溃疡性结肠炎中未发炎的结肠组织存在与抗TNF治疗无应答相关的体液活性

《iScience》：Uninflamed colonic tissue harbors humoral activity linked to anti-TNF therapy non-response in ulcerative colitis

　　

重点亮点
• 黏膜区室特异性特征可能预测溃疡性结肠炎（UC）对抗 TNF 治疗无应答
• 未发炎的固有层显示出最强的基线应答者差异
• IgA 浆细胞、体液免疫和细胞周期程序在无应答者中富集

摘要
抗 TNF 疗法是治疗溃疡性结肠炎的核心手段，但约 40% 的患者为原发性无应答者。为了找到治疗前区分抗 TNF 无应答者与应答者的特征，我们对基线时病情匹配但内镜结局不同的患者，进行血清细胞因子谱分析以及配对未发炎和发炎结肠上皮和固有层的激光显微切割转录组学分析。尽管炎症驱动了更多的上皮变化，但区分无应答者与应答者的特征出现在未发炎的固有层中，无应答者中细胞周期基因升高，且富集体液免疫基因的共表达网络表达一致较高。细胞反卷积将该网络定位到 IgA 浆细胞，并通过组织染色确认，且通过独立单细胞图谱的伪批量分析验证了这一关联。基线上皮特征或血清细胞因子在两组间无显著差异。这些发现表明，未发炎黏膜中已存在的 TNF 非依赖性体液活性是无应答的潜在贡献因素，这对预测和替代疗法具有启示意义。

图形摘要

引言
溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性肠病（IBD），通过持续的结肠炎症引起 debilitating 症状，严重影响生活质量。通常在早期发病，患者需与疾病抗争数十年。虽然结肠切除术具有治愈作用，但治疗策略侧重于诱导缓解和预防复发。抗肿瘤坏死因子（抗 TNF）制剂广泛用于中重度 UC，利用针对 TNF 的抗体，尽管机制尚未完全阐明。然而，只有一部分患者具有持续的治疗效果，10–40% 表现出原发性无应答，高达 50% 的初始应答者发展出继发性无应答。这突显了我们需要增强对底层抗 TNF 反应病理生理学的理解，以开发预测治疗结果的精准医学生物标志物。

多项研究已表征了 UC 中抗 TNF 应答者与无应答者之间的组织学、细胞和分子差异。Arijs 等人鉴定了 74 个差异表达基因（DEGs），而 West 和 Hegazy 等人证明基线癌坏死因子 M（OSM）上调与无应答相关。Friedrich 等人鉴定了三个与抗 TNF、抗整合素和皮质类固醇无应答相关的基因网络，由炎症成纤维细胞和表达 OSM 的中性粒细胞，或表达 B 淋巴细胞趋化因子（CCL19, CCL21, CXCL13）的淋巴聚合体组成。一项荟萃分析显示，肠道发炎黏膜中基线浆细胞增加预测了 IBD 对抗 TNF 无应答。最后，最近的一项单细胞 RNA 测序研究鉴定了应答者与无应答者在上皮和髓系细胞中的基线差异。

尽管生物标志物开发前景光明，但临床实施仍有限制。大多数基因表达研究分析发炎的整块黏膜样本，并频繁对相同队列进行重新分析，限制了数据的多样性和可靠性。研究通常在组水平比较应答者和无应答者，疾病状态和肠道组织类型异质，包括结肠和回肠以及发炎和未发炎黏膜。只有少数研究包含了配对的未发炎/发炎样本。虽然单细胞分析显示出识别应答者与无应答者差异的优势，但具有空间分辨率和深入批量 RNA 测序的可比研究仍显稀缺。

本研究采用了严格的患者同质性标准，并纳入了基线疾病活动度相等、血清药物浓度充足且在抗 TNF 治疗 6 个月后反应或无应答明确的 UC 患者。我们利用激光显微切割技术，调查了在抗 TNF 治疗前获取的配对未发炎和发炎黏膜样本中结肠上皮和固有层的区室特异性转录组，以及基线血清细胞因子谱。使用独立队列验证了发现。目的是对血清和结肠组织进行全面基线比较，以识别分子特征和潜在预测生物标志物，在开始治疗前区分未来的抗 TNF UC 无应答者与应答者。

结果
抗 TNF 应答者与无应答者具有可比的基线临床特征和血清细胞因子谱
UC 患者间存在较大的个体间变异性，这会混淆对抗 TNF 治疗应答者与无应答者之间的疾病差异。因此，我们纳入了生物学初治的 UC 患者（n = 19），基线疾病活动度相等，且在 6 个月后内镜反应状态明确（11 名应答者/8 名无应答者）（图 1A，S1B 和 S1C；表 1）。我们发现两组的人口统计学特征、身体质量指数（BMI）、血清 C-反应蛋白（s-CRP）、药物以及疾病的持续时间、范围 and 严重程度均可比。接受阿达木单抗的少数无应答者组的 s-谷浓度低于应答者，但仍高于治疗水平。应答者的中位粪便钙卫蛋白低于无应答者，尽管由于无应答者缺失测量值较多，该比较受到限制。钙卫蛋白高于 1000 的患者数量相似（分别为 5 和 4）。

图 1 血清细胞因子谱区分抗 TNF 应答者与无应答者
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(A) 在抗 TNF 开始前（T0）从疾病活动期的生物学初治 UC 患者中收集结肠镜活检和血清，并根据 6 个月后（T1）内镜 Mayo 评分（MES）的变化分类为应答者或无应答者。
(B 和 C) 基线血清细胞因子浓度（pg/mL）（中位数 ± 四分位距），以及 (C) 非 IBD 对照组（ctr）（n = 16）、无应答者（NR）（n = 8）和应答者（R）（n = 11）的 Z 分数转换平均观测值。
(D) 线性混合模型估计的归一化 Z 分数细胞因子浓度边际均值（±95% 置信区间）。R 和 NR 之间的平均差异：0.378 (Padj = 0.055)，使用 Student's t 检验进行。另见图 S1 和 S2。

应答者 (n = 11) 无应答者 (n = 8) 非 IBD 对照组 (n = 16) P 值
女/男 6/5 3/5 10/6 0.6499
年龄 平均 (SD) 35.1 (11.2) 38.5 (17.5) 53.5 (21.5) 0.6372
最小，最大 18, 52 17, 60 17, 71 –
平均疾病持续时间 (SD)，年 6.6 (5.7) 9.2 (6.8) N/A 0.4468
吸烟 是 0 (0%) 0 (0%) N/A –
否 9 (81%) 5 (63%) N/A –
以前 0 (0%) 1 (13%) N/A –
N/A 2 (18%) 2 (25%) –
平均 BMI kg/m2 (SD) 24.3 (3.7) 27.9 (5.9) N/A 0.1521
药物类型 (%) N/A –
英夫利西单抗 7 (64.6%) 5 (62.5%) – 1.0
阿达木单抗 4 (36.4%) 3 (37.5%) – 1.0
中位 s-谷浓度b μg/mL (SD) N/A –
英夫利西单抗 12.6 (7.7) 11.3 (0.79) – 0.73
阿达木单抗 14.4 (2.6) 7.4 (3.0) – 0.023
内镜 Mayo 2 1 0 5 – 0.262
内镜 Mayo 3 1 3 – – 0.262
蒙特利尔分类范围c 1 0 –
E2 (%) 3 (27%) 3 (38%) N/A –
E3 (%) 8 (73%) 5 (63%) N/A –
蒙特利尔分类严重程度c 0 5 5 –
S1 (%) 1 (9%) 2 (25%) – –
S2 (%) 10 (91%) 6 (75%) – –
S3 0 0 – –
S4 0 0 – –
中位 CRP mg/L (IQR) 2.50 (11.5) 11.0 (14.1) N/A 0.09
中位钙卫蛋白a mg/kg (IQR) 904 (872) 2313 (1243) N/A 0.037
钙卫蛋白 <250 (n) 0 0 – –
钙卫蛋白 250–1000 (n) 5 1 – –
钙卫蛋白 >1000 (n) 5 4 – –
钙卫蛋白 NA (n) 1 3 – –
中位 Nancy 评分b (IQR) N/A c –
发炎活检 3 (0.75) 2.5 (1) – –
未发炎活检 0 (0) 0 (0) – 0.45
入组时的其他药物 5-ASA (%) 8 (73%) 8 (100%) 1 (6.25%) 0.2281
GCS (%) 6 (55%) 5 (63%) 0 (0%) 1
免疫调节剂 (%) 2 (18%) 1 (6%) 0 (0%) 0.6027
Cortiment (%) 3 (27%) 0 (0%) 0 (0%) 0.2281

