催产素受体信号传导有助于维持雄性小鼠的线粒体完整性和胃黏膜稳态

《iScience》：Oxytocin receptor signaling contributes to the mitochondrial integrity and maintain gastric mucosal homeostasis in male mice

　　亮点
- 完整的OXTR信号传导调节正常的胃黏膜更新
- OXT通过内质网Ca2+释放刺激胃酸分泌
- OXT通过促进线粒体完整性，保护胃黏膜免受高脂饮食（HFD）引起的增生
- OXT在胃酸分泌受损时保护壁细胞

摘要
催产素受体（OXTR）信号传导在胃中的作用仍不甚清楚。本研究探讨了OXTR信号传导在壁细胞中的生理和病理生理作用。使用野生型（wt）、OXTR缺失小鼠以及分别喂食标准饮食（SD）或高脂饮食（HFD）的OXTR缺失小鼠，我们研究了OXTR及其信号传导对胃黏膜结构和功能的影响。缺乏活跃OXTR/OXT的SD喂养小鼠表现出黏膜增生，而皮下注射OXTR可逆转这一现象。喂食HFD的wt小鼠出现了典型的胃黏膜增生、壁细胞萎缩及线粒体损伤，并且18F-氟脱氧葡萄糖摄取能力下降。皮下注射OXTR对HFD喂养的wt小鼠有改善作用，但对OXTR缺失小鼠无效，这表明OXTR激活可能有助于维持线粒体完整性。我们的发现支持以下假设：OXTR信号传导在壁细胞中对维持胃黏膜代谢平衡至关重要，并能防止饮食引起的胃部病变。

引言
自20世纪80年代以来，全球肥胖率几乎翻了一番——根据世界肥胖联合会的报告，2010年至2030年间，肥胖成人数量将从5.24亿增加到11.3亿，增长超过115%。肥胖相关的并发症包括糖尿病、心血管疾病和癌症。肥胖还会增加胃炎和胃腺癌的风险。高脂饮食（HFD）是导致肥胖的主要原因之一，因为它会导致能量失衡和代谢压力。肠道可塑性与饮食、代谢和能量平衡密切相关，可能是胃癌发生和发展的关键因素。HFD引起的肥胖会增加哺乳动物肠道中富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（LGR5）阳性肠道干细胞的数量和功能。LGR5在维持和再生肠道干细胞方面具有多重作用，主要作为肠道上皮内干细胞的标志物和调节因子。LGR5被认作是小肠、结肠、毛囊和胃中的成体干细胞标志物。在胃腺癌细胞中，LGR5通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路促进细胞增殖和侵袭。因此，LGR5被确定为胃癌的干细胞标志物。
胃壁细胞除了以分泌酸液著称外，还是调节胃黏膜平衡的重要细胞类型。它们对线粒体功能障碍特别敏感，因为胃酸分泌依赖于线粒体内膜上的氢钾ATP酶（H+,K+-ATPase）产生的高ATP水平。在高脂饮食下，脂肪酸的摄入会损害线粒体功能，导致壁细胞凋亡和最终的黏膜增生。线粒体在调节细胞存活和死亡途径中起关键作用，已知线粒体生物发生受过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）和PPARγ共激活因子1-α（PGC1α）的调控，这些因子由腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）激活。
虽然OXTR主要作为神经肽和哺乳动物社会行为的调节因子而为人所知，但最近的研究揭示了其在能量平衡中的核心作用。多项研究表明，OXTR可以增加能量消耗、减轻体重、减少热量摄入和脂肪量，并改善饮食诱导的肥胖小鼠、肥胖猴子和超重或肥胖人类的胰岛素分泌和脂肪肝状况。
我们的最新研究发现，神经元中的OXTR信号传导可通过促进DNA去甲基化来延缓衰老，从而认定OXTR为抗衰老肽。OXTR是一种在下丘脑合成并通过后叶垂体释放的肽类激素。OXTR通过OXTR受体（OXTR）发挥作用，该受体是一种Gq/11α G蛋白偶联受体（GPCR），主要驱动磷脂酶C（PLC）信号转导级联。然而，OXTR激活还控制其他信号级联，包括MEK1/2、ERK1/2和AMPK。先前的文章报道了OXTR在心血管疾病、糖尿病神经病变和海马区神经元损伤中的保护作用。但目前对OXTR对胃黏膜结构和功能的直接影响知之甚少，其作用于壁细胞的具体机制也尚未被研究。本文报道了OXTR信号传导在壁细胞中的生理和病理生理作用，这些作用使壁细胞能够抵御高脂饮食的负面影响并促进胃酸分泌。结果表明，OXTR激可以将壁细胞从HFD引起的线粒体损伤和胃黏膜增生中保护出来。这些结果共同表明，高脂饮食导致的胃黏膜结构和功能变化可归因于线粒体功能障碍，并可通过OXTR激活得到逆转。这项研究为了解高脂饮食对胃黏膜和壁细胞的影响提供了新见解，为利用OXTR信号通路维持肠道健康提供了依据。

结果
完整的OXTR信号传导对正常胃黏膜更新至关重要
使用oxtr VenusΔNeo/+小鼠观察了胃黏膜中的OXTR表达，发现OXTR表达与H+,K+-ATPase阳性细胞共定位（图1A）。为了研究OXTR及其信号传导在胃中的生理作用，将标准饮食（SD）下的OXTR缺失小鼠和野生型（wt）小鼠的胃黏膜进行了比较。如图1B和1C所示，OXTR缺失小鼠（368.7 ± 20.4 μm）和OXTR缺失小鼠（440.7 ± 22.1 μm）的胃黏膜厚度显著大于wt小鼠（273.4 ± 6.7 μm）。然而，对OXTR缺失小鼠进行九天的皮下OXTR注射后，其胃黏膜厚度显著降低（365.7 ± 9.6 μm）。这些数据表明OXTR信号传导有助于维持健康的肠道，并抑制黏膜增生。

图1 OXT/OXTR缺乏会导致胃黏膜增生
(A) oxtr-VenusΔNeo/+小鼠胃黏膜的共聚焦图像，显示核DAPI、OXTR-Venus、H+, K+-ATPase及合并图像。n = 3只小鼠的结果相似。比例尺，100 μm。
(B) SD喂养的wt小鼠、OXTR缺失小鼠和接受OXT治疗的OXTR缺失小鼠（OXTR null + OXT）胃底区域的H&E染色图像。比例尺，100 μm。
(C) 各组胃黏膜厚度。n (小鼠) = 6、6、7、8。?p < 0.05, ??p < 0.01，单因素ANOVA后进行Holm多重范围检验。
(D) SD喂养的wt小鼠、OXTR缺失小鼠和接受OXT治疗的OXTR缺失小鼠（OXTR null + OXT）胃黏膜的LGR5染色图像。比例尺，50 μm。右上角图示为白色方框区域的放大图；比例尺，10 μm。
(E) 100 μm胃黏膜中LGR5阳性（+）染色面积（μm2）。n (小鼠) = 3、3、3、4。所有数据以平均值±SEM显示。?p < 0.05, ??p < 0.01，单因素ANOVA后进行Holm多重范围检验。
接下来，我们在同一实验组中检测了已知为肠道干细胞标志物的LGR5的分布。在wt小鼠中，LGR5阳性细胞分布于基底膜一侧（图1D和1E）。OXTR缺失小鼠和OXTR缺失小鼠中都观察到LGR5阳性区域增加和胃黏膜增生（图1D和1E）。与增生数据一致（图1B和1C），皮下注射OXTR后，OXTR缺失小鼠的LGR5阳性区域显著减少（图1D和1E）。
胃黏膜中LGR5的增加与胃癌的进展性分化和转移相关。因此，这些数据表明胃黏膜增生、肿瘤风险增加与OXTR信号传导之间存在关联。
为了确定OXTR缺失小鼠和OXTR缺失小鼠的胃黏膜增生是先天发育缺陷还是由固体食物摄入引起的获得性表型，我们在断奶前（出生后第14天）检查了wt小鼠、OXTR缺失小鼠和OXTR缺失小鼠的胃黏膜厚度。如图S1所示，三组之间没有显著差异。这些发现表明，OXTR缺失小鼠和OXTR缺失小鼠的胃黏膜增生是获得性表型，OXTR信号传导在胃黏膜的产后成熟中可能起重要作用。

OXTR可逆转高脂饮食引起的胃黏膜增生
已知高脂饮食会导致胃黏膜增生，并是胃癌的风险因素。由于OXTR信号传导的丧失会导致胃黏膜增生，而OXTR治疗可改善SD喂养的OXTR缺失小鼠的增生（图1B和1C），因此研究了OXTR/OXTR信号传导在胃黏膜增生中的作用。与先前报道的十二指肠和小肠的变化类似，喂食HFD的wt小鼠胃黏膜厚度也增加（384.6 ± 30.9 μm），而SD喂养对照组为257.5 ± 10.9 μm（图2A和2B）。然而，皮下注射OXTR联合高脂饮食具有保护作用，显著降低了胃黏膜厚度（259.9 ± 9.4 μm）（图2A和2B）。

