黄芪来源外泌体通过抑制 SERPINE1/HIF-1α/NLRP3 介导的焦亡缓解创伤性脑损伤

《Behavioural Brain Research》：Astragalus membranaceus-derived exosomes alleviate traumatic brain injury by inhibiting SERPINE1/HIF-1α/NLRP3-mediated pyroptosis

　　

摘要

目的

细胞焦亡被认为是创伤性脑损伤（TBI）后继发性损伤的关键贡献因素，抑制细胞焦亡已被证明可以保护神经元完整性并改善神经系统预后。本研究旨在探讨黄芪（AM）来源的外泌体对TBI诱导的细胞焦亡的治疗效果，并阐明其潜在机制。

方法

通过蔗糖密度梯度超速离心法纯化AM来源的外泌体并对其进行表征。在受到划痕损伤的HT22神经元细胞和受控皮层冲击（CCI）小鼠TBI模型中评估AM来源外泌体对TBI的作用。通过组织病理学染色、神经功能严重度评分、抓握力测试和神经系统功能评估来评估神经预后。采用caspase-1和碘化丙啶（PI）染色后，通过流式细胞术检测细胞焦亡。使用NLRP3激活剂BMS-986299确定NLRP3的激活是否能逆转AM来源外泌体对细胞焦亡的抑制作用。

结果

AM来源的外泌体显著提高了细胞活力，减少了神经元焦亡和焦亡标志物（cleaved caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18），同时下调了SERPINE1、HIF-1α和NLRP3的表达。BMS-986299激活NLRP3部分消除了AM来源外泌体介导的抗焦亡作用。在体实验中，全身给予AM来源的外泌体可改善神经功能缺损、提高运动功能、减轻海马神经元丢失，并抑制SERPINE1/HIF-1α/NLRP3信号通路。AM来源的外泌体表现出优异的生物相容性和穿越血脑屏障的能力。

结论

本研究结果表明，AM来源的外泌体通过抑制SERPINE1/HIF-1α/NLRP3轴来抑制细胞焦亡并促进功能恢复，是治疗TBI的一种有前景的治疗策略。

引言

创伤性脑损伤（TBI）是指由外力（如交通事故、高处坠落及其他创伤事件）引起的脑损伤，是全球范围内导致死亡和长期致残的主要原因之一[1]。脑外伤后的认知功能障碍和意识障碍是TBI患者常见的临床表现，严重影响其日常生活、工作和社交互动[2]，[3]。TBI的病理过程复杂，既包括直接机械性损伤（原发性损伤），也包括随后的继发性损伤过程[4]。继发性损伤发生在原发性损伤后的数小时至数天内，其机制涉及多种复杂的病理过程[5]，[6]，[7]。炎症反应是TBI后继发性损伤的重要病理机制之一[8]。

细胞焦亡是一种炎症形式的程序性细胞死亡，在TBI的病理生理学中发挥着重要作用[9]。细胞焦亡由caspase-1介导，通过gasdermin D（GSDMD）执行，导致损伤相关分子模式（DAMPs）和白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）等促炎细胞因子的释放，从而放大神经炎症并加剧神经元丢失[10]，[11]。抑制细胞焦亡已被证明可以保护神经元并缓解实验性TBI模型中的神经功能缺损[12]，[13]。因此，鉴定能够调节神经元细胞焦亡的治疗药物和分子靶点，是治疗TBI的一种有前景的策略。

实现药物有效跨越血脑屏障（BBB）是TBI治疗策略开发中的一个主要挑战[14]。外泌体是细胞来源的细胞外囊泡，代表了天然的纳米载体，由于其生物相容性好、免疫原性和毒性低，且具有固有的穿越血脑屏障的能力，因此提供了一个充满希望的解决方案[15]，[16]。近年来，植物来源的外泌体样纳米颗粒（PELNs）引起了越来越多的关注。例如，从人参和三七中分离出的PELNs已在胶质瘤[17]和脑缺血/再灌注（CI/R）损伤[18]模型中显示出显著的治疗效果。黄芪（AM）是中医药的基石，其抗炎、抗氧化和神经保护等多种药理学特性已被广泛研究[19]，[20]，[21]。黄芪的活性成分，如芒柄花素和槲皮素，已被证明可以减轻CI/R模型[22]，[23]和缺血性中风模型[24]中的神经元细胞焦亡并改善认知功能。然而，黄芪来源的外泌体能否作为载体将黄芪的活性成分转运至损伤脑组织并调节TBI诱导的细胞焦亡，目前仍未被探索。