表 1 纳入 UC 患者和非 IBD 对照组的基线特征
IQR，四分位距；SD，标准差；5-ASA，5-氨基水杨酸；GCS，糖皮质激素。
a 在启动抗 TNF 后两周内。
b 仅使用用于激光显微切割的活检。
c 组织学评估可用于 10/16 名无非炎症迹象的非 IBD 对照组。
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鉴于血清细胞因子水平通常在 IBD 中升高，且血清是生物标志物的理想介质，我们对抗 TNF 应答者和无应答者与非 IBD 对照组（n = 16）进行了基线血清细胞因子多重分析。细胞因子浓度范围从 <10 到 >5,000 pg/mL（图 1B），对于大多数单个细胞因子，中位浓度显示出渐进趋势，对照组最低，无应答者居中，应答者最高。Z 分数转换确认了这一模式（图 1C）。线性混合效应模型（LMM）分析揭示了特定的细胞因子反应模式（图 S2C；表 S3）；尽管如此，应答者具有整体升高的细胞因子谱，与无应答者相比，估计边际均值更高（Δ0.38, Padj = 0.055）（图 1D）。多元主成分分析（PCA）（PC1: 36.2%, PC2: 12.2%）未能区分反应组，但揭示了无应答者相比应答者在细胞因子谱方面具有更大的个体间变异（图 S2D）。与非 IBD 对照组相比，应答者（Padj <0.0001）和无应答者（Padj = 0.029）的 PC1 复合评分均显著升高，且应答者的评分趋势高于无应答者（Padj = 0.29）（图 S2E）。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进一步表征了这些差异，确认无应答者的异质性增加（图 S2F），并鉴定了八种细胞因子（IL12p70, IFNγ, IL1β, CCL11, IL9, IL17, IL4 和 IL10），其投影变量重要性评分 >1.0，有助于区分应答者与无应答者（图 S2G）。

炎症在 UC 患者的结肠上皮和固有层中引起独特且共有的基因特征
尽管 UC 可被视为一种系统性疾病，但血清细胞因子测量会受到非肠道炎症的混淆。鉴于上皮和固有层中炎症过程之间复杂且不完全理解的相互作用，结肠黏膜内分子过程的空间表征仍然至关重要。首先，为了表征炎症期间的区室特异性转录特征，我们分析了在抗 TNF 治疗前获取的配对未发炎（n = 10）和发炎（n = 12）上皮，以及未发炎（n = 10）和发炎（n = 11）固有层样本。上皮和固有层区室如何划分的视觉表示可在图 2A 中找到。炎症状态通过 Nancy 评分（表 1）进行组织学确认。PCA 显示组织类型（PC1）和炎症状态（PC2）之间有明显的分离，分别解释了 57.8% 和 8.04% 的方差（图 2B）。上皮显示出更大的炎症转录活性，有 2,654 个 DEGs，而固有层有 1,525 个（表 S4），而 638 个 DEGs 在组织类型之间共享（图 2C）。区室特异性 DEGs 的富集分析（图 2D）显示，发炎上皮富集于干扰素信号传导、趋化、细胞 - 基质相互作用和抗原呈递，而固有层则富集于补体过程、细胞周期、有丝分裂、B 细胞受体信号传导、IL17 衍生的细胞因子和趋化作用。共享 DEGs 中的常见过程是补体系统、Th17 反应、趋化和白细胞招募（图 2E）。独特的 DEGs 显示抗原呈递和干扰素反应为上皮特异性，而细胞周期过程为固有层特异性。

图 2 黏膜区室特异性转录特征和上皮细胞类型分析
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(A) 上皮和固有层区室勾勒的示意图。使用 Leica LMD7 显微镜，通过手动勾勒并用激光将上皮和固有层区室隔离在单独的管中。
(B) 未发炎和发炎的上皮和固有层样本（n = 43）的主成分分析（PCA）。
(C) 发炎和未发炎上皮（n = 22）和固有层（n = 21）之间 DEGs (Padj <0.05, log2FC > 0.3) 的文氏图。
(D 和 E) 每个区室炎症上调 (D) DEGs 或 (E) 区室独特/重叠 DEGs 的前富集 Metacore 网络 (Padj <0.01)。P.E.L = 血小板 - 内皮细胞 - 白细胞。
(F) 上皮中与炎症相关（红色）但与反应状态无关的 WGCNA 模块。每个单元格显示与 (Padj) 的皮尔逊相关系数 (n = 22)。
(G) 上皮模块在 FE 中的前 Reactome 富集 (Padj <0.01)。基因比 = DEGs 与总基因数；圆圈大小 = 每个网络中相交基因的数量。
(H) 通过反卷积的上皮样本（n = 22）中的细胞类型组成。细胞类型图例的垂直方向对应于图中细胞群体从上到下的堆叠顺序。
(I) 未发炎和发炎上皮状态之间显著不同的细胞群体（FDR <0.05）（中心对数比转换比例）。另见图 S3 和 S5。

加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定了代表每个区室中生物过程并 correlated with 炎症状态的几个共表达基因模块（图 S3 和 S4）。上皮基因模块的富集分析（图 2F）显示，模块 Black 与未发炎上皮相关，并富集于脂肪酸代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体 gamma (PPARγ) 信号传导（图 2G 和 S5A）。模块 Lightcyan1 和 Lavenderblush2 与炎症相关，其中 Lightcyan1 富集于干扰素信号传导、病毒感染和抗原呈递，而 Lavenderblush2 富集于 TNF 和 IL-17 信号传导以及固有免疫反应（图 S5B 和 S5C）。使用结肠单细胞图谱（815,900 个转录组）进行的细胞反卷积确认，我们的上皮区室转录组主要与上皮细胞类型相关（图 2H）。在炎症期间，几种上皮亚型（BEST4-OTOP2, Goblet, Tuft, Stem_LGR5pos, CT colonocytes）的推断相对贡献显著减少（图 2I），而 B 细胞、髓系细胞、基质细胞和 Paneth 细胞增加。然而，B 细胞、基质细胞和髓系细胞的相对贡献较低，这影响了结果的稳健性。

