基于硼酸功能化AuNP传感界面的玻碳电极上HbA1c的电化学测定

《Biochemical Engineering Journal》：Electrochemical determination of HbA1c using a boronic acid–functionalized AuNP sensing interface on glassy carbon electrodes

　　

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  球形金纳米粒子（AuNP）/对巯基苯硼酸（MPBA）修饰的玻碳电极（GCE）实现了HbA1c的电化学测定。
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  在2.6–260 μg mL^?1 HbA1c的宽动态范围内呈对数线性响应。
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  经适当稀释处理后，测定结果与HPLC认证的HbA1c水平一致。
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  对葡萄糖、抗坏血酸、多巴胺、尿酸和血红蛋白（Hb）具有高度选择性。

引言

糖化血红蛋白（HbA1c）是人体血液总血红蛋白（Hb）的一种形式，由Hb暴露于血浆葡萄糖并通过β链上两个N端缬氨酸中的一个或两个进行共价结合，经非酶糖基化反应生成[1,2]。形成后，HbA1c在红细胞的剩余寿命（约120天）内持续存在，在健康个体中正常范围为总Hb的4–5.6%（相当于20–38 mmol HbA1c/mol Hb）[3,4]。血液中HbA1c百分比高于平均范围，与葡萄糖持续升高且超出正常范围80–120 mg/dL（4.4–6.6 mM）直接相关[2,[5], [6], [7]]。HbA1c被公认为评估长期血糖水平、用于诊断糖尿病的主要指标，糖尿病的特征是血糖调节功能受损，可能导致心脏病、肾衰竭或失明等病理并发症[1,8]。由于葡萄糖水平本身具有内在依赖性且频繁波动，葡萄糖指数通常用于评估暂时性血糖水平（通常在一天中的空腹或餐后状态下），而HbA1c则被用作过去约120天内平均血糖水平的代表性标志物，不受采血时个体当前状态的影响。因此，需要评估糖尿病风险或监测血糖控制水平的个体应每年进行数次HbA1c检测，糖尿病患者和医生均可定期全面了解疾病进展并监测治疗效果。美国糖尿病协会、欧洲糖尿病研究协会和国际糖尿病联盟自2010年和2011年以来建议，HbA1c水平在5.7%至6.4%（39–47 mmol/mol）之间或超过6.5%（48 mmol/mol），分别表明人体存在糖尿病前期或糖尿病[8,9]。

目前，实验室和诊所采用各种方法进行HbA1c检测，这些方法基于化学反应原理或分离定量原理，利用HbA1c与样品混合物中其他非糖化血红蛋白之间的结构或电荷差异。这些方法包括酶法测定、免疫测定、电化学传感器、亲和层析、离子交换层析、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳等[1,8,9]。其中，反相HPLC与质谱联用以及毛细管电泳已被国际公认为糖尿病诊断中HbA1c测定的金标准和参考方法。尽管这些方法在精密度和准确度方面具有高性能分析能力，但它们需要严格的样品预处理和复杂程序、独立专用且复杂的设备且成本高昂、专业人员以及较长的分析时间，因此最适合大型医疗机构或研究机构使用[10]。另一方面，化学分析方法需要对HbA1c和总Hb进行两次独立测试，以推算血液中HbA1c占总Hb的比例[3]。然而，这些方法可应用于大多数常规生化设备。其中，电化学传感器方法因其简便性、使用标准电化学仪器操作的易用性、成本效益、快速性以及可靠性（例如灵敏度）可匹配常规实验室实践而脱颖而出。它还具备测量复杂样品（即血液）的能力，使其特别适合开发用于即时检测或家庭环境的便携式微型化试剂盒[9]。目前已报道了基于多种换能材料（如金、石墨烯、多壁碳纳米管、金属有机框架（MOFs）、二维纳米材料等）[[11], [12], [13], [14], [15], [16]]、受体材料（如抗体、适配体、酶、硼酸衍生物、分子印迹聚合物）[13,[15], [16], [17], [18], [19]]和电化学技术（循环伏安法（CV）、差分脉冲伏安法（DPV）、计时电流法（CA））[4,[14], [15], [16], [17],19,20]用于HbA1c检测的不同化学或生物传感器。近期HbA1c生物传感的进展已在其他地方进行了全面总结[21,22]。