图2 OXTR激活可逆转高脂饮食引起的胃黏膜重塑
(A) SD喂养的wt小鼠和OXT处理的OXTR缺失小鼠的胃黏膜H&E染色。比例尺，100 μm。
(B) 各组胃黏膜厚度。n (小鼠) = 6、7、8、6、8，从左到右。?p < 0.05 和 ??p < 0.01，单因素ANOVA后进行Holm多重范围检验。
(C) wt小鼠和OXTR缺失小鼠的H+, K+-ATPase的共聚焦图像：SD、HFD对照组、OXT处理组。比例尺，50 μm。下部图示为虚线方框区域的放大图。比例尺，10 μm。
(D) 壁细胞面积占总黏膜面积的百分比。n (小鼠) = 7、7、4、6、4，从左到右。?p < 0.05，无显著性，双因素ANOVA后进行Holm多重范围检验。
(E) 壁细胞大小。n (小鼠) = 6、6、4、6、4，从左到右。??p < 0.01，无显著性，双因素ANOVA后进行Holm多重范围检验。
(F) 壁细胞中的H+, K+-ATPase荧光强度。n (小鼠) = 6、6、4、6、4，从左到右。??p < 0.01，无显著性，双因素ANOVA后进行Holm多重范围检验。SD对照组的平均壁细胞大小和H+,K+-ATPase荧光强度设为100%。所有数据以平均值±SEM显示。
确认OXTR的保护作用是通过OXTR信号传导实现的，因为向OXTR缺失小鼠注射OXTR后增生并未逆转，并且SD喂养的OXTR缺失小鼠、HFD喂养的OXTR缺失小鼠和HFD喂养的OXTR缺失+OXTR小鼠之间的胃黏膜厚度没有差异（SD喂养的OXTR缺失小鼠：366.7 ± 9.4 μm，HFD喂养的OXTR缺失小鼠：334.2 ± 7.1 μm，HFD喂养的OXTR缺失+OXTR小鼠：339.7 ± 18.0 μm）（图2A和2B）。此外，胃黏膜组织的分析显示，HFD或OXTR丧失会导致壁细胞面积、壁细胞大小和H+,K+-ATPase表达下降，而OXTR与wt小鼠共同注射可以减轻HFD的负面影响（图2C–2F）。根据迄今为止呈现的数据，OXT的给药在喂食高脂饮食（HFD）且OXTR基因缺失的小鼠中没有保护作用（见图2C–2F，橙色与深紫色条形对比）。这些发现共同表明，OXT治疗能够逆转壁细胞的萎缩，使H+、K+-ATPase的表达恢复正常，并以OXTR依赖的方式抑制HFD喂养小鼠胃黏膜的增生。野生型（wt）和OXTR/OXT基因缺失小鼠的胃黏膜低倍图像见图S2。结果表明，胃黏膜增生是由HFD、OXTR缺乏和OXT缺乏引起的。为了确定在OXT缺失或HFD条件下观察到的黏膜增厚的负责细胞类型，进行了双免疫染色，检测增殖标志物（Ki67）和泌酸细胞的标志物（MUC5AC）。如图S3所示，在HFD、OXTR缺失和OXTR缺失小鼠中，大多数Ki67阳性的细胞也呈MUC5AC阳性。与喂食标准饮食（SD）的野生型小鼠相比，野生型HFD、OXTR缺失和OXTR缺失小鼠中MUC5AC阳性细胞在Ki67阳性细胞中的比例显著增加。这些结果表明，在HFD条件下或缺乏OXTR信号的情况下，大多数增殖细胞可能会分化为泌酸细胞。

ORF（Open Reading Frame）编码的蛋白质在某些上下文中可能指的是“OXT”，即一种激素样肽的分子。根据提供的信息，OXT确实具有调节胃黏膜功能和酸分泌的作用。以下是翻译后的中文文本：

根据目前的数据，OXT治疗对喂食高脂饮食（HFD）且OXTR基因缺失的小鼠没有保护作用（见图2C–2F，橙色与深紫色条形对比）。这些发现共同表明，OXT治疗可以逆转壁细胞的萎缩，使H+、K+-ATPase的表达恢复正常，并以OXTR依赖的方式抑制HFD喂养小鼠胃黏膜的增生。野生型（wt）和OXTR/OXT基因缺失小鼠的胃黏膜低倍图像见图S2。结果表明，胃黏膜增生是由高脂饮食（HFD）、OXTR缺乏和OXT缺乏引起的。为了确定在OXT缺失或HFD条件下观察到的黏膜增厚的负责细胞类型，进行了双免疫染色，检测增殖标志物（Ki67）和泌酸细胞的标志物（MUC5AC）。如图S3所示，在HFD、OXTR缺失和OXTR缺失小鼠中，大多数Ki67阳性的细胞也呈MUC5AC阳性。与喂食标准饮食（SD）的野生型小鼠相比，野生型HFD、OXTR缺失和OXTR缺失小鼠中MUC5AC阳性细胞在Ki67阳性细胞中的比例显著增加。这些结果表明，在HFD条件下或缺乏OXTR信号的情况下，大多数增殖细胞可能会分化为泌酸细胞。

先前的研究表明，在肥胖大鼠和小鼠模型中，腹部脂肪和下丘脑的ORF表达增加。为了研究胃黏膜中ORF的表达情况，对喂食高脂饮食的小鼠和人类的胃样本进行了组织学分析。八周的高脂饮食使野生型小鼠的体重（BW）增加（标准饮食：29.1 ± 0.9克，高脂饮食：43.5 ± 2.1克，p < 0.01，非配对t检验）。在标准饮食和高脂饮食小鼠的胃黏膜中观察到强烈的ORF染色（见图3A）。使用从OXTR基因缺失小鼠中提取的胃组织确认了ORF抗体的特异性，该组织中未检测到ORF信号（见图S4）。图3B显示了单个小鼠壁细胞中ORF荧光的强度。各组壁细胞中ORF荧光的平均强度显示，高脂饮食小鼠的ORF荧光强度显著高于标准饮食小鼠（见图3C）。通过qRT-PCR检测ORF mRNA的表达，发现高脂饮食小鼠胃黏膜中的ORF mRNA表达也比标准饮食小鼠增加了1.7倍（见图3D）。八周的高脂饮食未改变野生型小鼠的血浆ORF水平（见图3E）或下丘脑的ORF mRNA表达（见图3F）。然而，在高脂饮食小鼠的胃黏膜和肝脏中，已知能切割或降解多种酶（包括ORF）的胰岛素响应性氨基肽酶（IRAP）的mRNA表达显著增加（见图3G和图S5）。

图3显示，在小鼠和人类中，胃黏膜中的ORF表达与体重（BW）呈正相关。全图说明：(A) 标准饮食（SD）和高脂饮食（HFD）喂养的野生型小鼠胃黏膜的核DAPI、ORF、H+、K+-ATPase的代表性共聚焦图像及其合并图像。刻度尺，10 μm。(B) 每个壁细胞中ORF荧光的强度。SD组，n（小鼠）= 5；HFD组，n（小鼠）= 6。(C) SD组和HFD组壁细胞中ORF荧光的平均强度。SD组的ORF荧光平均强度设为“1.0”。n（小鼠）= 5，6。***p < 0.01，非配对t检验。(D) 标准饮食和HFD喂养小鼠胃黏膜中ORF mRNA相对于GAPDH的相对表达。SD组的ORF mRNA平均表达设为“1.0”。n（小鼠）= 6，6。*p < 0.05，非配对t检验。(E) 标准饮食和HFD组血浆中的ORF水平。n（小鼠）= 6，6。非配对t检验。(F) 标准饮食和HFD组下丘脑中ORF mRNA相对于GAPDH的相对表达。n（小鼠）= 4，4。非配对t检验。(G) 胃黏膜中IRAP（ORF降解酶）mRNA相对于GAPDH的相对表达。n（小鼠）= 6，5。*p < 0.05，非配对t检验。所有数据显示为平均值 ± 标准误差（SEM）。

图3还显示，在人类胃黏膜中观察到了ORF的表达，这与小鼠中的情况相似。与小鼠胃黏膜的发现类似，在肥胖者（BMI = 37.1）中观察到比瘦者（BMI = 18.9）更强的ORF染色（见图3H）。图3I绘制了27个人类样本中H+、K+-ATPase阳性细胞中ORF荧光的强度。当所有样本的平均ORF强度以BMI最低的样本（16.5）进行归一化后，发现人类中随着BMI的增加ORF表达也显著增加（见图3J），并且壁细胞中ORF表达的平均强度与BMI呈正相关（r2 = 0.26，p < 0.01）。这些数据表明，在肥胖情况下，小鼠和人类的胃黏膜中的ORF表达均增加，这与在脂肪组织和脑组织中观察到的情况类似。

ORF还能增加壁细胞中的胞质Ca2+浓度和酸分泌。壁细胞通过胞质Ca2+依赖性将H+、K+-ATPase插入分泌膜中来酸化胃部。胞质[Ca2+]i的水平受多种刺激性和抑制性G蛋白偶联受体（GPCRs）的控制。为了明确ORF信号传导在壁细胞中的作用，使用Fura-2AM可视化了分离的壁细胞中胞质Ca2+浓度[Ca2+]i的变化（见图4A）。添加OXT后，在所有测试浓度（10–9 M、10–8 M和10–7 M）下，胞质[Ca2+]i的瞬变均可逆增加（见图4C–4E），与对照组（图4B）相比（对照组：0.17 ± 0.01；10–9 M OXT：0.43 ± 0.08；10–8 M OXT：0.54 ± 0.07；10–7 M OXT：0.47 ± 0.07）。响应OXT添加的胞质[Ca2+]i瞬变的幅度显著高于对照组，但无明显剂量依赖性（见图4F）。此外，在已知能抑制内质网释放Ca2+的thapsigargin存在下，仍可检测到OXT依赖性的胞质[Ca2+]i增加，进一步证实了OXT激活导致内质网中的Ca2+释放增加（见图4G和4H）。