固有层基因模块的富集分析显示，与炎症相关的模块 Skyblue 和 Floralwhite（图 3A）分别富集于适应性免疫过程，包括 B 和 T 细胞受体及 NF-κB 信号通路，或中性粒细胞脱颗粒和细胞因子信号传导（IL17, TNF, IL4, IL13）等固有免疫过程（图 3B, S5D 和 S5E）。与此一致，细胞反卷积显示固有层转录组主要与适应性免疫细胞和成纤维细胞相关（图 3C）。在炎症期间，生发中心（GC）样、中间和记忆 B 细胞及浆母细胞特征的推断相对贡献显著增加，而成纤维细胞、胶质细胞和肌成纤维细胞相关信号减少（图 3D）。

IgG浆细胞、周细胞和T细胞特征在炎症过程中呈现双峰模式，其中一个患者簇类似于未炎症样本，而另一个则表现出明显的增加。

图3 固有层特异性转录网络与细胞类型分析

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(A) 与炎症相关（红色）但与应答状态无关的固有层WGCNA模块。每个单元格显示Pearson相关系数及（Padj）（n = 21）。

(B) (A)中模块的Top Reactome富集结果（Padj <0.01）。基因比例 = DEGs与总基因数之比；圆圈大小 = 各网络中交集基因数量。

(C) 固有层样本通过反卷积分析确定的细胞类型组成（n = 21）。细胞类型图例的垂直方向对应于图中细胞群体从上到下的堆叠顺序。

(D) 未炎症与炎症固有层状态之间显著差异的细胞群体（FDR<0.05）（中心对数比值转换后的比例）。另见补充图S4和S5。

抗TNF无应答者在基线时固有层细胞周期基因表达增加

在阐明固有层和上皮黏膜炎症相关的分子过程后，我们接下来检查抗TNF无应答者与应答者之间是否存在隔室特异性的基线分子差异。鉴于药物靶点基线表达的重要性，我们首先使用线性混合模型分析检查了TNF通路组分如何受炎症和应答状态调节。无应答者的未炎症上皮TNF表达升高，但在应答者中TNF在炎症期间显著上调，导致应答者的炎症上皮TNF水平高于无应答者，尽管呈双峰分布（补充图S6A）（补充表S7）。固有层中未观察到炎症、应答状态或其交互作用对TNF的显著调节。与其隔室特异性表达一致，TNFRSF1A在炎症固有层中下调，TNFRSF1B在炎症上皮中上调，且两种受体在应答组间均无差异。

主成分分析图显示抗TNF无应答者与应答者在炎症上皮和固有层中均存在重叠。在未炎症隔室中，观察到聚类趋势，尤其在固有层中，四个无应答者样本中有三个更接近炎症样本，提示相似性（图4A）。炎症固有层、未炎症或炎症上皮中应答组间未发现差异表达基因。对于未炎症固有层，仅有102个差异表达基因，尽管隔室分离总体良好，但仍包含几个主要为上皮基因，从而限制了进一步分析（补充图S6B；补充表S5）。由于主要差异存在于固有层样本中，分别对无应答者和应答者的固有层进行了独立的炎症分析（图4B），结果显示两组均有共同和不同的转录反应，应答者有1,112个差异表达基因（925个独特），无应答者有395个差异表达基因（208个独特），共享187个基因。虽然两组均表现出Th17相关过程、吞噬作用和补体激活，但细胞周期过程在炎症期间仅在应答者中独特富集（图4C）。通过绘制细胞周期核心基因得到证实，无应答者的未炎症固有层表达高于应答者，炎症组织中的差异减小（图4D）。通过免疫组织化学和计算定量，我们验证了TOP2A（图4E）和Ki67（图4F）阳性细胞数量在炎症期间增加，尽管未炎症组织中应答组间无明显差异。但与基因表达一致，总体增殖标记物Ki67在无应答者中倾向更高，炎症组织中升高较少，提示无应答者未炎症固有层增殖模式略有改变。

图4 抗TNF应答者与无应答者之间固有层基线分子差异

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(A) 未炎症和炎症上皮及固有层样本的主成分分析（n = 43），按应答状态着色。

(B) 应答者（n = 12）和无应答者（n = 10）中炎症与未炎症固有层之间差异表达基因（log2FC > 0.3, Padj <0.05）的文氏图。

(C) 炎症上调差异表达基因的Top富集Metacore网络（Padj <0.01）。基因比例 = 差异表达基因与总基因数之比；圆圈大小 = 各网络中交集基因数量。

(D) 应答者和无应答者未炎症（U）和炎症（I）固有层中细胞周期核心基因的归一化表达（中位数 ± 四分位距）。

(E和F) 固有层免疫染色(E) TOP2A+或(F) Ki67+细胞（红色圆圈）的计算定量代表性图像。图中显示相应的基因表达和定量蛋白（中位数 ± 四分位距），应答者（橙色）和无应答者（蓝色）。小提琴图显示未炎症固有层中的蛋白定量。比例尺，50 μm（E和F）。

无应答者未炎症固有层体液活性较应答者增加

鉴于应答组之间未炎症固有层的差异，我们寻求通过网络分析进一步确定潜在的生物学过程。加权基因共表达网络分析（补充图S7）揭示了与应答状态相关的基因网络，其中模块Skyblue1显示与无应答相关的病毒翻译和核糖体核糖核酸活性增加，而模块Magenta与应答相关，富集于细胞外基质组织（补充图S8）。模块Mediumorchid与无应答者相关（r = ?0.61, Padj 0.061），富集于适应性免疫系统和B细胞介导的免疫过程（图5A和5B）。主要的Reactome术语"免疫系统过程"包含大量免疫球蛋白基因，包括重链可变片段（IGHV3-7、IGHV3-73、IGHV4-59、IGHV5-51）和κ轻链（IGKV1-6、IGKV1-8、IGKV1D-17、IGKV3-20）及λ轻链（IGLV2-11、IGLV2-14、IGLV3-21、IGLV6-57），代表抗原结合可变域（图5C）。显著基因包括IGHV4-34（Padj = 0.070；补充图S9），常在自身免疫疾病中升高，IgA2重链恒定区（IGHA2），以及IgA和IgM多聚化和黏膜运输所必需的J链（JCHAIN）。其他B细胞相关基因涵盖细胞因子信号传导（GPR15、CHID1、CSF2RB）、转录调控（BMI1、IKZF3、POU2AF1）、抗原呈递（TAPBP）和内质网过程（UBE2J1）。所有基因在无应答者未炎症固有层中的表达系统性高于应答者，在炎症组织中差异消失，类似于细胞周期核心基因（图4D）。模块Mediumorchid还包含应答者固有层炎症期间调节的更多独特基因（n = 31），而无应答者为（n = 13）（图5D），暗示无应答者未炎症组织中水平升高。通过类似的加权基因共表达网络分析，我们未检测到与应答状态相关的、在炎症固有层或未炎症和炎症上皮中具有生物学意义的共表达基因模块。尽管未具统计学显著性（Fisher精确检验，p = 0.57），但在选择激光显微切割和RNA测序的队列中，无应答者（4/6）基线糖皮质激素使用率数值上高于应答者（2/6）。由于糖皮质激素可改变免疫细胞转录组，我们评估了潜在的混杂因素，发现糖皮质激素使用未影响结果（补充图S10）。

图5 模块Mediumorchid揭示无应答者未炎症固有层中与抗TNF无应答相关的体液转录特征

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(A) 无应答者（NR，蓝色）与应答者（R）未炎症固有层（n = 10）中模块Mediumorchid与无应答状态的相关性，显示Pearson相关系数及Padj。

(B) 模块Mediumorchid的Top Reactome富集结果（Padj <0.00001）。基因比例 = 差异表达基因与总基因数之比；圆圈大小 = 各网络中交集基因数量。