本研究构建了一个用于HbA1c检测的电化学平台，采用传统玻碳电极（GCE）[23]，以球形金纳米粒子（AuNP）作为换能层，以4-巯基苯硼酸（MPBA）作为化学受体（图1）。采用金纳米材料是因其优异的导电性、高生物相容性和大表面积，可增强传感器的稳定性和灵敏度[19,20,[22], [23], [24]]。此外，金表面允许通过自发的Au–S自组装实现受体的直接定向固定。在各种金纳米结构中，球形AuNP具有特别的实用优势，因为成熟的核介导生长方法可获得窄的尺寸分布，无需使用形态导向表面活性剂（如合成金纳米棒时使用的十六烷基三甲基溴化铵），否则需要去除这些表面活性剂以避免阻碍后续功能化[25]。此外，虽然具有抗体或适配体受体的传感器可为目标检测提供良好的选择性，但其相对较高成本以及对缓冲液pH和温度条件的不稳定性可能限制实际应用[26]。另外，基于酶的传感器在样品处理步骤上更为复杂，需要对HbA1c进行预先消化，且还受到生物材料环境敏感性特性的限制。因此，本研究采用了MPBA，一种稳定且常用的硼酸衍生物，可用于传感表面的目标修饰。MPBA通过其巯基通过强Au–S相互作用与AuNP结合，并通过其硼酸部分与稳定连接在Hb上的内部葡萄糖片段中以顺式二醇构型与HbA1c形成共价键来捕获HbA1c（图1A）[1,3,4]。因此，该结构实现了低成本、简便地构建稳健的HbA1c传感界面。

当HbA1c分析物被修饰电极轻松捕获后，可根据Hb内血红素基团的固有氧化还原活性进行测定（图1B）[27,28]。这些血红素中心催化溶液中过氧化氢（H₂O₂）物种的还原，类似于过氧化物酶样催化行为，使得催化电流随着固定化HbA1c量的增加而增大[19]。据此，通过评估电化学测量过程中催化还原电流的幅度来确定HbA1c水平。选择计时电流法（CA）作为读出方法，因为该方法可简单直接地测量与该氧化还原介导催化相关的法拉第电流。据我们所知，这是首次报道结合球形AuNP/MPBA界面于GCE上并通过血红素催化H?O?还原的计时电流检测的HbA1c传感器。本研究有意聚焦于在相对较低浓度范围内测定HbA1c，因为检测低浓度将有利于减少诊断所需的血液样品量。在此框架内，建立了校准曲线以关联HbA1c浓度与测得的电流响应。使用代表性内源性干扰物评估选择性，并使用认证参考样品验证准确性。综上所述，我们的工作确立了所提出传感界面的分析性能，并为开发未来微型化HbA1c检测系统奠定了基础。

章节摘要

试剂与仪器

二茂铁甲醇（FcMeOH，97%）、三氯化铁（K₃Fe(CN)₆，99%）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）、纯乙醇（C₂H₅OH，≥99.5%）、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES，99%）、Triton X–100；三氯化金三水合物（HAuCl₄.3H₂O，≥99.9%）、L-抗坏血酸（≥99%）、硝酸银（AgNO₃，≥99.0%）、MPBA（90%）、人血红蛋白（Hb，冻干粉，到货后4 oC储存）、D-(+)-葡萄糖（≥99.5%）、尿酸（≥99%）和多巴胺盐酸盐购自

所制备HbA1c传感器的表征

如图1A所示，传感界面通过四个连续步骤制备。首先，用30% H₂O₂处理裸GCE表面以引入羟基（-OH）[29]。随后，APTES通过乙氧基硅烷基团与-OH基团的缩合反应接枝到羟基化GCE表面上，形成共价Si-O-C键并暴露末端氨基（-NH₂）[30]。由于氨基在工作介质中质子化，它们提供正电荷以

结论

本研究成功构建了基于GCE的电化学传感界面用于HbA1c测定，采用球形AuNP作为换能材料，硼酸基受体。我们的平台实现了宽动态范围（2.6–260 μg/mL），检测限低至1.45 μg/mL。传感器对血液中的常见成分（包括葡萄糖、抗坏血酸、尿酸或多巴胺）无明显响应。然而，Hb被确定为主要的潜在

CRediT作者贡献声明

Thu Ha T. Nguyen：撰写–审阅与编辑，撰写–初稿，验证，方法论，形式分析，概念化。Phuc Hoang Dinh：撰写–审阅与编辑，可视化，调查，形式分析。Tae Seok Seo：撰写–审阅与编辑，验证，指导，资源，项目管理，经费获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究由韩国政府资助的韩国医疗器械开发基金会拨款支持（科学技术信息通信部、产业通商资源部、保健福祉部、食品药品安全部）（项目编号：RS-2026–25545924）。

Thu Ha T. Nguyen|Phuc Hoang Dinh|Tae Seok Seo