《Biochemistry and Biophysics Reports》：Comparing bulk and single-cell methodologies and models to profile gene expression, chromatin accessibility and regulatory links in endothelial cells treated with TNFα
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全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出数千个与复杂性状和疾病相关的非编码变异。然而，鉴定这些变异所调控的因果基因仍具挑战。调控关联可通过直接物理互作（如染色体构象捕获）或概率模型推断。这些统计模型利用批量或单细胞（sc）方法在细胞和组织中产生的基因表达与染色质可
全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出数千个与复杂性状和疾病相关的非编码变异。然而，鉴定这些变异所调控的因果基因仍具挑战。调控关联可通过直接物理互作（如染色体构象捕获）或概率模型推断。这些统计模型利用批量或单细胞（sc）方法在细胞和组织中产生的基因表达与染色质可及性谱。研究人员测试了使用批量或sc RNAseq/ATACseq数据及相应预测增强子到基因模型是否会影响因果GWAS基因的优先级排序。使用未处理及TNFα处理的人内皮细胞，研究人员发现批量与sc RNAseq/ATACseq谱凸显相同生物学。尽管存在这些相似性，研究人员使用冠心病（CAD）和舒张压（DBP）的GWAS结果证明，应用基于批量或sc的增强子到基因模型会在捕获遗传力、精细映射变异和关联基因方面产生差异。例如，在一个CAD位点，基于批量的ABC模型预测与TANGO2的调控关联，而基于sc的scE2G模型优先指向另一基因TXNRD2。结果表明，选择批量或sc方法将影响调控关联模型预测及表征GWAS发现的功能实验规划。
研究背景方面，大多数由全基因组关联研究（GWAS）鉴定的人类复杂表型相关遗传变异位于非编码区，可能通过调控基因表达发挥作用。这些变异改变开放染色质调控序列（如增强子）活性，进而导致基因表达失调。鉴定GWAS变异所在远端调控元件所控制的基因，对理解疾病分子机制至关重要。染色体构象捕获方法可捕捉调控元件与基因间直接物理互作，但技术难度大、成本高。统计模型利用基因表达、染色质可及性和三维接触谱预测增强子到基因互作（即调控关联）。已有模型多基于批量实验，后者为多种细胞和细胞类型的平均谱；近年单细胞多组学（scMultiome）使基于sc的概率增强子到基因模型得以发展。血管内皮细胞是冠状动脉疾病（CAD）和高血压等心血管疾病的关键细胞，其开放染色质位点可捕获显著CAD和血压GWAS信号。但在同一实验体系中，批量与sc谱所得增强子到基因模型预测是否一致尚不清楚。因此，研究人员以永生化人主动脉内皮细胞（teloHAEC）为模型，比较批量与sc方法对GWAS因果基因优先级的影响。
该研究由Jennifer Zevounou、Ken Sin Lo、Christopher S. McGinnis、Ansuman T. Satpathy、Guillaume Lettre等完成，论文发表于《Biochemistry and Biophysics Reports》。研究人员使用未处理（NT）及TNFα处理4小时和24小时的teloHAEC，比较批量与单细胞多组学（scRNAseq＋scATACseq）在基因表达、开放染色质及增强子到基因调控关联预测上的表现，并接入CAD与舒张压（DBP）的GWAS精细映射与Open Targets候选基因证据，评估ABC（基于批量ATACseq、H3K27ac ChIP-seq和HiC）与scE2G（基于sc多组学）模型对因果基因优先级排序的影响。结论为：批量与sc表达和开放染色质变化高度一致，但增强子到基因模型会给出不同候选基因；方法学选择会影响GWAS位点功能实验规划。
主要关键技术方法如下：样本为永生化人主动脉内皮细胞（teloHAEC），包括未处理及TNFα处理4小时、24小时条件；批量数据来自公开GEO数据集GSE126200，单细胞多组学数据来自10X Genomics Single Cell ATAC and RNA Multiome并经MULTI-seq样本标记后于IGVF Data Portal共享。建模方面，批量侧用activity-by-contact（ABC）模型整合ATACseq、H3K27ac ChIP-seq与HiC接触矩阵；单细胞侧用scE2G模型整合scRNAseq与scATACseq相关性。下游用S-LDSC做分区遗传力富集，用RSparsePro对CAD和DBP的GWAS汇总统计做精细映射并计算因果信号密度，用Open Targets关联分数校准CAD/DBP候选因果基因。
2.1 测量内皮细胞对TNFα刺激的反应
研究人员以teloHAEC未处理及TNFα处理4小时、24小时为体系，说明批量RNAseq、ATACseq及H3K27ac ChIP-seq、HiC数据来自既往公开数据，单细胞多组学为同条件新生成数据，从而建立比较批量与sc模态下基因表达、开放染色质峰及基因与远端调控元件关联的研究基础。