(C) 应答者和无应答者固有层中免疫系统过程基因的表达（中位数 ± 四分位距）。

(D) 模块Mediumorchid基因、应答者（R_inf）与炎症 vs. 未炎症差异表达基因及无应答者（NR_Inf）与炎症 vs. 未炎症差异表达基因之间的固有层独特和重叠表达。另见补充图S9。

为阐明无应答者未炎症固有层中识别的基因网络可能由哪些细胞类型介导，使用Thomas等人图谱的单细胞投影（图6A）显示，模块Mediumorchid基因（图6B）和免疫系统过程基因（图6C）主要在浆细胞群体中表达，特别是浆母细胞和IgA，但也包括IgG浆细胞亚群。细胞周期核心基因（图6D）也在B细胞亚群和IgA和IgG浆母细胞中高表达。尽管通过细胞反卷积未发现在应答组之间推断的相对细胞丰度有显著差异，但多个B细胞和浆细胞相关基因在无应答者未炎症固有层中表达升高，特别提示IgA而非IgG亚群增加（图6E）。通过组织染色和计算定量在体内得到验证。免疫染色显示无应答者未炎症固有层中CD138阳性浆细胞总体上多于应答者（图6F和6G）。使用多重原位mRNA杂交进一步表征，证实无应答者浆细胞负荷较高是由于IgA mRNA阳性亚型增加，而非IgM和IgG mRNA阳性亚型（图6H和6I），与基因表达一致（图6E）。

图6 模块Mediumorchid定义与抗TNF无应答相关的浆细胞驱动基因网络

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(A–D) 单细胞RNA测序的结肠黏膜细胞UMAP降维图（n = 815,900个细胞）。(B和C) 单细胞表达：(B) 模块Mediumorchid，(C) 免疫系统过程，和(D) 细胞周期核心基因。

(E) 应答者（R）和无应答者（NR）未炎症固有层中B细胞和浆细胞基因的表达（中位数 ± 四分位距）。

(F) 应答者和无应答者未炎症固有层中免疫染色CD138浆细胞（黄色）计算定量的代表性图像（n = 10）。

(G) 图中显示相应的基因表达和定量蛋白（中位数 ± 四分位距）。# 平均无应答者vs.应答者蛋白水平差异为2.7（95% CI ?0.72至6.2；p = 0.11，Welch t检验）。

(H) 无应答者和应答者未炎症固有层中IgA（绿色）、IgM（黄色）和IgG（红色）阳性浆细胞mRNA荧光多重原位杂交计算定量的代表性图像（n = 9）。

(I) 图中显示每个通道阳性细胞百分比相对于检测到的总细胞数（DAPI阳性）的比例。图像显示QuPath标注示例。? 平均无应答者vs.应答者IgA阳性浆细胞数量差异为6.7（95% CI 0.19至13；p = 0.045，Welch t检验），而IgM和IgG浆细胞无显著差异。比例尺，100 μm（F和H）。

为进一步验证无应答者未炎症固有层中与抗TNF无应答相关的识别基因模式，我们使用Thomas等人独立单细胞抗TNF治疗队列中9例溃疡性结肠炎治疗前未炎症固有层细胞数据进行了伪bulk分析（图7A）。两个数据集均显示无应答者较应答者在78%（14/18）细胞周期核心基因（图7B）和82%（50/61）免疫系统过程基因（图7C）中一致的上调调控。最后，他们的单细胞数据显示无应答者与应答者未炎症IgA浆细胞之间差异表达基因（图7D；补充表S6），在我们的数据中未炎症固有层有85%（11/13）一致调控（图7E）。

图7 独立队列中抗TNF无应答者未炎症固有层细胞周期和体液基因特征的验证

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(A) 使用细胞过滤和生成个体伪bulk profile（n = 9）的独立单细胞RNA测序数据集验证流程图，与我们的数据（n = 10）进行比较。

(B和C) 验证队列中非缓解（NR）和缓解（R）患者治疗前未炎症固有层细胞中(B) 细胞周期核心和(C) 免疫系统过程基因的表达（中位数 ± 四分位距）。

(D和E) 验证队列中缓解（R）和非缓解（NR）IgA浆细胞之间差异表达基因（log2FC > 0.3, Padj <0.05）和(E) 我们数据中应答者（R）和无应答者（NR）未炎症固有层中的表达。蓝色标签和图表显示两个数据集中一致调控的百分比（%）。

讨论

我们对配对未炎症和炎症结肠黏膜的黏膜隔室特异性转录组分析揭示，抗TNF无应答者基线时未炎症固有层中存在体液免疫特征，以细胞周期、免疫球蛋白和浆细胞相关转录程序的表达升高为特征。这些发现解决了抗TNF治疗反应不可预测的关键临床挑战，并揭示即使组织学上未炎症的组织也可携带基线免疫结构的基本差异，可能代表无应答的潜在倾向。

Uzzan等人也描述了未炎症结肠黏膜中的体液活性，与健康对照相比IgG浆细胞和转换记忆B细胞患病率增加，被认为反映过去的炎症或炎症细胞的扩散。

尽管很难确切知晓非应答者与应答者相比无炎症组织的预炎症状态，但早期全结肠炎无差异（图 S1B）。此外，虽然 Uzzan 等人是与健康对照相比，而我们区分了均有活动性疾病的应答组和非应答组，并发现了 IgA 细胞和胚系免疫球蛋白基因的改变，这可能更 indicative of 固有变异。免疫球蛋白富集的 signature 可能提示自身炎症机制。特别是，IGHV4（常为 IGHV4-34）基因与固有自身反应性相关，并存在于多种自身免疫疾病中，如与溃疡性结肠炎（UC）相关的类风湿关节炎和克罗恩病。尽管我们没有直接测量或表征自身反应性抗体，但测得的高治疗性药物浓度使得抗药抗体不太可能是非应答的根本机制。尽管如此，非应答者似乎需要更高剂量的英夫利昔单抗和更短的输注间隔，且阿达木单抗水平略低，这可能意味着增强的体液活性以某种方式相互作用并影响抗 TNF 抗体，而未导致亚临床血清谷浓度。这一假设仅基于少数观察，应谨慎解读。据报道，原发性抗 TNF 非应答者不太可能响应二线生物制剂，并可能从替代药物（如小分子 JAK 抑制剂）中获益。尽管我们同时观察了无炎症和炎症组织，但与其他溃疡性结肠炎和克罗恩病研究的结果一致，加强了体液免疫参与跨炎症性肠病表型的抗 TNF 抵抗力的证据。

成功的显微切割实现了对上皮和固有层区室在不同炎症状态下的独立分析，显示出炎症上皮和固有层中增强的过程，与既往研究一致。与我们的结果一致，Uzzan 等人展示了 UC 炎症期间浆母细胞和 IgG+ 浆细胞的扩增。有趣的是，在我们的队列中，炎症组织中的 IgG 浆细胞呈双峰分布，要么维持无炎症样的丰度，要么显示显著扩增，提示不同的炎症内型。Uzzan 等人还报道了具有减少的 VDJ 基因突变和多样性的体液抗体，这与滤泡外发育相关，易导致自身反应性 B 细胞克隆的扩增。他们指出 IFNγ 是失调体液反应的潜在驱动因素，这与我们在黏膜炎症期间富集的 II 型干扰素反应一致。IBD 特异性的组织学特征基底浆细胞增多症在早期阶段典型，并可作为复发的独立指标。来自循环自身抗体（如核周抗中性粒细胞胞质抗体，pANCA）和最近鉴定出的针对 αvβ6 的自身反应性浆母细胞克隆的进一步支持，有趣的是后者与侵袭性疾病过程相关，并可在临床前阶段检测到，提示失调的体液反应早期参与。重要的是，近期报道一例严重多重耐药 UC 患者通过 CD19 嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法实现快速且完全的药物缓解，与我们的发现一致，并强烈提示 B 细胞谱系至少参与了 UC 患者亚群的发病机制。