图4显示，OXT增加了壁细胞中的胞质Ca2+和酸分泌。全图说明：(A) 分离的壁细胞（红色）在Ca2+成像、固定和免疫细胞化学染色H+、K+-ATPase后的代表性图像。刻度尺，10 μm。(B–E) 对于(B) KRB对照组、(C) 10–9 M OXT、(D) 10–8 M OXT和(E) 10–7 M OXT处理的代表性Ca2+响应。(F) 每种处理引发的[Ca2+]i峰瞬变的幅度。n（细胞）= 151、27、63、47，分别来自12只小鼠。***p < 0.01，单因素方差分析后进行Holm的多范围检验。(G) 在thapsigargin（10–6 M）存在下，ORF（10–8 M）处理的代表性Ca2+响应。(H) 有无thapsigargin时，ORF处理引发的[Ca2+]i峰瞬变的幅度。左列（10–8 M OXT）的数据与图4F（10–8 M OXT）的数据相同。n（细胞）= 63（来自5只小鼠），38（来自3只小鼠）。***p < 0.01，非配对t检验。(I–L) 壁细胞对10–8 M OXT和10–8 M胃泌素处理的代表性Ca2+瞬变。(J) ± OXTR缺失小鼠中[Ca2+]i瞬变的幅度。n（细胞）= 153（来自3只野生型小鼠），59（来自4只OXTR缺失小鼠）。***p < 0.01，单因素方差分析后进行Holm的多范围检验。(M) 经腹腔注射（IP）OXT（1000 μg/kg）后，野生型小鼠和OXTR缺失小鼠整个胃的酸输出量。n（小鼠）= 3（野生型），3（OXTR缺失）。*p < 0.05，双因素重复测量方差分析后进行Sidak的多范围检验。(N) 10–60分钟内的曲线下面积（AUC），计算得出：野生型小鼠：140.2 ± 17.5 μEq；OXTR缺失小鼠：86.4 ± 7.1 μEq。*p < 0.05，非配对t检验。作为阳性对照，应用10–8 M OXT和10–8 M胃泌素时也检测到类似的Ca2+响应（见图4I和4J）。为了明确确认ORF的参与，我们发现向OXTR缺失小鼠分离的壁细胞添加OXT未能引起显著的[Ca2+]i增加（见图4K和4L），而胃泌素介导的信号级联反应保持完整（见图4K和4L）。

为了确定ORF激活是否在壁细胞的酸分泌中起直接作用，接下来我们检查了整个胃的酸输出量。腹腔注射OXT后50分钟，野生型小鼠的酸输出量显著增加，而OXTR缺失小鼠则没有（见图4M）。比较10至60分钟内的酸输出量曲线下面积（AUC），OXTR缺失小鼠的AUC显著低于野生型小鼠（见图4N）。综合这些结果表明，ORF在壁细胞中的激活通过增加胞质[Ca2+]i来促进胃酸的分泌。

由于壁细胞功能似乎受到高脂饮食的影响，并且这些细胞高度依赖葡萄糖进行ATP依赖性的酸分泌，我们研究了OXT对胃中葡萄糖摄取的影响。图S6显示了SD喂养和HFD喂养小鼠在九天OXT处理期间的体重变化和热量摄入情况。与标准饮食喂养或标准饮食加上九天OXT皮下治疗的小鼠相比，喂食HFD八周的小鼠胃对18F-FDG的摄取显著降低（标准饮食：4.2 ± 0.5 ID/g；SD OXT：4.6 ± 0.3 ID/g；HFD对照：1.9 ± 0.2 ID/g，见图5A–5C和5E）。这强烈表明高脂饮食改变了胃的代谢。重要的是，在接受皮下OXT治疗的HFD喂养小鼠中，18F-FDG的摄取恢复到标准饮食小鼠的水平（HFD OXT：4.3 ± 0.7 ID/g，见图2D和2E）。这些数据表明，OXT治疗可以防止高脂饮食引起的代谢紊乱，并维持HFD喂养小鼠的胃葡萄糖摄取，类似于标准饮食小鼠。

图5显示，OXT增加了胃对葡萄糖的摄取。全图说明：(A–D) 标准饮食（SD对照）、(B) 标准饮食加OXT治疗、(C) HFD对照和(D) HFD加OXT治疗的代表性PET/CT图像。虚线圆圈表示胃的位置。SUVmax（最大标准化摄取值）的值显示在每张图像中。R表示右侧；L表示左侧。(E) 胃对18F-FDG的摄取（表示为每克组织的注射剂量百分比；%ID/g），在标准饮食对照（n（小鼠）= 4）、SD OXT（n（小鼠）= 4）、HFD对照（n（小鼠）= 5）和HFD OXT组（n（小鼠）= 5）静脉注射18F-FDG后60分钟。*p < 0.05，双因素方差分析后进行Holm的多范围检验。(F) 标准饮食对照（左列）、HFD对照（中列）和HFD OXT组（右列）中pAMPK（上图）、H+、K+-ATPase（中图）的代表性共聚焦图像及其合并图像；刻度尺，50 μm。下方的插图代表虚线方框区域的放大图像；刻度尺，10 μm。(G) 从共聚焦图像分析的壁细胞中pAMPK的强度（n（小鼠）= 5每组）。*p < 0.05，单因素方差分析后进行Holm的多范围检验。SD对照组的平均pMAPK荧光强度被设定为100%。(H) 西部印迹显示了各组胃黏膜中pAMPK（上图）、AMPKα（中图）和GAPDH（下图）的表达情况。(I) 通过西部印迹分析胃黏膜中pAMPK表达相对于AMPKα加载控制的比值。(J) AMPKα表达相对于GAPDH的比值。?p < 0.05，单因素方差分析后进行Holm多重范围检验。n（小鼠）= 3, 4, 4。所有数据以平均值±SEM显示。已知葡萄糖摄取受到AMPK磷酸化的刺激，后者产生ATP。因此，我们接下来研究了OXT处理对喂食标准饮食（SD）或高脂肪饮食（HFD）的小鼠胃黏膜中AMPK磷酸化的影响。结果表明，pAMPK的荧光强度与饮食无关（图5F）。然而，HFD OXT组的pAMPK荧光强度显著高于SD或HFD对照组（SD对照：100.0 ± 1.7%，HFD对照：102.3 ± 1.9%，HFD OXT：122.0 ± 4.6%，图5G）。Western印迹分析显示，HFD OXT组的pAMPK相对表达显著高于SD和HFD对照组（图5H–5J）。为了研究AMPK磷酸化是否依赖于OXTR，我们还检查了OXT对OXTR缺失小鼠中pAMPK水平的影响。与之前的数据一致，缺乏活性的OXTR消除了OXT处理的恢复效果。与SD对照小鼠相比，无论是喂食HFD与否，OXTR缺失小鼠的pAMPK/GAPDH或pAMPK/AMPKα表达水平没有显著差异（图S7A–S7C）。这些结果表明OXTR信号通路参与了胃黏膜中AMPK的磷酸化。然而，本研究中使用的全基因敲除（KO）小鼠模型并不能排除其他中枢调节因素（如传出迷走神经）的作用。因此，我们接下来研究了OXT对SD喂养野生型（wt）小鼠分离出的胃黏膜中AMPK磷酸化状态的直接影响。OXT处理1小时后，胃黏膜中pAMPK的荧光强度显著增加（图6上，B）。然而，在OXTR缺失小鼠分离出的胃黏膜中，OXT处理并未改变pAMPK的荧光强度（图6下，B）。在喂食HFD的wt小鼠的胃黏膜中，使用AMPK激活剂AICAR和AMPK抑制剂化合物C作为阳性及阴性对照（图S8A和S8B）。在喂食HFD的wt小鼠分离出的胃黏膜中，预先用化合物C处理可以抑制OXT处理诱导的pAMPK表达增加（图6C和6D）。

OXT通过OXTR信号通路在胃黏膜中的AMPK中发挥作用

(A) 从SD喂养的wt小鼠和OXTR缺失小鼠中分离出胃黏膜细胞。在胃腺分离过程中，每只小鼠制备两个平板用于配对实验。刻度尺，10 μm。
(B) 相对pAMPK荧光强度。wt对照组的平均pAMPK荧光强度被设定为“100%”。n（平板）= 4个wt小鼠和4个OXTR缺失小鼠。??p < 0.01，NS，不显著。双因素方差分析后进行Holm多重范围检验。
(C) 从喂食8周HFD的wt小鼠中分离出胃黏膜细胞（n = 5）。玻璃底培养皿分为4组：对照组、OXT（10–8 M）、化合物C（10 μM）和化合物C + OXT。化合物C在OXT处理前30分钟加入。OXT处理时间为60分钟。刻度尺，10 μm。
(D) 相对pAMPK荧光强度。所有数据以平均值±SEM显示。对照组（无OXT和化合物C培养基）的平均pAMPK荧光强度被设定为“100%”。n（平板）= 每组5只小鼠。?p < 0.05，??p < 0.01，NS，不显著。双因素方差分析后进行Holm多重范围检验。

综合这些数据提供了有力证据，表明OXTR信号通路通过直接作用于胃黏膜中的AMPK磷酸化，在维持胃黏膜完整性和葡萄糖稳态中起着重要作用。

OXT处理可恢复HFD后胃黏膜中的COX4表达

由于线粒体在葡萄糖利用和ATP生成中起核心作用，接下来我们研究了皮下注射OXT九天后胃黏膜中线粒体标志物细胞色素c氧化酶多肽IV（COX4）的分布和表达情况。组织学分析显示，SD喂养对照小鼠的整个胃黏膜中COX4表达丰富（图7A），但与SD喂养对照组小鼠相比，HFD喂养小鼠的荧光强度降低（76.6 ± 3.4%，图7B）。SD喂养并接受OXT处理的小鼠的COX4分布和表达水平与SD对照组相似（图7A和7B）。重要的是，OXT处理使HFD喂养小鼠的COX4表达水平恢复到SD对照组的96.4 ± 6.5%（图7A和7B）。同样，Western印迹分析显示HFD会导致COX4表达降低，但OXT处理使胃黏膜中的COX4表达恢复到SD对照组水平（图7C和7D）。与图2中显示的肠道重塑结果类似，OXT对SD喂养小鼠没有显著影响（图7C和7D）。图S9A还展示了胃黏膜中的LGR5表达情况。与图2中的肠道重塑结果类似，HFD组中的LGR5表达增加，但OXT处理显著降低了LGR5表达（图S9B）。