先前的研究已鉴定出Serpin家族E成员1（SERPINE1）是TBI的生物标志物，并且抑制SERPINE1已被证明可以减轻TBI诱导的损伤[25]。此外，黄芪的活性成分槲皮素已被报道可在动脉粥样硬化模型中靶向SERPINE1[26]。同时，新出现的证据表明SERPINE1可以与缺氧诱导因子1α（HIF-1α）直接相互作用[27]，[28]，且SERPINE1可能增强或稳定HIF-1α活性及其下游信号[27]。HIF-1α是免疫和炎症反应的关键调节因子，可通过调节下游炎症小体组分NLRP3的表达来调控炎症[29]。已有报道表明HIF-1α/NLRP3信号通路通过这两种分子之间的相互作用来调节细胞焦亡[30]，[31]。

本研究旨在探讨黄芪来源的外泌体能否作为一种天然的、生物相容的、具有脑穿透性的治疗药物，通过抑制SERPINE1/HIF-1α/NLRP3轴介导的细胞焦亡来减轻神经元死亡并改善TBI后的神经系统预后。本研究为开发基于PELNs的TBI纳米治疗药物提供了理论依据。

部分摘要

黄芪来源外泌体的分离

黄芪新鲜根茎购自内蒙古全民良桓农业有限公司。用自来水冲洗根茎上附着的泥土，随后用PBS漂洗。然后，将根茎切成约5 mm厚的片，加入PBS按3:1（v/w）的比例研磨以收集黄芪汁液。所得黄芪汁液依次在3000 g离心30 min、5000 g离心40 min、15000 g离心40 min和150,000 g离心70 min以获取沉淀。沉淀物被

黄芪来源外泌体的表征

黄芪来源的外泌体使用蔗糖密度梯度离心法分离纯化（图1A）。纯化后的黄芪来源外泌体悬液呈棕色半透明状态，均匀分散，无沉淀或悬浮颗粒（图1B）。在透射电镜（TEM）下，黄芪来源的外泌体呈球形，形态均匀，无聚集或降解现象（图1B）。黄芪来源外泌体的粒径范围为50-110 nm（图1C），平均zeta电位为-34 mV。此外，

讨论

TBI是对中枢神经系统的一种常见且灾难性的损伤，常导致神经元死亡、持久的神经功能缺损和运动功能障碍[34]。TBI后的继发性损伤极其复杂，其中细胞焦亡已被确认为神经元丢失和神经炎症的关键驱动因素[12]，[35]。尽管已有这些认识，但能够有效抑制TBI后细胞焦亡的治疗干预手段仍然匮乏，突显了

结论

总之，本研究提供了令人信服的证据，表明黄芪来源的外泌体通过抑制SERPINE1/HIF-1α/NLRP3轴来减轻神经元细胞焦亡，从而在TBI中发挥神经保护作用。黄芪来源的外泌体是一种天然来源的纳米囊泡，具有固有的脑靶向能力和多组分货物，是TBI后神经元细胞焦亡的有力调节剂。这些发现使植物来源的外泌体成为治疗TBI的一种有前景的策略。

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获得江苏华楚宇通医学检验有限公司动物伦理委员会的批准（批准编号：HC25047-P001-01）。

CRediT作者贡献声明

孙鹏：软件、资源、数据整理。吕金龙：撰写–初稿、可视化、资源、项目管理、资金获取、形式分析、数据整理、概念化。李超：撰写–审阅与编辑、项目管理、概念化。廖正銮：监督、形式分析。

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