相反，在血清中，抗 TNF 应答者的中位细胞因子浓度有高于非应答者的趋势，包括 IL17、TNF、CCL11、CXCL10 和 IFNγ 等核心 UC 相关细胞因子。我们还观察到抗 TNF 非应答者之间个体间异质性增加，这可能表明该组系统性且协调的 TNF 驱动疾病较少。尽管分析未表明 TNF 及其受体的差异表达是抗 TNF 反应变化的基础，但应答者的上皮 TNF 表达更高且更易受炎症触发。膜结合型 TNF 表达增加也被证明与短期和长期反应相关，此前对 153 名 UC 患者 460 种蛋白的血清蛋白质组学分析发现，代表非 TNF 依赖途径的 15 种蛋白预测了治疗升级。其他人发现应答组间黏膜 TNF 及其受体的调节不一致。因此，复杂的抗 TNF 机制仍未完全理解。然而，我们的观察符合抗 TNF 反应是由 TNF 以外的其他分子炎症机制驱动的概念。然而，血清分析可能受到多种全身因素的影响，仅是结肠黏膜环境的代理指标，从中可以揭示对反应异质性更直接和细致的理解。

本研究的主要优势包括严格的纳入标准、上皮和固有层黏膜区室的分离以及配对的无炎症和炎症活检，确保了同质且纯的数据集并控制了个体变异性。值得注意的是，研究发现通过多种方法进行了验证，包括来自独立的大规模纵向治疗单细胞 RNA 测序图谱的最新数据。炎症组织中应答组间缺乏转录组差异（如同之前报道的 OSM 表达），可能反映了研究设计和我们延长的 6 个月内镜评估。时间点与 Friedrich 等人的方法一致，但与 STRIDE-2 建议及较早的研究不同，后者在较早时间点评估原发性非应答。虽然我们的 6 个月终点捕捉了持续反应，但可能混淆了原发性机制非应答与继发性应答丧失。此外，已鉴定的无炎症体液 signature 是主动干扰抗 TNF 治疗，还是仅仅作为更侵袭性、根深蒂固疾病表型的代理指标（这种表型通常更难治疗），仍有待确定。我们的研究样本量相对较小，需要更大的队列来确认和扩展我们的发现。然而，研究设计高度重视患者同质性和配对的区室特异性采样，从而减少了生物学和临床变异性并增强了内部效度。值得注意的是，抗 TNF 非应答者无炎症固有层中独特的体液和细胞周期 signature 的主要发现已在另一个样本量有限的独立数据集中得到确认。

可能存在几种不同的 UC 内型和涉及非 TNF 依赖炎症途径的抗 TNF 非应答机制。我们的机制框架识别了无炎症结肠黏膜中固有的体液激活作为 UC 抗 TNF 抗力的潜在驱动因素，并具有临床意义。

研究局限性
非应答者中缺失的样本掩盖了粪便钙卫蛋白在组间是否存在差异，但钙卫蛋白作为抗 TNF 反应预测指标的临床实用性存在争议。基线用药，特别是皮质类固醇，是黏膜转录组的潜在混杂因素。虽然接受皮质类固醇的非应答者比例较高，但差异不显著，且补充分析表明观察到的体液 signature 反映的是非应答而非糖皮质激素效应（表 S8）。鉴于样本量有限，不能完全排除残余混杂。此外，我们的研究效能不足，难以检测较小的效应量，特别是对于亚组分析，导致部分结果仅呈现显著趋势。

资源可用性
主要联系人
有关资源和进一步的信息请求应联系主要联系人 Ingunn Bakke ([e-mail])，并将由其满足需求。
材料可用性
本研究未产生新的独特试剂。剩余的人类生物材料（FFPE 活检和血清）有限，并是在知情同意下收集的；访问请求将由主要联系人根据伦理和法律限制以及材料转移协议考虑。
数据和代码可用性
•体细胞 RNA 测序数据已存入 GEO，自出版日期起公开可用。登录号（GEO: GSE288517）列在关键资源表中。
•所有原始代码已存入 Zenodo，自出版日期起公开可用。DOI（https://doi.org/10.5281/zenodo.17593185）列在关键资源表中。
•重新分析本论文中报告数据所需的任何附加信息均可向主要联系人请求。

致谢
本工作是与圣奥拉夫大学医院胃肠病学和肝病学系胃肠内镜单元合作完成的，离不开跟随患者工作的专职护士和医生的帮助。感谢挪威科技大学（NTNU）临床与分子医学系工程师 Linn Karina M. Selvik、Siri S?terstad、Liv Ryan 和 Ann-Therese Chattergoon Ali，以及 MScPharm 学生 Johan Lorentz Steffensen 的技术协助；感谢圣奥拉夫大学医院病理科组织病理学家 Elin Synn?ve R?yset 的组织学评估；感谢 NTNU 基因组学核心设施（GCF）的 Vidar Beisv?g 和 Tone Christensen 的宝贵支持；感谢 NTNU 公共卫生与护理系副教授 Turid Follestad 指导细胞因子线性混合模型。RNA 文库制备、测序和部分生物信息学分析是与 GCF 密切合作完成的。感谢 NTNU 细胞与分子成像核心设施（CMIC）和圣奥拉夫大学医院病理科扫描免疫染色切片。GCF 和 CMIC 均由 NTNU 医学院和健康科学系以及中挪威地区卫生局资助。本研究由挪威研究理事会（资助号 FRIPRO 335204）、中挪威地区卫生局与 NTNU 之间的联络委员会；以及圣奥拉夫大学医院与 NTNU 医学院和健康科学系之间的联络委员会资助。工作在炎症性肠病精准医学临床学术组（CAG-IBD https://www.ntnu.edu/cag-ibd/）内完成，该组由中挪威教育、研究和创新联络委员会支持（项目编号 90545800）。部分数据作为 2025 年柏林 UEGW 大会的口头 Late-breaking 会议展示。

作者贡献
概念化：G.A.E.W.、A.E.?.、A.K.S.、T.B. 和 I.B. 方法学：G.A.E.W.、S.S.、L.F.K.、A.vB.G.、A.K.S.、A.E.?.、T.B. 和 I.B. 软件：G.A.E.W.、H.S.P. 和 A.F. 验证：S.S.、H.S.P. 和 I.B. 正式分析：G.A.E.W.、S.S.、L.F.K.、A.S.、H.S.P.、A.F.、A.vB.G.、A.K.S.、T.B. 和 I.B. 调查：G.A.E.W.、S.S.、L.F.K.、K.L.、H.F.、A.E.?.、A.K.S.、T.B. 和 I.B. 资源：K.L.、H.F.、A.E.?. 和 A.K.S. 数据整理：G.A.E.W.、H.F.、K.L. 和 A.K.S. 写作 – 原稿：G.A.E.W.、S.S.、T.B. 和 I.B. 写作 – 审阅与编辑：所有作者。可视化：G.A.E.W. 和 S.S. 监督：A.E.?.、A.K.S.、T.B. 和 I.B. 项目管理：A.E.?.、A.K.S.、T.B. 和 I.B. 资金获取：A.E.?.、A.K.S.、T.B. 和 I.B.