OXT处理可以恢复HFD后胃黏膜中的COX4表达

(A) SD对照、SD OXT、HFD对照和HFD OXT组的COX4、H+-ATPase的代表性共聚焦图像及合并图像。刻度尺，50 μm。下方插图显示白色箭头所示区域的放大图。刻度尺，10 μm。
(B) 从共聚焦图像中分析的胃黏膜细胞中的COX4荧光强度。n（小鼠）= 每组9、10、8、8。SD对照组的平均COX4荧光强度被设定为100%。?p < 0.05，NS，不显著。双因素方差分析，Holm多重范围检验。
(C) SD（上）和HFD（下）喂养小鼠胃黏膜中COX4表达的免疫印迹。
(D) 通过Western印迹分析，相对于GAPDH（35 kDa）加载控制的胃黏膜中的COX4表达（17 kDa）。n（小鼠）= 每组5。??p < 0.01，双因素方差分析后进行Holm多重范围检验。
(E) wt SD对照、wt HFD对照、wt HFD OXT、OXTR缺失SD对照、OXTR缺失HFD对照和OXTR缺失HFD OXT组的COX4代表性共聚焦图像。刻度尺，50 μm。下方插图显示虚线方框内区域的放大图。刻度尺，10 μm。
(F) 从共聚焦图像中分析的胃黏膜细胞中的COX4荧光强度（n（小鼠）= 从左到右每组5、6、6、6、5）。?p < 0.05，??p < 0.01，NS，不显著。双因素方差分析后进行Holm多重范围检验。
(G和H) 各组胃黏膜中COX4表达的Western印迹。G和H组使用的是相同的样本。
(I和J) 通过Western印迹分别分析胃黏膜中COX4表达（17 kDa）相对于GAPDH（35 kDa）加载控制的情况。n（小鼠）= 从左到右每组3、4、4。?p < 0.05，单因素方差分析后进行Holm多重范围检验。所有数据以平均值±SEM显示。

与之前一样，我们使用OXTR缺失小鼠确认了OXT处理对胃黏膜中COX4表达的影响是通过OXTR介导的信号通路实现的。HFD喂养的wt小鼠和OXTR缺失小鼠的COX4荧光强度均降低，而OXT处理可以在wt小鼠中逆转这一现象，但在OXTR缺失小鼠中则没有（图7E和7F）。Western印迹分析也得出了类似的结果，即OXT可以逆转HFD喂养wt小鼠胃黏膜中COX4蛋白的表达降低，但在OXTR缺失小鼠中这一效应不存在（图7G–7J）。与图2中的肠道重塑结果类似，OXTR缺失组和OXTR缺失+OXT组之间的胃黏膜LGR5表达水平没有显著差异（图S9C和S9D）。

OXT改善了胃黏膜中胃黏膜细胞的线粒体超微结构

在确定OXT处理能增强HFD期间胃黏膜中线粒体标志物COX4的表达后，我们使用电子显微镜研究了OXT处理对线粒体超微结构的影响。无论是喂食SD还是接受OXT处理的小鼠，其线粒体都呈光滑圆形，含有紧密排列的嵴和致密的基质（图8A、8B、8E和8F）。相比之下，HFD喂养小鼠的线粒体膨胀，嵴排列紊乱，基质密度降低（图8C和8G），而OXT处理可以逆转这一现象（图8D和8H）。HFD对照组中异常线粒体的比例（33.4 ± 5.7%）显著高于其他三组：SD对照组为7.1 ± 3.0%；SD + OXT组为10.7 ± 2.1%；HFD + OXT组为17.3 ± 2.6%（见STAR方法中的计算）。因此，这些数据直接证明了OXT处理改善了HFD喂养小鼠胃黏膜细胞的线粒体超微结构，并证实了OXTR介导的信号通路在应对HFD挑战时维持线粒体完整性中的作用。

OXT处理可以逆转HFD引起的胃黏膜线粒体损伤

(A–D) （A）SD对照、(B) SD OXT、(C) HFD对照和(D) HFD OXT组胃黏膜细胞的代表性透射电子显微照片。刻度尺，1 μm。
(E–H) 分别放大A-D中虚线方框内的区域。箭头指示异常的线粒体超微结构。刻度尺，1 μm。
(I) 异常线粒体占总线粒体的百分比。n（小鼠）= 从左到右每组4、5、5。?p < 0.05和??p < 0.01，双因素方差分析后进行Holm多重范围检验。数据以平均值±SEM显示。

尽管关于小肠和结肠重塑的机制已有许多了解，但胃对饮食内容的反应尚不明确。在这项研究中，我们发现与之前报道的小肠和结肠类似，HFD也会引起胃黏膜的重塑和增生。我们首次报告了两项重要发现：1. OXTR信号通路对于正常的胃上皮稳态至关重要，功能性OXTR或其配体OXT的缺失会导致饮食独立的增生；这种增生可能在断奶后发生；2. OXTR在胃黏膜细胞中表达，并在调节胃酸分泌中起关键作用。此外，无论是在小鼠中还是肥胖人类受试者中，HFD喂养后胃黏膜细胞中的OXTR表达均增加。在小鼠中，皮下注射OXT可以保护胃黏膜细胞免受HFD的损害。重要的是，在缺乏功能性OXTR的小鼠中，OXT与HFD联合使用时的保护作用不存在。此外，我们的发现表明，OXTR在胃黏膜细胞中的特异性表达对于恢复线粒体完整性至关重要，从而支持了整体胃黏膜健康的维持。这与先前的研究结果一致，表明胃黏膜细胞在保持胃健康中起着关键作用。

这里的结果表明，与HFD小鼠类似，OXTR缺失小鼠和OXTR小鼠都表现出胃黏膜增生，同时LGR5表达（一种干细胞增殖标志物）和分化为胃泌酸细胞的细胞水平也增加，且这种变化与饮食无关（图1和S3）。这些数据揭示了OXTR信号通路在调节胃黏膜增殖和分化中的新作用。此外，与HFD联合使用OXT可以防止HFD引起的增生并增加LGR5表达。根据基于人口的癌症登记（PBCR）和世界卫生组织死亡率数据库，胃癌是癌症患者最常见的死亡原因之一，2020年记录有769,000例患者死亡。HFD引起的胃炎和慢性炎症与癌前病变之间存在关联。胃黏膜的慢性炎症会导致壁细胞丢失，并诱导癌前病变，从而增加患胃癌的风险。因此，壁细胞中的OXTR信号传导成为预防胃部癌前病变的新的潜在靶点。关于OXTR或其受体OXTR在胃黏膜中的作用知之甚少，据我们所知，此前尚未有报道表明壁细胞中存在OXTR的表达。在这里，我们发现OXTR在小鼠和人类的壁细胞中都有特异性表达，这提示OXTR在酸分泌中起着重要作用。这一作用通过将OXTR施用于正常小鼠的壁细胞后观察到[Ca2+]i的增加得到了证实，而在OXTR敲除小鼠中则没有这种现象。进一步在体内实验中也确认了OXTR信号传导在酸分泌中的直接作用：IP注射OXTR能使对照组的小鼠酸分泌量翻倍，但在OXTR敲除小鼠中则没有这种效果。壁细胞对HCl分泌的严格调控对于平衡食物消化以及防止对周围胃和十二指肠组织的损伤至关重要，这种调控是由H+, K+-ATP酶的活动实现的，该酶将细胞质中的H+交换为细胞外的K+。HCl的分泌量通过多种激动剂和抑制剂控制在安全范围内，这些因素受到内在和外在神经内分泌系统的共同调控，详细内容见于 recent reviews。抑制性和刺激性GPCR信号通路在调控壁细胞分泌小管中H+, K+-ATP酶的插入过程中起着核心作用，但OXTR在刺激壁细胞分泌HCl中的作用则是全新的发现。哺乳动物（以及大多数物种）中都只存在一种OXTR，这种GPCR据报道可以通过与Gq或Gi偶联的信号通路调节多种Ca2+通道的活性，具体取决于组织类型和受体激活的时间。在壁细胞中，OXTR的激活似乎是通过Gq中介激活内质网中的Ca2+通道来增强[Ca2+]i和酸分泌的。

高脂肪饮食（HFD）中的游离脂肪酸（FFAs）已被证明会损害胃壁细胞的线粒体功能，导致细胞死亡和随后的增生。当检测HFD喂养小鼠胃部的葡萄糖摄取时，发现其显著减少（图5）。这种葡萄糖摄取的减少可能是由于脂毒性引起的，FFAs会损害线粒体功能，进而降低ATP的产生，加剧氧化应激，最终导致细胞死亡。与以往的研究一致，我们观察到HFD喂养小鼠的COX4表达下降（图7）和线粒体形态异常增加（图8），这些现象与高脂肪饮食引起的氧化应激相关的线粒体退化相符。由于壁细胞在提供H+离子以酸化胃液方面代谢活动非常活跃，它们特别依赖于功能正常的线粒体。在没有OXTR信号传导的情况下，胃黏膜中COX4表达的下降进一步证实了OXTR的保护作用（图S10）。尽管将OXTR的作用与线粒体调控联系起来的研究有限，但先前的研究表明OXTR通过OXTR/p-PKA/DRP1信号通路可以增强神经元中的线粒体功能。我们之前的研究还发现OXTR可以通过DNA去甲基化机制上调老年小鼠神经元中的COX4表达。然而，OXTR信号传导如何调节线粒体的生成和功能的具体机制仍有待进一步阐明。AMPK通过磷酸化激活是调控线粒体生成的基本步骤，确保细胞内线粒体的数量能够满足细胞的能量需求。缺乏AMPK或其上游激酶的小鼠表现出线粒体生成和葡萄糖摄取减少，这可能是由于AMPK通过PGC1α活性调节线粒体生成，而PGC1α是一种转录激活因子，通过与多个结合伴侣（包括PPARα和γ）相互作用来促进线粒体基因的表达。实际上，先前使用小鼠肌母细胞的研究发现OXTR给药可以通过OXTR-Ca2+-AMPK通路增加葡萄糖摄取。在这里，我们发现OXTR给药显著增强了正常小鼠胃黏膜和分离出的壁细胞中的细胞质Ca2+浓度和pAMPK表达，但在OXTR敲除小鼠中则没有这种效果。先前的研究显示OXTR激活通过Gq11诱导PLC激活，并通过IP3介导的机制触发内质网中的Ca2+释放。由此产生的细胞质Ca2+增加会激活CaMKII，后者直接在Thr172位点磷酸化并激活AMPKα。综上所述，我们的数据表明壁细胞中的AMPK磷酸化可能发生在OXTR-PLC-IP3-CAMKII信号传导级联之后。然而，这一途径是基于以往的研究和我们的细胞内Ca2+及pAMPK数据推断出来的，并未在此直接证明。CAMKII的确切作用需要通过使用CAMKII抑制剂在未来的研究中进一步验证。

