（PI荧光）(B)和ROS水平(C)随时间的变化。数据以平均值 ± 标准差表示（n = 3）。统计分析采用单因素方差分析后接Tukey事后检验。数据至少进行了三次生物学重复。n.s.，无显著差异；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

**讨论**

周围神经损伤修复需要支架材料，既能为轴突再生提供结构支撑，又能应对术后感染的高风险，否则可能影响修复效果。传统神经导管往往难以同时满足这两项要求——随机纤维取向限制了其引导轴突生长的能力，而缺乏固有抗菌性能使修复部位易受微生物定植，尤其是金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，可形成持续性生物膜。近年来静电纺丝技术的进展使得能够制备高度有序的纳米纤维支架，模拟天然神经组织的取向结构，为施万细胞迁移和轴突延伸提供物理导向信号。将抗菌剂纳入此类支架是一种有前景的策略，可在单一可植入材料中结合再生和抗感染功能。

在本研究中，成功通过静电纺丝制备了有序PLA纳米纤维膜，并通过加载莫西沙星实现了抗菌功能。对材料的结构形貌、物理化学性质、细胞相容性、细胞导向能力和体外抗菌活性进行了系统评估。结果表明，这种多功能支架设计具有优势，特别是在同时提供结构导向和局部抗菌效应方面。

在形貌和结构优化方面，本研究通过精确控制静电纺丝参数，实现了高度取向的PLA纤维膜，从而克服了随机取向纤维在轴突导向方面的局限性。既往研究表明，神经轴突再生严重依赖于细胞外基质提供的取向信号，而随机分布的支架往往导致轴突生长分散，从而降低功能恢复效率。本研究制备的12% PLA纤维膜在SEM下表现出有序平行排列、均匀的直径分布和良好互连的多孔结构；这些特征促进了施万细胞的方向性迁移，并为药物加载和释放提供了结构基础。与常见的非取向PLA膜相比，这种有序结构在保持力学性能的同时，优化了细胞行为调控的微环境。膜的物理化学性质也表现出显著优势。吸水率超过525%，膜能够在神经修复部位维持稳定的湿润环境，这对于细胞代谢和轴突再生至关重要。接触角测量显示中度表面疏水性（约122°）——这是一种与常规亲水改性策略不同的表面特性；这种"外疏内亲"的分布模式在保留内部湿度的同时，最小化了快速液体扩散。此外，膜表现出稳定的降解曲线（12周内失重12.68%），确保了神经再生关键阶段的结构完整性，防止支架过早坍塌。最大拉伸强度高于大鼠坐骨神经（2.7 MPa），表明该支架兼具柔韧性和承载能力——这对于在运动中承受拉伸力的周围神经修复材料尤为重要。静电纺丝纤维膜的拉伸性能是在干燥状态下测量的，以确保测试稳定性。然而，水合状态下的力学性能对于体内应用更为相关，因为在植入后材料会暴露于生理流体中。因此，未来的研究将进一步评估膜在湿态条件下的力学行为，以更好地模拟生理环境。

在细胞相容性和细胞行为方面，本研究的结果验证了有序PLA膜对施万细胞的方向引导效果。CCK-8检测显示无明显细胞毒性，细胞在48 h内维持稳定的增殖趋势。荧光显微镜进一步证实，施万细胞沿纤维取向延伸并形成致密的细胞间网络。该结果与既往关于取向PCL或胶原支架促进施万细胞迁移的报道一致。类似地，在本研究中，在纯PLA体系内实现了相当的导向效果，无需额外的生物活性分子修饰。这种纯物理取向导向策略不仅简化了制备过程，还降低了生物安全风险。

在抗菌功能方面，本研究的创新之处在于直接将莫西沙星纳入有序PLA纳米纤维膜，以实现结构导向和局部抗菌作用的协同效应。与常见的表面涂层抗菌策略相比，该方法使药物在纤维内均匀分布以实现缓释，避免了表面结合剂快速耗尽或冲刷流失。结果表明，载2.0%莫西沙星的有序PLA膜能在短短2小时内将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌落数降至几乎不可检出的水平，表现出广谱高效杀菌活性。