利益声明
作者声明没有竞争利益。
生成式 AI 及 AI 辅助技术在写作过程中的声明
在准备本工作期间，作者使用 Claude.ai（Anthropic，美国加利福尼亚州旧金山）编辑文本，因为英语不是作者的母语，并协助编写 R 语法。在使用这些工具或服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容承担全部责任。

STAR★方法
关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| :--- | :--- | :--- |
| **抗体** | | |
| 小鼠单克隆抗 Ki67（克隆 MIB-1） | Dako/Agilent | Cat#M7240; RRID:AB_2142367 |
| 兔多克隆抗 TOP2A | Novus Biologicals | Cat#NBP1-85928; RRID:AB_11043073 |
| 小鼠单克隆抗 CD138/Syndecan-1（克隆 MI15） | Dako/Agilent | Cat#M7228; RRID:AB_2254116 |
| EnVision-HRP/DAB+ 二抗检测（REAL EnVision 检测系统） | Dako/Agilent | Cat#K5007; Cat#K500711-2; RRID:AB_2888627 |
| **生物样本** | | |
| 人类结肠 FFPE 活检（无炎症和炎症黏膜），UC 患者 | 本研究；挪威特隆赫姆圣奥拉夫大学医院 | N/A |
| 人类血清（UC 患者和非 IBD 对照） | 本研究；挪威特隆赫姆圣奥拉夫大学医院 | N/A |
| **关键商业检测** | | |
| Bio-Plex Pro 人类细胞因子 27-plex 检测 | Bio-Rad Laboratories | Cat#M500KCAF0Y; RRID: AB_2893118 |
| RNeasy FFPE Kit | Qiagen | Cat#73504 |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat#Q32855 |
| RNA 6000 Pico reagents and chips | Agilent Technologies | Cat#5067–1513 |
| RNA 6000 Pico ladder | Agilent Technologies | Cat#5067–1515 |
| Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero | Illumina | Cat#20040529 |
| RNA UD Indexes Set C | Illumina | Cat#20091659 |
| Collibri Library Quantification Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat#A38524500 |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | Bio-Techne | Cat#323135, 323100; RRID:SCR_018352 |
| TSA Vivid Fluorophore 520 | Bio-Techne | Cat#323271 |
| TSA Vivid Fluorophore 570 | Bio-Techne | Cat#323272 |
| TSA Vivid Fluorophore 650 | Bio-Techne | Cat#323273 |
| **化学物质、肽和重组蛋白** | | |
| PKD buffer（组织消化） | Qiagen | Cat#73505 |
| Mag-Bind TotalPure NGS（文库纯化） | Omega Biotek | Cat#M1378-01 |
| RNaseZAP（去污染） | Sigma-Aldrich | Cat#R2020 |
| **存档数据** | | |
| 体细胞 RNA 测序数据（本研究） | 本研究；基因表达综合数据库（GEO） | GEO: GSE288517 |
| 原始/统计分析代码 | 本研究；Zenodo | https://doi.org/10.5281/zenodo.17593185 |
| 单细胞 RNA 测序结肠图谱（用于反卷积和验证的参考） | Thomas 等人。 | GEO: GSE282122 |
| **寡核苷酸** | | |
| RNAscope Probe - Hs-IgGpan | Bio-Techne | Cat#439501 |
| RNAscope Probe - Hs-IGHMC2 | Bio-Techne | Cat#481091-C2 |
| RNAscope Probe - Hs-IGHA1-A2-C3 | Bio-Techne | Cat#1327221-C3 |
| **软件和算法** | | |
| R (v4.4) | R Core Team | https://www.r-project.org/ |
| ggplot2 (v4.0.3) | Wickham 等人。 | https://ggplot2.tidyverse.org/ |
| Ggridges (v0.5.7) | Wilke 等人。 | https://wilkelab.org/ggridges/ |
| Patchwork (v1.3.0) | Pedersen 等人。 | https://patchwork.data-imaginist.com/ |
| lme4 (v1.1-37) | Bates 等人。 | https://cran.r-project.org/package=lme4 |
| emmeans (v1.11.1) | Lenth | https://cran.r-project.org/package=emmeans |
| DHARMa（残差诊断） | Hartig 等人。 | https://cran.r-project.org/package=DHARMa |
| FactoMineR (v2.8) | Lê 等人。 | https://cran.r-project.org/package=FactoMineR |
| factoextra (v1.0.7) | Kassambara & Mundt | https://cran.r-project.org/package=factoextra |
| mixOmics (v6.26) | Rohart 等人。 | https://www.bioconductor.org/packages/mixOmics |
| bcl2fastq (v2.2) | Illumina | https://support.illumina.com/ |
| FastQC (v0.11.9) | Babraham Bioinformatics | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ |
| fastp (v0.20.1) | Chen 等人。 | https://github.com/OpenGene/fastp |
| STAR (v2.7.9a; 比对器，QC) | Dobin 等人。 | https://github.com/alexdobin/STAR |
| Picard (v2.21.5; CollectRNASeqMetrics) | Broad Institute | https://broadinstitute.github.io/picard/ |
| Salmon (v1.7.0) | Patro 等人。 | https://github.com/COMBINE-lab/salmon |
| tximport (v1.20.0) | Soneson 等人。 | https://bioconductor.org/packages/tximport |
| DESeq2 (v3.21.0) | Love 等人。 | https://bioconductor.org/packages/DESeq2 |
| DAVID | Huang 等人。 | https://davidbioinformatics.nih.gov/ |
| MetaCore | Clarivate Plc | https://portal.genego.com/ |
| gprofiler2 (v0.7.0) | Kolberg 等人。 | https://cran.r-project.org/package=gprofiler2 |
| WGCNA (v1.73) | Langfelder & Horvath | https://cran.r-project.org/package=WGCNA |
| CIBERSORTx (Docker) | Newman 等人。 | https://cibersortx.stanford.edu/ |
| QuPath (v0.5.1) | Bankhead 等人。 | https://qupath.github.io/ |
| DeepLabV3+ 组织分割模型（ResNet-18 编码器） | Pettersen 等人。; R?yset 等人。 | 见参考文献 |
| GraphPad Prism (v10.6.1) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ |
| **其他** | | |
| Bio-Plex 200 系统 | Bio-Rad Laboratories | N/A |
| Leica LMD7 激光显微切割显微镜 | Leica Microsystems | N/A |
| 2.0 μm PEN-membrane 玻璃载玻片（无 RNase） | Leica Microsystems | Cat#11505189 |
| Agilent 2100 生物分析仪 | Agilent Technologies | N/A |
| Agilent 4150 TapeStation 系统 | Agilent Technologies | Cat#G2991B |
| Qubit 荧光计 | Thermo Fisher Scientific | N/A |
| Illumina NovaSeq 6000 测序系统（S2 flow cell; 59–10-10–59 bp） | Illumina | Cat#20028316 |
| NanoZoomer S360 切片扫描仪 | Hamamatsu Photonics | N/A |
| Olympus VS200 切片扫描仪 | Evident/Olympus | N/A |

实验模型和受试者细节
伦理学
本研究经挪威中挪威地区医学与健康研究伦理委员会批准（#26798）。所有参与者均提供了书面知情同意。
人类受试者及研究队列
生物制剂初治的 UC 患者在圣奥拉夫大学医院启动抗 TNF 治疗时前瞻性招募。