值得注意的是，HFD小鼠中的OXTR表达增加，并且在人类中与BMI呈统计学上的正相关。这表明OXTR水平可能因高脂肪饮食或由此引起的线粒体损伤而上调作为补偿机制。早期研究报道肥胖、2型糖尿病和代谢综合征患者的血浆OXTR水平降低，以及肥胖大鼠中也观察到OXTR表达增加，这表明在配体浓度下降的情况下受体表达上调。然而，在本研究中，8周的高脂肪饮食增加了胃黏膜中的OXTR表达，但没有降低血浆OXTR水平。有趣的是，我们还观察到HFD喂养小鼠胃黏膜和肝脏中胰岛素反应性氨基肽酶（IRAP）的表达显著增加，这种酶能够切割或降解包括OXTR在内的多种酶。尽管Gajdosechova等人报告Zucker脂肪大鼠肝脏中IRAP mRNA表达增加，但我们的研究首次证明高脂肪饮食增加了胃黏膜中的IRAP表达。这些发现表明，在血浆OXTR浓度下降之前，外周组织（如肝脏和胃黏膜）中可能先发生了OXTR缺乏。鉴于壁细胞在提供胃酸化所需的H+离子方面具有高度代谢活性，它们特别依赖于功能正常的线粒体。此外，即使在缺乏OXTR信号传导的情况下，胃黏膜中COX4表达的下降也进一步证实了OXTR的保护作用（图S10）。尽管将OXTR的作用与线粒体调控联系起来的研究有限，但先前的研究已经证明OXTR通过OXTR/p-PKA/DRP1信号通路能增强神经元中的线粒体功能。我们自身的先前研究还揭示了OXTR通过DNA去甲基化机制上调老年小鼠神经元中的COX4表达。然而，OXTR信号传导如何调节线粒体生成和功能的精确机制仍需进一步阐明。

AMPK通过磷酸化启动是调控线粒体生成的基本步骤，确保任何给定细胞中的线粒体数量能够满足细胞的能量需求。缺乏AMPK或其上游激酶的小鼠表现出线粒体生成和葡萄糖摄取减少，这一过程可能是由于AMPK通过PGC1α活性调节线粒体生成，而PGC1α通过与多种结合伴侣（包括PPARα和γ）相互作用来促进线粒体基因表达。实际上，之前使用小鼠肌母细胞的研究发现OXTR给药可以通过OXTR-Ca2+-AMPK通路增加葡萄糖摄取。在这里，我们发现OXTR给药显著增强了正常小鼠胃黏膜和分离出的壁细胞中的细胞质Ca2+浓度和pAMPK表达，但在OXTR敲除小鼠中则没有这种效果。先前的工作表明OXTR激活通过Gq11诱导PLC激活，并通过IP3介导的机制触发内质网中的Ca2+释放。由此产生的细胞质Ca2+增加会激活CaMKII，后者直接在Thr172位点磷酸化并激活AMPKα。综合考虑，我们的数据表明壁细胞中的AMPK磷酸化可能发生在OXTR-PLC-IP3-CAMKII信号级联之后。不过，这一途径是基于先前发表的研究和我们的细胞内Ca2+及pAMPK数据推断出来的，并未在此直接证实。CAMKII的确切参与需要通过未来的研究使用CAMKII抑制剂来进一步验证。

值得注意的是，HFD小鼠中的OXTR表达增加，并且在人类中与BMI呈统计学上的正相关。因此，OXTR水平的升高可能是由于高脂肪饮食或由此引起的线粒体损伤作为补偿机制。早期研究报道肥胖、2型糖尿病和代谢综合征患者的血浆OXTR水平降低，以及肥胖大鼠中也观察到OXTR表达增加。然而，在本研究中，8周的高脂肪饮食增加了胃黏膜中的OXTR表达，但没有降低血浆OXTR水平。有趣的是，我们还观察到HFD喂养小鼠胃黏膜和肝脏中胰岛素反应性氨基肽酶（IRAP）的表达显著增加，这种酶能够切割或降解包括OXTR在内的多种酶。尽管Gajdosechova等人报告Zucker脂肪大鼠肝脏中IRAP mRNA表达增加，但我们的研究首次证明高脂肪饮食增加了胃黏膜中的IRAP表达。这些发现表明，在血浆OXTR浓度下降之前，外周组织（如肝脏和胃黏膜）中可能先出现了OXTR缺乏。尽管本研究中观察到的OXTR上调可能代表了器官特异性OXTR缺乏的补偿反应，但如果不测量胃黏膜中的实际OXTR含量，那么“IRAP升高导致局部微环境中活性OXTR减少”的观点仍只是一个假设。然而，我们的观察结果支持这一假设，即在标准饲料喂养的OXTR敲除和OXTR敲除小鼠中观察到了胃黏膜增生，而OXTR补充剂可以改善OXTR敲除小鼠的胃黏膜增生。此外，尽管HFD OXT组中的FDG摄取恢复到与标准饲料组相当的水平，但体重与HFD喂养对照组没有显著差异（图S6，HFD对照：42.8 ± 1.1 g，HFD OXT：40.6 ± 0.9 g，t = 1.54，df = 9，p = 0.16）。这一机制似乎与体重无关，表明OXTR信号传导在胃黏膜中的重要性。OXTR功能在胃黏膜中的重要性似乎不仅限于其消化功能。在出生后第14天（断奶前）比较WT、OXTR敲除和OXTR敲除小鼠的胃黏膜厚度时，未发现这三组之间存在显著差异（图S1）。因此，OXTR/OXTR敲除成年小鼠明显的胃黏膜增厚/增生可能是断奶后由固体食物摄入等因素引起的，需要进一步详细分析其确切的发育时间。这些观察结果支持OXTR信号传导在胃黏膜产后成熟中的重要性。

值得注意的是，在本研究中，OXTR处理仅增加了HFD喂养小鼠的葡萄糖摄取（图5）、COX4表达（图7）和LGR5阳性细胞（图S9），而对标准饲料喂养的小鼠没有影响。这与HFD喂养小鼠和肥胖人类样本中OXTR表达增加的结果一致。预计OXTR给药会对本研究中使用的动物的生理学产生广泛影响。监测标准饲料和HFD喂养小鼠的食物摄入量和体重变化显示，HFD喂养小鼠对OXTR处理的反应比标准饲料喂养小鼠更大（图S6）。因此，肥胖/BMI相关的OXTR表达水平变化可能增强了对外源性OXTR的敏感性。一个悬而未决的问题是体内内源性OXTR的来源。Pavlov已经证明壁细胞由迷走神经支配。尽管之前有报道在人类胃肠道的神经纤维和神经节中发现OXTR表达，但我们未能在正常小鼠或OXTR敲除小鼠的胃黏膜中检测到任何OXTR表达（图S11）。因此，胃部的内源性OXTR可能并非来自周围神经细胞（如周围神经节），而是来自胃部毛细血管床的内分泌循环。血浆OXTR并不完全来源于下丘脑的PVN和SON。先前的研究报道OXTR在多个外周器官（包括心脏、肾脏、肾上腺、睾丸和胃肠道）中合成和分泌。目前尚不清楚这些器官中合成的OXTR在多大程度上贡献于血浆水平或作用于胃部。然而，由于胃部酸分泌的空间和时间调控以及活性OXTR的不稳定性，这种激素可能难以在支配胃部的神经元中检测到，因此不应忽视OXTR的神经内分泌作用。此外，由于本研究中使用了全球OXTR敲除小鼠，不能排除本研究中观察到的OXTR对胃黏膜/壁细胞的一些效应是由中枢OXTR相关调控介导的。此外，先前的研究表明OXTR信号传导在小鼠小肠和结肠中具有保护作用，OXTR敲除动物通常表现出较短的绒毛和隐窝。目前尚不清楚胃黏膜中活性OXTR信号的丧失为何会导致增生——而OXTR给药可以逆转这种增生。这种组织特异性差异可能是由于神经网络结构的差异或与胃酸分泌改变相关的间接补偿机制。上述这些点建议使用可诱导的、特异性针对壁细胞的OXTR敲除小鼠模型进行进一步研究。

总之，本研究支持OXTR和OXTR信号传导可以通过维持壁细胞的线粒体完整性来保护胃部免受高脂肪饮食（HFD）的损害。胃部是食物进入肠道后的第一个接触点，HFD干扰胃部吸收葡萄糖和分泌酸的能力对超重和/或糖尿病患者以及由胃炎引起的癌前病变的管理策略具有重要意义。