2.2 teloHAEC基因表达与开放染色质测量在批量与单细胞方法间具有一致性
通过比对批量与sc RNAseq发现，表达水平高度一致，三组分比较中表达倍数变化高度相关；批量RNAseq检出更多差异表达基因（DEG），可能因统计效能与检验方法不同。通路富集显示，尽管DEG集合仅有部分重叠，但KEGG生物学通路高度一致。ATACseq方面，研究人员配对批量与sc开放染色质峰，发现倍数变化高度相关，批量ATACseq可检出更小倍数变化的差异开放峰（DOP），说明两种模态捕捉相同染色质生物学。
2.3 用批量与单细胞数据识别teloHAEC中候选顺式调控元件与基因的调控关联
研究人员将ABC模型（批量）与scE2G模型（sc）用于同一细胞系统。scE2G高分预测多为启动子到基因关联；ABC排除启动子作为远端调控元件，因而关联更远端。ABC每基因关联调控元件数多于scE2G。三条件中，ABC与scE2G共同预测占比约20%至32%所有关联，对应15%所有调控区域。研究人员据此划分ABC＋scE2G、ABC-only、scE2G-only三类调控区域以供下游分析。
2.4 teloHAEC cCRE-基因关联富集CAD与DBP遗传力及精细映射变异
研究人员用S-LDSC对ABC＋scE2G、ABC-only、scE2G-only等类别做CAD和DBP分区遗传力富集，发现多数cCRE子集显著捕获两表型遗传力。用RSparsePro精细映射CAD与DBP，计算重叠cCRE的fine-mapped变异后验包含概率之和（sumPIP），并以占基因组比例校正得到因果信号密度（causal signal density, CSD）。结果显示各类别捕获的CAD和DBP因果关联信号量相似，且内皮细胞基因表达调控尤其适合研究DBP遗传架构。
2.5 用teloHAEC调控关联与Open Targets预测优先级排序CAD候选因果基因
研究人员将Open Targets的CAD关联分数用于评估ABC或scE2G关联的cCRE是否更易连接候选因果CAD基因。结果显示，ABC-only、scE2G-only与ABC＋scE2G连接到的CAD基因数相近；但scE2G关联候选基因的Open Targets分数高于ABC-only。维恩分析显示，IL6R、FES仅被scE2G连接，BTBD16、DHX36仅被ABC连接，TGFB1、NOS3、PLPP3被两者共同连接。特异性上，scE2G-only为87%，ABC-only为44%，两者共同为93%。位点示例中，TGFB1两模型一致；BMP1仅scE2G连接fine-mapped CAD变异；TXNRD2/TANGO2位点同一fine-mapped变异被scE2G连到TXNRD2、被ABC连到TANGO2；BCAR1/CFDP1位点两模型连到相同基因但通过不同cCRE。
讨论部分总结：非编码变异因果基因鉴定困难，因调控元件未必控制最近基因。sc多组学可在组织混合细胞中分细胞类型并同时测表达与可及性，但sc对低表达基因和低可及性峰敏感性较低。研究人员在同一血管内皮细胞系统中证明，ABC与scE2G对同GWAS位点的预测并不总一致，既有一致候选基因，也有仅一种模型检出的基因，甚至同一fine-mapped变异被连到不同基因。这会影响功能实验设计。scE2G特异性更高，但研究局限包括只测两个模型、单一实验系统、依赖各自输入数据类型质量。整合批量三维接触与sc多组学变异性可能提供更稳健的cCRE-基因关联框架。研究人员强调，在做GWAS功能实验前应考虑或组合HiC、eQTL/pQTL等多种基因优先级策略。
研究结论部分翻译：鉴定由人类疾病和性状相关非编码遗传变异调控的因果基因，是将人类遗传发现转化为临床洞察的重要步骤。该任务困难，因为调控元件不一定控制最近基因。已有若干统计模型利用批量或sc方法生成的数据预测开放染色质元件与基因间调控关联。sc多组学兼具从组织混合细胞分细胞类型及同细胞同时测表达与染色质可及性的优势；但相较批量方法，sc方法在捕获低水平表达基因或低可及性染色质峰上敏感性较低。本研究显示，这些方法论差异会影响前沿增强子到基因预测模型的结果。血管内生皮细胞与心血管疾病病因高度相关，GWAS已提示内皮功能参与CAD、卒中和高血压风险。利用已充分表征的人血管内皮细胞系统的表达与染色质可及性数据，研究人员比较了方法（批量对sc）与统计模型对增强子到基因预测的影响。即便使用简易体外血管内皮细胞模型，ABC与scE2G模型在同一GWAS位点的预测也不总一致：两模型共同预测的关联在许多位点连到优秀候选基因（如TGFB1、NOS3、PLPP3），也有仅ABC（如BTBD16、DHX36）或仅scE2G（如BMP1、IL6R、FES）连到的候选基因；甚至出现同一fine-mapped变异被ABC连到TANGO2、被scE2G连到TXNRD2等情况。结果表明，连接非编码GWAS变异与基因的数据来源和模型会强烈影响功能实验规划。虽然scE2G关联特异性高于ABC，但研究存在局限：仅测两个模型；仅单实验系统；结果依赖各自细胞谱质量与数据类型。三维接触更易在批量下测，而sc多组学模型可估计细胞间表达与可及性变异；整合两者可提供更稳健cCRE-基因关联框架。综上，用于增强子到基因预测的检测方法会影响GWAS预测因果基因列表；在规划GWAS发现的功能实验前，应考虑或组合替代基因优先级策略（如HiC、表达/蛋白数量性状位点（eQTL/pQTL））。