这种杀菌速率明显快于某些银纳米粒子或季铵盐改性膜。机理探索表明，抗菌效果与细菌膜完整性的破坏和活性氧(ROS)积累诱导密切相关。PI染色和ROS检测显示，莫西沙星负载膜在不同时间点显著增强了细菌膜通透性和ROS水平，最终导致细胞崩解和破裂。这一观察结果与氟喹诺酮类已知的机制一致，即破坏DNA旋转酶和拓扑异构酶IV活性，从而引发氧化应激。细菌皱缩和破裂的SEM观察进一步支持了这一协同机制。这些发现表明，将抗菌剂整合入取向支架可在物理上阻碍细菌黏附，同时在化学层面上快速消灭残余细菌，从而大幅降低植入物相关感染的风险。值得注意的是，本研究主要聚焦于评估抗菌效果及材料相关性能，而非直接的分子水平验证。未来涉及DNA复制相关基因表达分析或DNA旋转酶和拓扑异构酶IV酶活性检测的研究，将有助于进一步阐明载药支架体系的详细抗菌机制。本研究的核心亮点在于在单一材料体系中同时实现轴突导向和局部抗菌活性，克服了传统神经修复支架在细菌感染防御方面不足的局限。临床上，周围神经损伤患者常同时面临组织缺损和术后感染风险。传统方法通常需要额外的抗菌敷料或全身抗生素，这增加了治疗复杂性和抗菌耐药风险。所提出的策略能够在支架植入后提供长期抗菌保护，简化术后管理并潜在降低并发症发生率。研究局限性首先，抗菌性能主要通过体外实验验证，尚无法在动物感染模型中进行全面评估，以评价局部药物释放动力学、抗菌持久性和组织修复质量。其次，莫西沙星的释放曲线需通过体外释放实验和药代动力学研究进一步优化，以确保在神经再生过程中维持有效浓度。未来研究还可探索与其他生物活性分子共负载，如神经营养因子，以实现神经再生和免疫调节的协同效应。资源可用性主要联系人如需进一步信息和资源，请联系主要联系人Lu Longwei（[e-mail]），将由其主要联系人满足。材料可用性本研究未产生新的独特试剂。数据和代码可用性•本研究中产生的数据集已存入Mendeley Data，自发表之日起公开可用。登录信息列于关键资源表中。https://doi.org/10.17632/d3jt683z8d.1。•本论文未报告原始代码。•重新分析本文报告数据所需的任何附加信息均可从主要联系人处获取。致谢本工作得到浙江省中医药科技计划项目[2025ZX034]资助。作者贡献L.L.和Zhen Zhang负责概念构思；D.X.、K.L.和Zeyu Zhang负责方法论；D.X.、X.Z.、J.X.和Y.C.负责验证；Z.L.、J.G.和H.L.负责形式分析；L.L.和Zhen Zhang负责原稿撰写与审阅编辑。所有作者均审阅了稿件并批准了最终版本。利益声明作者声明无竞争性利益冲突。STAR★方法关键资源表试剂或资源、来源、标识符细菌和病毒菌株：金黄色葡萄球菌ATCC ATCC 29213；大肠杆菌ATCC ATCC 25922；pCDH-CMV-EF1-copGFP慢病毒郑州大学基础医学院N/A。化学品、多肽和重组蛋白：聚乳酸Sigma-Aldrich Cat#38534；莫西沙星MCE Cat#HY-66011A；二氯甲烷国药集团Cat#40013561；N,N-二甲基甲酰胺国药集团Cat#40072363；明胶Sigma-Aldrich Cat#1288485；磷酸盐缓冲液Gibco Cat#20012027；胎牛血清Gibco Cat#A5256701；高糖DMEM培养基Gibco Cat#31800022；碘化丙啶碧云天Cat#C1008S；2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯碧云天Cat#S0033S。关键商业检测：CCK-8检测试剂盒碧云天Cat#C0038。