本研究的局限性包括：首先，虽然使用了纯化的HFD用于HFD诱导的肥胖组，但标准饲料（SD）未经纯化，含有多种非营养成分。一般来说，未纯化的饲料中含有某些化学污染物，如重金属。已知重金属（如镉和砷）会影响胃黏膜的结构和功能。根据本研究的电子显微镜结果，标准饲料对照组中未观察到线粒体形态异常。未来应考虑使用纯化饲料作为对照组。其次，本研究中仅使用了雄性动物，因为雌激素已知能促进OXTR表达。为了最小化雌激素对OXTR表达的潜在混淆效应，本研究中仅使用了雄性动物。需要进一步研究雌性小鼠，以加强和扩展这项研究的结论。第三，本研究仅检测了高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠和OXTR/OXTR敲除（KO）小鼠中增殖细胞谱系中的干细胞标记物LGR5和陷窝细胞标记物MUC5AC。然而，仅这些上皮细胞谱系不足以解释增厚的胃黏膜的构成。未来的研究还应检测其他细胞谱系，如主细胞。

资料获取：
如需进一步信息和资源，请联系主要联系人Yuko Maejima（[e-mail]）。

材料获取：
本研究未生成新的独特试剂。

数据和代码获取：
本文分析的是现有的、公开可用的数据，可按照关键资源表中的描述进行访问。本研究未生成或使用任何原始代码。如需重新分析本文报告的数据，可联系主要联系人获取额外信息。

致谢：
作者感谢福岛医科大学的Rie Ohashi以及牛津大学转化胃肠病学和肝脏单元的生物库团队成员Ichata Boina、Shana-Lee Bownes、Kaye Eve-Rowe、Yukari Kimura、Jon Memish和Megan Perry的技术支持。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究资助（KAKENHI）项目（Grant-in-Aid for Scientific Research）的支持，项目编号为25K14793、22K11755、18K08483（Y. M）、23K08012（K. S）。

作者贡献：
概念化：Y.M.、K.S.和Hd.W.；
方法学：Y.M.、K.S.、Hd.W.、E.V.、S.H.、N.K.、S.W.和S.Z.；
调查：Y.M.、S.Y.、M.Y.、T.Y.、M.A.、T.O.、S.S.、D.N.、Y.T.、H.K.和S.Z.；
可视化：Y.M.、H.K.、S.Z.和Hd.W.；
资金获取：Y.M.和S.K.；
项目管理：Y.M.、K.S.和Hd.W.；
监督：K.S.、Hd.W.、S.W.和M.F.；
写作-初稿：Y.M.、K.S.和Hd.W.；
写作-审稿和编辑：K.S.、Hd.W.、E.V.和M.Y.

利益声明：
作者声明没有利益冲突。

STAR★
方法
关键资源表

**试剂或资源**
**来源**
**标识符**

**抗体**
兔GFP多克隆抗体：Thermo Fisher Scientific，Cat# A-6455；RRID：AB_221570
鼠H, K-ATPase单克隆抗体：MBL life science，Cat# DO31-3H
兔LGR5多克隆抗体：GeneTex，Cat# GTX130204；RRID：AB_2886205
兔OXTR多克隆抗体：Proteintech，Cat# 23045-1-AP；RRID：AB_2827425
兔COX4多克隆抗体：MBL life science，Cat# PM063
兔抗Phospho(p)-AMPKα (Thr172)单克隆抗体：Cell Singaling，Cat#2535；RRID：AB_331250
兔AMPK alpha多克隆抗体：Cell Singaling，Cat#2532；RRID：AB_330331
兔GAPDH多克隆抗体：GeneTex，Cat# GTX100188；RRID：AB_1080976
兔Ki-67单克隆抗体：Thermo Fisher Scientific，Cat# MA5-14520；RRID：AB_1097948
鼠抗Mucin 5AC单克隆抗体：abcam，Cat# ab3649；RRID：AB_2146844
兔抗催产素多克隆抗体：ImmunoStar，Cat#20068；RRID：AB_572258

**化学物质、肽和重组蛋白**
催产素：PEPTIDE INSTITUTE INC，Cat#4084-v
Thapsigargin：Sigma-Aldrich，Cat# T9033
AICAR：FUJIFILM，Cat#011–22533
化合物CS：Sigma-Aldrich，Cat# 866405–64-3
胃泌素：Phoenix Pharmaceuticals INC，Cat#027–05
伊诺霉素：Sigma-Aldrich，Cat#I0634

**实验模型**
C57BL/6J小鼠：日本SLC
C57BL/6JmsSlcoxtr：Yoshida等人
OxtrVenusΔNeo/+小鼠：Yoshida等人
OXT空模型小鼠：Nishimori等人
OXTR KO小鼠：Takayanagi等人

**寡核苷酸**
催产素引物：Fw: CCTACAGCGGATCTCAGACTGA, Rev: TCAGAGCCAGTAAGCCAAGCAT
IRAP引物：Fw: CAAAGACCGAGCCAACCTGATC, Rev: (GCTAAAGAGGAACAACCAGCC
催产素受体引物：Fw: GCACGGGTCAGTAGTGTCAA, Rev: AAGCTTCTTTGGGCGCATTG
GAPDH引物：Fw: TCCACTCACGGCAAATTCAACG, Rev: TAGACTCCACGACATACTCAGC

**软件和算法**
ImageJ：https://imagej.nih.gov/ij/GraphPad Prism 9
Dotmatics：https://www.graphpad.com/updates/prism-900-release-notes

**实验模型和参与者详情**
所有实验动物均为雄性。对照组为C57BL/6J小鼠，在整个研究中统称为“wt”（日本SLC，滨松）。杂合OXTR-Venus敲入小鼠（称为oxtrVenusΔNeo/+小鼠）在10周大时用于荧光可视化实验（此时视为完全成年），仅用于图1A。纯合OXTR-Venus敲入小鼠（oxtrVenusΔNeo/VenusΔNeo小鼠）缺乏活性OXTR表达，因此被称为OXTR空模型小鼠。这些小鼠的胃黏膜中缺乏活性OXTR表达得到了证实（图S12）。此外，还使用了先前描述的全球OXTR空模型小鼠系，该系通过删除编码催产素肽的外显子1利用胚胎干细胞技术生成。OXTR-Venus敲入小鼠和OXTR空模型小鼠系分别最初是在129/Ola × C57BL/6J或129SvEv × C57BL/6J背景下建立的，随后通过超过10代的回交回到C57BL/6J背景中以建立完全同系的品系。由于这些品系具有相同的C57BL/6J背景，因此从日本SLC购买了年龄和性别匹配的野生型C57BL/6J小鼠作为对照组，以确保实验组间的同步性。

动物饲养条件
动物采用12小时光照/黑暗周期（光照时间为07:00至19:00）。在饮食干预研究中，6周大的C57BL/6J小鼠分别喂食常规食物（SD）或高脂饮食（HFD，Clea，大阪）8周，并提供自由饮水，实验在14周开始，在16周时处死。6周大的OXTR空模型小鼠也喂食HFD8周，并在实验后16周处死。因此，用于研究胃黏膜功能和厚度的小鼠为相同年龄。各种成分的卡路里百分比如下：SD – 蛋白质20.5%，脂肪10.1%；HFD – 蛋白质20.1%，脂肪56.7%。样本量根据我们之前的研究确定，以确保具有足够的统计功效来检测有意义的生物学差异（1-β = 0.80，α = 0.05）。所有动物均随机分配到实验组。所有实验程序和动物护理均遵循相关指南和规定，并获得了福岛医科大学动物护理和使用委员会的批准（批准编号：2025016）。

**人类参与者**
本研究使用了27名男性和女性参与者（BMI：16.5–49.2，年龄：33–86岁）。参与者的详细信息见表S1。共有27名人类参与者参与了这项观察性研究，以评估BMI与OXTR表达水平之间的相关性。由于本研究旨在分析连续变量，因此未将受试者分配到实验组。样本量根据研究期间的样本可用性确定。在本研究中使用人类组织已获得伦理批准，符合英国《人类组织法》（Human Tissue Act 2004）或《苏格兰人类组织法》（Human Tissue (Scotland) Act 2006）的规定。

**胃黏膜的组织学分析**
SD喂养的wt小鼠、SD喂养的OTXR空模型小鼠和SD喂养的OXT空模型小鼠在给予OXTR后，用三种麻醉剂（0.03% medetomidine、0.04% midazolam和0.05% butorphanol tartrate）混合麻醉。小鼠用4% paraformaldehyde和0.2% picric acid灌注，然后取胃部组织。石蜡包埋的胃底切片用二甲苯脱蜡，并用hematoxylin和eosin（H & E）染色，通过光学显微镜图像评估胃黏膜的厚度（Olympus，东京，日本）。从每只小鼠的胃底切片中随机选取三个区域，这三个区域的平均值作为该小鼠的指标值。

**GFP和H+, K+-ATPase α亚基的双免疫染色**
oxtr VenusΔNeo/+小鼠用4% paraformaldehyde和0.2% picric acid灌注，然后取胃部组织。oxtr VenusΔNeo/+小鼠（n = 3）的石蜡包埋胃底切片用二甲苯脱蜡。切片在PBS（0.01 M，pH 7.4）中洗涤，然后与阻断溶液孵育1小时。接下来，切片与单克隆鼠抗H+, K+-ATPase α亚单位抗体（1:500，D031-3H，MBL，名古屋，日本）和兔抗GFP抗体（1:1000，A-6455，Thermo Fisher Scientific，MA）在4°C下孵育过夜。切片在PBS中洗涤，然后用含有2% BSA和5% Normal Goat Serum (NGS)的PBS与DyLight 594标记的抗鼠IgG（1:500，Thermo Fisher Scientific，MA）和Alexa 488标记的抗兔IgG（1:500，Thermo Fisher Scientific，MA）孵育30分钟。之后，切片在PBS中洗涤，并用含有DAPI（Vector Laboratories，CA）的封片介质覆盖。使用共聚焦激光扫描显微镜（FV10i；Olympus，东京，日本）获取GFP和H+, K+-ATPase α亚单位的荧光图像。