来自挪威中部特隆赫姆奥拉夫大学医院，时间为2018年至2022年。在治疗前（基线，T0），患者接受结肠镜检查并取活检，进行临床和内镜Mayo评分（MES），并采集血清（图1A）；在6个月后（T1）重复评估。患者接受英夫利西单抗（5–10 mg/kg）或阿达木单抗（160–80–40 mg）治疗，14周后测量血清谷浓度（s-trough）以进行剂量调整。本研究的纳入标准为T0时MES 2–3；蒙特利尔E2–E3（左半结肠或广泛性结肠炎）；以及在T1完成内镜评估。主要应答（R）定义为T1时MES 0–1（n = 11），无应答（NR）定义为维持MES 2–3（n = 8）（图S1B和S1C）。血清分析的非炎症性肠病（非IBD）对照（n = 16）为门诊患者，经评估无宏观或微观病变。

各组参与者的性别、年龄及其他人口学和临床特征，以及每项分析所用的样本量，见表1。纳入时未记录祖源、种族、民族和社会经济地位。队列来自挪威中部特隆赫姆单一医院服务区域，该地区人口以北欧祖源为主，在普及公共医疗保障体系下，社会经济差异相对有限；因此，该队列预期在这些变量上相对同质，尽管未进行正式评估。这种有限的变异加上较小的样本量，限制了研究结果向祖源和社会经济更多样化人群的推广性。由于样本量小，未分析性别对结果的影响。这是一项前瞻性队列研究，无适用的临床试验注册号。

方法细节

实验概述见图S1A。所有实验的详细规格、计算工具和参数，以及多重检测和下游RNA测序数据，整理于表S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9。

血清采集和多重检测

在T0时从18名纳入患者中采集血清（一例因住院而漏采）以及16名对照。在室温下凝固20分钟后，样本离心（3000 rpm，10分钟，4°C），并于?80°C储存。使用Bio-Plex 200 System按照Bio-Plex Pro人细胞因子27-plex检测试剂盒的制造商方案分析27种细胞因子（1:4稀释）。排除缺失值超过25%的细胞因子（GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-6、IL-15、VEGF、FGF-basic）（表S1）。低于检测限的值按每种细胞因子最低可检测值的50%进行填补。无值超过检测限。

激光显微切割

根据T0活检的最佳横截面方向，选择6名应答者和6名无应答者。由胃肠病理学家使用Nancy组织学指数对苏木精和伊红染色切片进行评分。每位患者使用配对的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）活检标本，包括无炎症（右结肠脾曲）和炎症（左结肠）黏膜组织，但两名无应答者仅有炎症活检可用。将8 μm FFPE切片贴附于2.0 μm无RNA酶玻璃PEN膜载玻片上，加热（30分钟，60°C），水化，苏木精染色（1秒），然后脱水（梯度酒精和二甲苯）和干燥（30分钟），随后使用Leica LMD7显微镜（5倍物镜）进行显微切割。显微切割过程包括在使用PEN Screen手动描绘上皮和固有层区域后进行激光切割并分离样本（图2A）。激光切割参数为：功率30，孔径3，速度5，中间脉冲计数3，最终脉冲0，头电流1，脉冲频率1400。

上皮和固有层分别收集至不同管中（每张活检平均切割面积：上皮862,3565 μm2，固有层951,3853 μm2），加入150 μL PKD消化缓冲液，涡旋，并于?80°C储存至3个月内进行RNA测序。最终样本组为应答者的无炎症/炎症上皮和固有层（n = 6/6）以及无应答者的无炎症/炎症上皮和固有层（n = 4/6）。

RNA分离和bulk RNA测序

使用RNeasy FFPE试剂盒按照制造商说明提取总RNA，洗脱前室温孵育10分钟。使用Qubit RNA HS Assay Kit定量RNA，并使用Agilent RNA 6000 Pico Kit在2100生物分析仪上评估完整性。使用Illumina Stranded Total RNA Prep配合Ribo-Zero试剂盒制备RNA测序文库，使用所有可用RNA（范围6–55 ng）。在rRNA耗竭后，RNA片段化（94°C，2分钟），并用随机六聚物和Actinomycin D补充的第一链合成混合物进行逆转录。第二链合成掺入dUTP以实现链特异性。在3'端腺苷化和接头连接后，使用Illumina RNA UD Indexes Set C对文库进行PCR扩增（15个循环）。对文库进行纯化、定量和验证，确认200–500 bp片段（峰约280 bp）。合并文库在NovaSeq 6000 S2流动池上进行测序。使用bcl2fastq生成FASTQ文件。

免疫组化

将4 μm FFPE切片脱蜡，淬灭内源性过氧化物酶，并通过15分钟微波煮沸进行抗原修复。切片在4°C下用一抗（抗Ki67 1:100，抗TOP2A 1:500，或抗CD138 1:75）过夜孵育，使用EnVision-HRP/DAB+和苏木精显色，并以40倍分辨率扫描。抗体来源和目录细节见关键资源表。

多重mRNA原位杂交

将4 μm FFPE切片使用RNAscope多重荧光试剂试剂盒v2按照制造商方案染色，DAPI孵育延长至3分钟，并在缓冲液中洗涤后封片。切片使用靶向人IGHA1-A2、IGHM和泛IGHG的探针进行杂交，随后使用TSA Vivid荧光素进行信号放大，稀释度为1:1500（520-IgA和570-IgM）和1:10 000（650-IgG）。

定量和统计分析

总体

统计分析使用R（v4.4）进行，使用ggplot2、ggridges和patchwork包进行可视化。所有p值均使用各相关章节和图注中所述方法对多重比较进行了校正（Padj）。完整软件工具概述见关键资源表。

人口学和临床变量

连续变量使用Shapiro–Wilk检验进行正态性检验，并使用QQ图进行视觉评估。Welch检验用于正态分布变量，Mann–Whitney U检验用于非参数和有序变量。分类变量使用列联表分析，组间比例差异使用Fisher精确检验。

血清多重分析

使用lme4实现考虑重复测量的线性混合效应模型（LMM）。细胞因子类型和应答状态建模为交互固定效应，供体为随机效应。验证了残差正态性和同质性。（图S2A和S2B）。使用emmeans包计算边际均值和对比，并进行Kenward–Roger自由度校正。多重比较使用错误发现率（FDR）校正（Benjamini–Hochberg）。使用PCA（FactoMineR, factoextra）和PLS-DA（mixOmics）探索并可视化多变量细胞因子模式，仅对应答者/无应答者样本使用双组分模型。变量重要性投影（VIP）评分识别歧视性细胞因子（阈值>1.0）。所有分析使用自然对数归一化、Z分数转换的数据。

上游RNA测序处理

使用FastQC评估FASTQ文件质量，然后使用fastp过滤和修剪reads，使用STAR与基因组参考比对以进行质量控制。使用Picard CollectRNASeqMetrics提取质量指标，使用Salmon对GRCh38转录组参考进行准比对生成转录本计数。一名应答者炎症固有层样本因技术原因被排除（基因计数10,000，而预期为30–50百万reads）。将转录本计数导入R并使用tximport汇总为基因计数。

差异表达分析

使用DESeq2 Bioconductor包对基因计数进行归一化并分析差异表达，阈值为Padj <0.05和|log2倍变（log2FC）|> 0.3，仅包括蛋白编码基因。基因内样本差异使用归一化计数（中位比率）进行可视化，而多变量分析使用方差稳定转换数据。

TNF通路表达分析

为比较TNF、TNFRSF1A和TNFRSF1B在无应答者和应答者之间的表达，使用emmeans包为每个组织隔室的每个基因拟合LMM：表达量 ~ 炎症状态×应答状态 + (1|供体)。检查模型残差的正态性和同质性。多重检验使用基于多元t分布的"mvt"方法在每个分析内进行校正。具有显著交互作用的模型使用简单成对固定效应进行分析，而无显著交互作用的模型分析主效应。