存入的数据：原始和分析数据Mendeley Data https://doi.org/10.17632/d3jt683z8d.1。实验模型：细胞系RSC96细胞ATCC CRL-2765。软件和算法：GraphPad Prism 9.0 https://www.scienceplus.com/nl/prism-commercieel.html N/A；ImageJ软件美国国立卫生研究院(NIH) RRID: SCR_003070。在新标签页中打开表格方法细节材料与试剂聚乳酸(PLA，分子量≥100 kDa)购自Sigma-Aldrich(美国)；莫西沙星(纯度≥98%)购自MCE(中国)；二氯甲烷(DCM)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)；明胶(IV型)购自Sigma-Aldrich(美国)。CCK-8检测试剂盒购自碧云天生物技术(中国上海)；磷酸盐缓冲液(PBS)购自Gibco(美国)；胎牛血清(FBS)和高糖DMEM培养基购自Gibco(美国)。碘化丙啶(PI)和2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)购自碧云天生物技术(中国上海)。金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)和大肠杆菌(ATCC 25922)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。所有试剂均为分析纯或细胞培养级。有序PLA纳米纤维膜的制备基于前人报道的方法进行适当修改。所有纺丝实验均在通风橱内严格控制环境条件下进行，以确保工艺稳定性和可重复性。实验室温度维持在24°C±3°C，相对湿度控制在50±5% RH，因为环境波动会显著影响溶剂蒸发和纤维形貌。溶液配制时，将二氯甲烷(DCM)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)按体积比2:1混合，配制21 mL混合溶剂。逐步加入聚乳酸(PLA，Mw≈200 kDa，NatureWorks，美国)，获得最终浓度为12%(w/v)的纺丝液。溶液在室温下磁力搅拌4 h至完全溶解均匀。随后静置30 min去除气泡，并通过0.45 μm疏水膜过滤以去除颗粒和残余气泡。将制备好的纺丝液装入装有金属针头(内径0.6 mm，22G)的10 mL注射器中。针头连接至设定为21 kV的高压电源正极。注射器安装在注射泵上，溶液以0.05 mm/s的恒定进料速率输送。针头与收集器之间的距离固定为17 cm。使用覆有铝箔的高速旋转滚筒收集器收集纤维，滚筒转速设为2000 rpm以获得取向纤维结构。电纺过程中持续监测Taylor锥和射流的形成与稳定性，在稳定条件下维持纺丝直至获得所需面积和厚度的膜。电纺结束后，将纤维膜从收集器上小心剥离，放入干燥器中避光干燥，随后密封包装保存以备后续实验。在上述优化并固定的电纺参数下，制备三批独立样品以确保工艺稳定性和可重复性。莫西沙星负载有序PLA纤维膜的制备将莫西沙星加入12% PLA溶液中，最终浓度为2.0%(w/w)，磁力搅拌至均匀混合。随后在上述相同条件下将载药溶液进行电纺，获得莫西沙星负载纤维膜。干燥后，将膜切割为直径15 mm的圆盘或10×10 mm的方块，在无菌条件下储存直至使用。形貌与结构表征样品在真空下溅射镀覆约20 nm金层以增强导电性，并使用扫描电子显微镜(SEM，TM3030，日本)在5 kV加速电压下观察。通过电子束与样品表面的相互作用获得纳米尺度的表面形貌，用于评估纤维均匀性和形成稳定性。