**LGR5的免疫染色**
SD喂养的wt小鼠、OXTR空模型小鼠、OXT空模型小鼠和OXT处理过的空模型小鼠的灌注方法如上所述。石蜡包埋的胃底切片用二甲苯脱蜡。为了回收LGR5抗原，切片在0.01M citrate缓冲液（pH6.0）中高压灭菌（120°C，5分钟）。为了消除自发荧光，所有切片用TrueBlack（#23007，Biotium，CA）预处理。切片在PBS（0.01 M，pH 7.4）中洗涤，然后与含有2% bovine serum albumin和5% normal goat serum的PBS孵育1小时。接下来，切片与兔多克隆抗LGR5抗体（1:1500，GTX130204，GeneTex，LA）在4°C下孵育过夜。切片在PBS中洗涤，并用含有DAPI（Vector Laboratories，CA）的封片介质覆盖。使用共聚焦激光扫描显微镜（FV10i；Olympus，东京，日本）在类似光照条件下获取LGR5的荧光图像，并分析每100 μm胃黏膜中的LGR5阳性区域面积。

**H+, K+-ATPase α亚单位的免疫染色**
SD喂养的wt小鼠、HFD喂养的wt小鼠、HFD喂养的OXT处理的wt小鼠、SD喂养的OXTR空模型小鼠、HFD喂养的OXTR空模型小鼠和HFD喂养的OXT处理的OXTR空模型小鼠的灌注方法如上所述。用TrueBlack处理的切片在PBS（0.01 M，pH 7.4）中洗涤，并与阻断溶液孵育1小时。接下来，切片与单克隆鼠抗H+, K+-ATPase α亚单位抗体（1:500，D031-3H，MBL，名古屋，日本）在4°C下孵育过夜。切片在PBS中洗涤，然后用含有DAPI（Vector Laboratories，CA）的封片介质覆盖。使用共聚焦激光扫描显微镜（FV10i；Olympus，东京，日本）在类似光照条件下获取H+, K+-ATPase α亚单位的荧光图像，并分析黏膜层中壁细胞的百分比、壁细胞大小和H+, K+-ATPase α亚单位的强度。这些分析使用NIH图像软件（ImageJ，National Institute of Health）进行。

**测量黏膜层中壁细胞面积**
从每只小鼠的三个共聚焦图像中分析胃黏膜和壁细胞的总体面积。这三个图像的平均值作为该小鼠的指标值。从每只小鼠的三个共聚焦图像中随机选取10–11个细胞，获取壁细胞（H+, K+-ATPase阳性细胞）的大小和强度。然后根据10–11个细胞的平均大小和强度进行处理。

**催产素的给小鼠注射**
SD喂养的wt小鼠、OXTR空模型小鼠和HFD喂养的wt小鼠在开始OXT处理前7天被转移到单独的笼子中。每天17:00在颈部背部皮下注射1,600 μg/kg/5 mL的OXT（Peptides institute，大阪，日本），持续9天，第10天按前述方法进行实验/采样。

**qRT-PCR方法：高脂饮食对胃黏膜中OXTR和IRAP mRNA表达以及下丘脑中OXTR mRNA表达的影响**
SD喂养和HFD喂养的wt小鼠在14周时被处死，取胃黏膜和大脑组织进行RNA处理。下丘脑（距离bregma 0.14 mm至?2.06 mm）组织在显微镜下解剖。使用RNeasy minikit（QIAGEN，Hilden，德国）和Monarch RNA Purification Columns（New England BioLabs Inc., MA）从胃黏膜和下丘脑中分离总RNA。cDNA合成试剂包括M-MLV（Thermo Fisher Scientific，MA）、RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor（Thermo Fisher Scientific，MA）和dNTP（Agilent Technologies，TX）。qRT-PCR使用TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus，Takara Bio Inc., Shiga，日本）进行。PCR程序如下：初始变性温度95°C 30秒，然后95°C 35 cycles 5秒，56°C 10秒，72°C 15秒。实时测量产物积累，并确定平均循环阈值。使用2ΔΔCT方法计算催产素受体（OXTR）mRNA的表达水平，并以管家基因GAPDH进行归一化。PCR引物如下：OXTR（GenBank:NM_001081147）：Fw (GCACGGGTCAGTAGTGTCAA)，Rev (AAGCTTCTTTGGGCGCATTG)，GAPDH（GenBank:NM_001289726）：Fw (TCCACTCACGGCAAATTCAACG)，Rev (TAGACTCCACGACATACTCAGC）。OXT（GenBank:NM_011025）：Fw (CCTACAGCGGATCTCAGACTGA)，Rev (TCAGAGCCAGTAAGCCAAGCA)。IRAP（GenBank: NM_172827）：正向引物（CAAAGACCGAGCCAACCTGATC），反向引物（GCTAAAGAGGAACAACCAGCC）。血浆OXT测量
从喂食标准饮食（SD）和喂食高脂饮食（HFD）的雄性小鼠中收集血液样本，分别放入含有EDTA和抑肽酶的试管中，并分离出血浆。在测量前，向上清液中加入0.1 M HCl，然后使用C18 Sep-Pak柱（Waters Co., MA）分离OXT，并用甲醇提取。OXT浓度通过OXT EIA试剂盒（ENZ-ADI900153A0001，Enzo Life Sciences/Assay Designs，NY）进行检测。实验内和实验间的变异范围分别为12.6–13.3%和11.8–20.9%。

小鼠和人类胃黏膜中OXTR和H+,K+-ATPase α亚基的双免疫染色
本研究中使用人类组织的伦理批准已在英国获得，并根据2004年《人类组织法》或2006年《苏格兰人类组织法》得到认可。参考编号：23-HdW-Protective role of Oxytocin, 21/YH/0206，由约克郡和亨伯河研究伦理委员会批准。

人类（BMI 16.5–49.2，n = 27）和 mice（SD喂养和HFD喂养，体重：29.14 ± 0.9 g，n = 5；HFD喂养，体重：43.5 ± 2.06 g，n = 6）的石蜡包埋胃体切片用二甲苯脱蜡，并用0.1% triton-X处理。洗涤并淬灭 Autofluorescence 后，将切片浸泡在PBS（0.01 M, pH 7.4）中1小时。随后，将切片与单克隆鼠抗H+,K+-ATPase α亚基抗体（1:500，D031-3H，MBL，名古屋，日本）和兔抗OXTR抗体（1:100，23045-1-AP，Proteintech，IL）在4°C下孵育过夜。OXTR抗体是由覆盖人类OXTR C末端区域的重组蛋白制备的。此抗体已通过siRNA介导的敲低技术在人类正常结肠上皮细胞系和结肠腺癌细胞系中验证其特异性。在本研究中，通过对OXTR null小鼠的胃黏膜进行染色也证实了该抗体的特异性，结果显示无可检测信号（图S4）。

将切片用PBS冲洗后，与DyLight 594标记的抗鼠IgG（1:500，Thermo Fisher Scientific，MA）和Alexa 488标记的兔抗鼠IgG（1:500，Thermo Fisher Scientific，MA）在封闭液中孵育40分钟。然后将切片用PBS冲洗，并覆盖含有DAPI（Vector Laboratories，CA）的封片液。在相似的光照条件下，使用共聚焦激光扫描显微镜（FV10i；Olympus，东京，日本）获取OXTR和H+,K+-ATPase α亚基的荧光图像。使用NIH图像软件（ImageJ，美国国立卫生研究院）分析H+,K+-ATPase α亚基阳性细胞中的OXTR荧光强度。

胃腺分离
按照先前的方法分离胃腺，并稍作修改。标准饮食喂养的野生型（wt）和OXTR null小鼠禁食过夜（16小时），并用三种麻醉剂混合物麻醉。通过脑脊腔灌注20 mL预热后的PBS（含有0.33 mM MgCl2和0.9 mM CaCl2，PBS+）。切除它们的胃部，然后用镊子从胃壁上刮取胃体和幽门腺组织。将刮取的组织样本在含有0.2% BSA、20 mM HEPES、1%庆大霉素（Medium A）和胶原酶类型1A（1 mg/mL：C9891，Sigma-Aldrich，MO）的D-MEM培养基中37°C下消化60分钟。消化后的样本通过40-μm过滤器过滤，并在200 g离心速度下离心5分钟。样品再用Medium A冲洗三次。分离出的腺体被接种在Matrigel包被的玻璃底板上，并在Medium A中孵育过夜。

分离的壁细胞中H+,K+-ATPase和pAMPK的双免疫染色
胃腺的分离方法如上所述。每只小鼠制备两到四个培养板；每个分组分为对照组和处理组。因此，所有实验均为来自4到5只小鼠的4–5对重复实验。过夜培养的壁细胞在含有10–8 M OXT的Medium A中孵育60分钟。在处理OXT之前30分钟，加入Compound C（10 μM；Sigma-Aldrich，CAS866405-64-3，MO）。用PBS冲洗后，细胞用4%福尔马林和0.2%苦味酸固定60分钟。之后，用PBS冲洗，再用2% BSA和5%正常山羊血清封闭60分钟。接着，在4°C下将细胞与单克隆鼠抗H+,K+-ATPase α亚基抗体（1:500，D0313，MBL，名古屋，日本）和单克隆兔抗Phospho(p)-AMPKα（Thr172）抗体（1:100，40H9，Cell Signaling，MA）孵育过夜。然后，用PBS冲洗，并在含有2% BSA和5% NGS的PBS中与DyLight 594标记的抗鼠IgG（1:500，Thermo Fisher Scientific，IL）和Alexa 488标记的兔抗兔IgG（1:500，Thermo Fisher Scientific，IL）孵育30分钟。最后，用PBS冲洗并将切片覆盖含有DAPI（Vector Laboratories，CA）的封片液。使用共聚焦激光扫描显微镜（FV10i；Olympus，东京，日本）获取OXTR和H+,K+-ATPase α亚基的荧光图像。使用NIH图像软件（ImageJ，美国国立卫生研究院）分析pAMPK的荧光强度。每个显微镜视野捕获10帧图像，仅测量H+,K+-ATPase阳性细胞中的pAMPK信号强度。计算每块板10个显微镜视野的细胞平均pAMPK荧光强度。