富集分析

过度表达富集分析使用Padj <0.05和|log2FC|> 0.3的阈值。我们使用DAVID、MetaCore和gprofiler2包，以Gene Ontology生物过程、Reactome和KEGG作为注释参考，以及MetaCore过程网络。多重比较使用Benjamini–Hochberg或g:SCS（gprofiler2专用）进行校正。

加权基因共表达网络分析

使用WGCNA识别上皮样本（n = 22）、固有层样本（n = 21）和无炎症固有层（n = 10）中共表达基因簇（模块）。使用方差稳定转换（VST）表达值作为输入。层次聚类未检测到需要排除的样本异常值。对于每个数据集，使用Pearson相关性构建签名混合网络，软阈值功率选择为产生R2 > 0.80的无标度拓扑拟合的最低值。然后计算拓扑重叠矩阵，使用平均连接进行基因层次聚类。使用动态树切割算法从生成的树状图中识别模块，最小模块大小为50个基因，模块在0.15切割高度合并高度相关的特征基因（对应特征基因相关性≥0.85）。每个模块特征基因定义为模块表达谱的第一主成分。模块-性状关系通过模块特征基因与样本性状之间的Pearson相关性评估，显著性使用Student渐近p值评估。使用gprofiler2对性状相关模块进行富集分析，参考Gene Ontology、Reactome和KEGG通路，Padj <0.01视为显著。保留具有生物学意义富集的模块。

评估糖皮质激素作为潜在混杂因素

在激光显微切割和RNA测序的供体中，使用双侧Fisher精确检验比较应答组间的基线皮质类固醇使用情况。为评估皮质类固醇使用是否能解释在无炎症固有层中发现的体液特征，我们在无炎症固有层样本上进行了三项互补分析（表S8）。首先，按应答状态和基线皮质类固醇使用情况分层可视化中等兰花色模块基因（n = 63）和精选浆细胞参考基因集（n = 19）的表达。其次，模块特征基因——模块基因表达的第一主成分，使用WGCNA包中的模块Eigengenes函数计算——通过普通最小二乘法建模为应答状态、皮质类固醇使用和两者联合的函数，系数以效应估计和95%置信区间报告。第三，三个糖皮质激素反应基因集，精选的规范糖皮质激素诱导基因集和MSigDB、Gene Ontology生物过程集GOBP_RESPONSE_TO_CORTICOSTERONE和GOBP_RESPONSE_TO_CORTICOSTEROID（MSigDB v2025.1.hs），使用GSVA包对每个样本进行单样本基因集富集分析（ssGSEA）评分，应用于与网络构建相同的归一化表达矩阵。模块特征基因与每个糖皮质激素反应评分之间的关联通过Spearman相关性评估，模块与每个糖皮质激素反应集之间的基因水平重叠进行量化。所有分析在R v4.4中进行。

细胞类型解卷积

使用Thomas等人的结肠单细胞RNA测序数据（815,900个细胞；GEO: GSE282122）作为参考数据集。为固有层和上皮样本创建自定义参考（表S2）。使用标准化为每百万计数（CPM）的拟聚团表达推导细胞类型特异性谱，在CIBERSORTx中构建特征矩阵，分别为上皮和固有层样本优化。使用CIBERSORTx HiRes模块以默认参数进行解卷积，除B模式批次校正外，分别对上皮（n = 22）和固有层（n = 21）样本进行。细胞类型比例作为总和为1的成分数据处理，零值通过向所有比例添加常数（最小非零值的一半）进行调整。使用加性对数比率转换数据上的多变量方差分析检验炎症和无炎症样本间的差异，随后使用LMM考虑供体配对。多重检验使用Benjamini–Hochberg校正，显著性定义为FDR <0.05。使用中心化对数比率转换数据进行可视化。

拟聚团验证

使用来自独立的长期抗TNF治疗队列Thomas等人的单细胞RNA测序数据，验证与无应答者无炎症固有层相关的基因表达模式。

通过对仅来自预处理结肠溃疡性结肠炎（UC）非炎症性黏膜固有层样本的细胞（基于该数据集中的定义）进行过滤，为每位患者生成假批量（pseudobulk）表达谱，患者状态为非缓解（n = 6）或缓解（n = 3），分别针对所有黏膜固有层细胞类型或仅针对IgA浆细胞进行汇总（图7A）。绘制了细胞周期核心网络和免疫系统过程网络（图4D和5C）中基因的标准化计数，并比较了缓解与非缓解状态之间的差异。使用DESeq2识别了非缓解组与非缓解组与缓解组样本中非炎症性IgA浆细胞差异表达的基因（Padj < 0.05，|log2FC| > 0.3）。一致调控定义为：在两个数据集中，非缓解/未应答者的中位基因表达始终高于缓解/应答者。

免疫组化和多重mRNA原位杂交定量

使用带有ResNet-18编码器的DeepLabV3+深度学习模型对组织区室（上皮与黏膜固有层）进行分割。验证集性能与已发表的结肠上皮数据集相当，上皮分割具有高准确度（交并比 > 0.95）。在QuPath中进行量化前，手动排除了非应答者（n = 4/6）和应答者（n = 6/6）样本中黏膜固有层内的伪影、坏死碎片和黏液池（表S9）。由于浆细胞在黏膜固有层中密集聚集，阻碍了单个细胞核的分离，因此使用基于强度的像素分类器（DAB阳性像素占组织总像素的比例）对CD138进行定量。对于Ki67和TOP2A，使用基于分水岭的细胞检测（DAB阳性细胞核占总细胞核的比例）定量区分明显的细胞核。颜色解混在代表性图像扫描上手动设置。单独训练了一个QuPath像素分类器用于初始组织检测，并进一步表征多种形态学参数。对于多重原位杂交，使用训练好的像素分类器识别组织区域，并基于DAPI通道使用基于分水岭的细胞检测在这些区域内检测细胞。对IgA、IgM和IgG通道应用亚细胞检测，使用选定的强度阈值将信号与背景分离，以识别标记物特异性信号，从而实现相对于总细胞核的定量。使用Shapiro-Wilk检验和Q-Q图目视评估正态性。统计分析在GraphPad Prism中进行，对正态分布数据使用双侧Welch's t检验，对非正态分布数据使用Mann-itney U检验。

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文件 S1. 图S1–S10
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表S1. 血清多重分析输入数据
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表S2. 用于细胞类型反卷积分析的单一细胞RNA测序参考数据集（A）细胞类型参考群体（14种黏膜固有层和15种上皮细胞类型的细胞计数）。（B）上皮反卷积参考特征。（C）黏膜固有层反卷积参考特征
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表S3. 血清多重线性混合效应模型（LMM）详细输出
电子表格（3.37 MB）
表S4. 差异炎症表达分析（A）差异表达分析：炎症 vs. 非炎症上皮。（B）差异表达分析：炎症 vs. 非炎症黏膜固有层
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表S5. 非炎症黏膜固有层应答者与非应答者之间蛋白编码差异表达基因（DEGs）
电子表格（39.62 KB）
表S6. 独立验证队列（Taurus数据）中非炎症IgA浆细胞应答者与非应答者之间的差异表达基因（DEGs）
电子表格（40.55 KB）
表S7. TNF、TNFRSF1A和TNFRSF1B的差异表达基因（DEG）分析
电子表格（39.43 KB）
表S8. 糖皮质激素作为体液特征混杂因素的"