纤维直径通过在高倍图像中随机选取纤维并使用ImageJ软件测量，所得数据用于生成直径分布直方图以评估直径均匀性和制备可重复性。PLA纤维膜吸水率测定基于前人报道的方法进行适当修改，将制备好的纤维膜样品在真空干燥器中干燥至恒重，使用精度为0.1 mg的电子天平称量(干重，md)。随后将样品完全浸入去离子水中，在室温(约25°C)避光条件下孵育48 h，使水完全渗透进入多孔结构。浸泡后，用镊子轻轻取出样品，用无尘滤纸小心吸去表面多余水分而不施加压力以避免变形，立即测量湿重(mw)以最小化蒸发误差。吸水率按以下公式计算：吸水率(%)=(mw?md)/md×100%，计算平均值±标准偏差。水接触角分析基于前人报道的方法进行适当修改，在室温(约25°C)下使用接触角测试仪(JC2000C，上海精浦科技有限公司)表征纤维膜表面的润湿性。测试前，将纤维膜样品平铺固定在玻璃载玻片上以避免褶皱或额外张力。每个实验组至少制备六个独立平行样品。使用超纯水(电阻率≥18.2 MΩ cm)作为测试液体。使用精密微量注射器严格控制液滴体积为5 μL，以确保所有测量中液滴大小和重力效应的一致性。测量过程中，将液滴从针头缓慢释放至样品表面。在液滴接触样品表面后5 s内由仪器高速相机拍摄图像。为最小化局部表面异质性的影响，每个样品至少测量五个随机位置(n=6个独立样品，共30个测量点)。接触角值由仪器内置Young-Laplace拟合算法自动计算。最终数据表示为所有测量点的平均值±标准误(SEM)。降解性能评估基于前人报道的方法进行适当修改，将有序PLA纤维膜切割成与神经导管形状匹配的卷曲形状，记录其初始干重(W0)。样品经去离子水冲洗、干燥后放入管状纤维膜中，然后浸没于120 mm培养皿中的无菌PBS缓冲液中。空白PBS培养皿作为对照。所有样品在37°C下静态孵育。降解测试期间，每周更换PBS，每个时间点采集一组样品。取回的膜用去离子水轻轻冲洗三次以去除残余盐分，用滤纸吸去表面水分，在真空烘箱中干燥4 h至恒重(W1)。由于降解过程中样品表面产生的CO2气泡可能影响PBS环境，每三天更换一次PBS以维持稳定性。失重率计算为：Wloss(%)=(W0?W1)/W0×100%。力学性能表征基于前人报道的方法进行适当修改，将制备并稳定化的有序PLA纤维膜沿纤维取向方向切割为10 mm×30 mm的矩形条。在室温及标准大气压下，使用万能材料试验机(Instron 3343，Instron Ltd.，美国)进行拉伸测试。每个试件两端的有效夹持长度设为10 mm，拉伸速率维持为5 mm/min。测试前，使用精密千分尺在每个试件的三个不同位置测量厚度，取平均值作为厚度参数。每次测试前对试验机的载荷传感器进行归零以确保测量准确性。PLA纤维膜神经毒性和神经组织相容性评估基于前人报道的方法进行适当修改，将有序PLA纤维膜在双蒸水中浸泡12 h，高温灭菌，然后用PBS缓冲液冲洗五次(每次3 min)。随后将膜浸入含10% FBS和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM中，在37°C、5% CO2气氛下孵育48 h制备PLA预处理培养基。RSC96细胞(由郑州大学基础医学院提供)在含10% FBS和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM中，37°C、5% CO2条件下培养。传代时，去除旧培养基，用PBS洗涤两次，用胰蛋白酶消化8 min。终止消化后，通过轻柔吹打将细胞重悬并以1:3比例传代。使用CCK-8法评估细胞活力。RSC96细胞以适当密度接种于96孔板中，与PLA预处理培养基共同培养12、24和48 h。