壁细胞中的Ca2+成像
过夜培养的壁细胞在CO2培养箱中用Fura-2AM（1 μM）处理30分钟。将壁细胞置于Ca2+成像腔室中，并以1 mL/min的速度用Krebs Ringer Bicarbonate缓冲液（KRB）灌注。用340 nm和380 nm交替光照射装有荧光染料的细胞，并捕获相应的荧光图像。通过Aquacosmos版本2.6（Hamamatsu Photonics，滨松，日本）生成F340/F380比率图像。通过从应用药物期间的峰值[Ca2+]i比率（3分钟平均值）减去刺激前的基础[Ca2+]i比率来计算[Ca2+]i响应的幅度。向分离的壁细胞施加10–9、10–8和10–7 M的OXT。OXTR在人类和啮齿动物中的Kd值通常为0.6 nM–1.0 nM。基于此Kd值，使用高10倍和100倍的浓度来诱导细胞内钙瞬变。在最终测量中，加入10–7 M胃泌素和10–6 M离子霉素以确认壁细胞的功能和存活情况。仅使用对胃泌素和离子霉素都有反应的细胞。为了研究OXT动员的胞质Ca2+的来源，使用了thapsigargin（T9033，Sigma-Aldrich，MO，一种SERCA泵抑制剂）。thapsigargin的浓度基于先前发表的数据。

整个胃的酸度测量
整个胃的酸度测量方法如前所述，并稍作修改。本实验使用了标准饮食喂养的野生型（wt）和OXTR null小鼠。禁食过夜的小鼠用异氟烷麻醉。在腹部做切口，暴露部分十二指肠。在十二指肠上做一个小切口，插入PE-50导管并环绕幽门打结。实验开始时，用温热的生理盐水多次冲洗胃部。通过导管注入400 μL生理盐水，并每10分钟收集一次样本。在收集20分钟后的样本后，通过腹腔注射给予1000 μg/kg的OXT。通过滴定法测量含有400 μL（10分钟内μEq）的酸输出。

18F-FDG的生物分布
本实验使用了标准饮食喂养和HFD喂养的野生型（wt）小鼠。在实验当天（从开始OXT注射起的第10天），禁食6小时后，注射生理盐水或OXT9天的小鼠（每组5–6只）用异氟烷麻醉，并在尾静脉注射7.4 MBq的18F-FDG。注射60分钟后，处死小鼠并取出胃部。使用伽马计数器（WIZARD 2480；PerkinElmer，美国）测定样本的放射性。18F-FDG的摄取量表示为每克组织的注射剂量百分比（%ID/g）。每组中的一只小鼠使用18F-FDG进行PET/CT成像。PET（10分钟）和CT（7分钟）成像使用小型动物PET/CT扫描仪（Inveon；Siemens Medical Solutions USA Inc.，田纳西州诺克斯维尔，美国）进行。图像通过傅里叶重排算法和带有奈奎斯特频率截止值的Ramp滤波器进行重建和校正。图像矩阵为128 × 128 × 159，得到体素大小为0.76 × 0.776 × 0.796 mm3。使用PET图像手动为每只小鼠的胃定义一个三维兴趣区域（ROI）。标准化摄取值（SUV）使用ROI内的最大像素计数计算，并根据注射剂量和小鼠体重进行归一化。SUVmax表示胃ROI内的最大SUV值。

H+,K+-ATPase和COX4的双免疫染色
标准饮食喂养和HFD喂养的野生型（wt）小鼠以及HFD喂养的OXTR null小鼠的灌注方法如上所述。石蜡包埋的胃底切片用二甲苯脱蜡。切片用PBS冲洗并加入0.1% triton-X处理。然后用封闭液孵育1小时，随后与单克隆鼠抗H+,K+-ATPase α亚基抗体（1:500，D031-3H，MBL，名古屋，日本）和兔多克隆抗COX4抗体（1:500，PM063，MBL，名古屋，日本）或单克隆兔抗Phospho(p)-AMPKα（Thr172）抗体（1:100，40H9，Cell Signaling，MA）在4°C下孵育过夜。接着用PBS冲洗切片，并在含有DAPI（Vector Laboratories，CA）的封闭液中与DyLight 594标记的抗鼠IgG（1:500，Thermo Fisher Scientific，MA）和Alexa 488标记的兔抗兔IgG（1:500，Thermo Fisher Scientific，IL）孵育30分钟。最后，用PBS冲洗切片，并覆盖含有DAPI（Vector Laboratories，CA）的封片液。使用共聚焦激光扫描显微镜（FV10i；Olympus，东京，日本）获取COX4、pAMPK的荧光图像。使用NIH图像软件（ImageJ，美国国立卫生研究院）分析COX4和pAMPK的荧光强度。从每个切片中随机选择三个区域，分别测量COX4和pAMPK的荧光强度。三个区域的平均荧光强度作为每只小鼠的数值。

Western blotting方法
本实验使用了标准饮食喂养和HFD喂养的野生型（wt）小鼠以及HFD喂养的OXTR null小鼠。这些小鼠已注射生理盐水或OXT9天，禁食6小时，并用三种麻醉剂混合物麻醉。切除它们的胃部，然后用镊子从胃壁上刮取胃体和幽门腺组织。将刮取的组织样本在含有50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1% Nonidet P-40、0.5%脱氧胆酸钠和0.1% SDS及1%蛋白酶抑制剂的放射性免疫沉淀缓冲液中消化60分钟。将此匀浆液在4°C下以12,000 g离心10分钟。收集上清液并测量蛋白质浓度。将样品溶于2 × SDS样品缓冲液中，并在95°C下煮沸5分钟。从样品中提取20–50 μg的总蛋白质，加载到4–20%梯度的聚丙烯酰胺凝胶（4561095，BIORAD，CA）上。样品在20 mA的电流下分离。蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上，持续60分钟。然后用含有0.05% Tween 20的PBS冲洗膜6次，并用5%脱脂奶在室温下封闭60分钟。接着，将膜与兔多克隆抗COX4抗体（1:1000，PM063，MBL，名古屋，日本）或单克隆兔抗Phospho(p)-AMPKα（Thr172）抗体（1:1000，40H9，Cell Signaling，MA）和兔多克隆抗GAPDH抗体（1:1000，GTX100118，GeneTex，CA）在4°C下孵育过夜。然后用PBS冲洗膜，并用含有DAPI（Vector Laboratories，CA）的封片液覆盖。使用共聚焦激光扫描显微镜（FV10i；Olympus，东京，日本）获取COX4、pAMPK的荧光图像。使用NIH图像软件（ImageJ，美国国立卫生研究院）分析COX4和pAMPK的荧光强度。从每个切片中随机选择三个区域，分别测量COX4和pAMPK的荧光强度。AICAR（一种AMPK激活剂，可刺激AMPK在Thr172位点的磷酸化，即pThr172）的IP给药方式与仅给予生理盐水的方案相比，导致蛋白质从62 kDa转变为75 kDa（见图S14，第4-6道泳道），这表明Thr172位的磷酸化程度增加，AMPK的活性也随之增强。因此，在本研究中，75 kDa的条带被视为pAMPK。

**透射电子显微镜观察**
本实验使用了喂食常规饮食（SD）和高脂饮食（HFD）的野生型小鼠。小鼠的心脏灌注液中含有4%的甲醛和0.2%的苦味酸（pH 7.4）。随后将胃部取出并切碎，再将其浸泡在2%的甲醛和2%的戊二醛溶液中，置于4°C下过夜处理。冲洗后，用1%的锇四氧化物和1.5%的铁氰化钾在4°C下进行后固定处理，持续2小时。之后将组织脱水并嵌入epon812树脂中。制备超薄切片（80纳米），并用醋酸铀和柠檬酸铅进行染色，然后用电子显微镜（JEM-1400，JEOL，日本东京）进行观察。

在每只小鼠的9-10个壁细胞中统计了具有正常或异常形态的线粒体数量。根据先前的研究，那些线粒体出现严重肿胀、嵴结构紊乱且基质密度降低的情况被视为形态异常的线粒体。从一个壁细胞中获取三个细胞质区域的图像，并取其平均值作为该壁细胞的数据。

**定量与统计分析**
所有数据均以平均值±标准误（SEM）的形式呈现。两组之间的统计比较采用学生t检验进行。对于多组间的比较，则使用单因素方差分析（ONEWAY ANOVA）或双因素方差分析（ TWOWAY ANOVA），随后进行Holm’s或Sidak’s多重比较检验。两组随时间的变化通过双因素重复测量方差分析（TWOWAY REPEATED MEASURES ANOVA）并进行Holm’s多重比较检验来分析。相关性通过皮尔逊相关系数（Pearson’s correlation coefficient）进行评估。所有统计分析均使用GraphPad Prism 9.0软件（GraphPad Software，美国加州圣地亚哥）完成。所有统计检验均为双尾检验，p值小于0.05视为具有统计学意义。各图中具体的p值汇总在表S2中。有关每项实验的统计检验方法及样本数量（动物和细胞数量）的详细信息，请参见相应图的图例。

**补充信息（3）**
下载全部内容：
- PDF文件（1.52 MB）：文档S1（包含图S1–S14及参考文献）
- 电子表格（9.55 KB）：表S1（人类参与者的详细信息：性别、年龄和BMI）
- 电子表格（23.47 KB）：表S2（各图的确切p值）
- A：图1C和2D的确切p值
- B：图2E–4N的确切p值
- C：图5E–8I的确切p值
- D：图S1B–S6的确切p值
- E：图S7B–S14的确切p值