在每个时间点，向每孔中加入10 μL CCK-8工作液，并孵4小时。使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD）。细胞活力按以下公式计算：细胞活力（%）= [OD450(样品)–OD450(空白)]/[OD450(对照)?OD450(空白)] × 100%。其中，样品、对照和空白分别代表处理组、未处理对照组和空白孔（不含细胞的培养基）的吸光度值。

**PLA纤维膜对培养神经细胞的导向作用评价**

实验包括纤维膜预处理和荧光显微镜下细胞生长观察。将静电纺丝有序PLA纤维膜剪成适当尺寸，浸泡于3%苯扎氯铵溶液中24小时进行灭菌，用PBS充分漂洗后晾干备用。对于慢病毒转导，将对数生长期的RSC96细胞以2 × 10? 细胞/孔的密度接种于6孔板中。培养24小时后，当细胞汇合度达到约30%时，加入pCDH-CMV-EF1-copGFP慢病毒（MOI = 10；由郑州大学基础医学院惠赠）和40 μL TransGP转导增强剂。孵育10小时后，去除病毒上清，更换新鲜DMEM培养基继续培养。对于导向作用评价，将预处理后的纤维膜置于12孔板中，将5 × 10?个GFP标记的RSC96细胞接种于每片膜上。无膜的孔作为对照组。在37°C、5% CO?气氛下孵育指定时间后，使用荧光显微镜观察纤维膜表面的细胞黏附和生长情况，以评估有序膜引导和支持神经细胞生长的能力。

**体外抗菌活性检测**

参照此前报道的方法并稍作修改，将标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC 29213和大肠杆菌ATCC 25922在LB肉汤中37°C、200 rpm振荡培养至对数生长阶段（OD600 ≈ 0.3–0.5）。将细菌悬浮液用无菌PBS稀释至约1 × 10? CFU/mL。将无菌载药PLA膜圆片（直径15 mm）与等体积细菌悬浮液置于无菌培养皿中接触，在37°C静态条件下孵育0.5小时、1小时或2小时。设空白对照组（无膜处理）。孵育后，将反应混合物均匀涂布于LB琼脂平板上，37°C倒置培养24小时后观察并拍摄细菌菌落生长情况。

**细菌膜完整性检测**

参照此前报道的方法并稍作修改，按照上述方法制备细菌悬浮液。在每个指定时间点，取一部分细菌悬浮液与碘化丙啶（PI）混合至终浓度10 μg/mL，室温避光孵育15分钟。孵育后，将样品转入黑色96孔板中，使用多功能酶标仪在激发/发射波长535/617 nm（带宽设置为仪器默认值）处测定红色荧光强度。设阴性对照组（未处理细菌悬浮液+PI），所有组别均设三重复。结果以均值 ± 标准差表示。

**细菌ROS检测**

参照此前报道的方法并稍作修改，通过对数生长期细菌细胞离心收集（5000 × g，5分钟，4°C），用无菌PBS重悬并调整至约1 × 10? CFU/mL。加入2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）至终浓度10 μM，37°C避光振荡孵育30分钟以使探针加载。孵育后，轻轻离心细胞（5000 × g，5分钟），弃去上清，用PBS洗涤两次以去除多余胞外探针。将探针标记的细菌悬浮液与待测样品处理（PBS作为对照）。在指定时间点（0.5小时、1小时、2小时），取一部分立即转入黑色96孔板中。使用多功能酶标仪在激发波长488 nm、发射波长525 nm（带宽和灵敏度设置为仪器默认值）处测定荧光强度。为消除细胞密度差异的影响，同时记录OD600值，并将荧光读数进行归一化处理（荧光强度/OD600）。每个实验设三重复，结果以均值 ± 标准差表示。

**扫描电子显微镜（SEM）观察**

为检查细菌与纤维膜表面的相互作用及相关形态变化，将灭菌后的纤维膜与细菌悬浮液孵育2小时，然后立即用2.5%戊二醛固定4小时以保存细胞和材料的结构完整性。固定后，样品经梯度乙醇系列（30%、50%、70%、90%和100%）脱水，每步15分钟以确保水分彻底去除。脱水后的样品在临界点干燥仪中干燥以防止结构塌陷，溅射镀约20 nm金层以增强导电性，并在适当的加速电压下使用扫描电子显微镜（SEM，SU8010，Hitachi，日本）观察，记录材料和细菌的表面形态。

**定量与统计分析**

所有数据以均值 ± 标准差（Mean ± SD）表示，每个实验至少设三重复。统计分析使用GraphPad Prism 9.0进行。两组间的差异采用双尾非配对t检验评估，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。统计学显著性定义为?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，n.s.表示无显著差异。

**补充信息 (1)**
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文档S1。图S1–S3