来源于石蒜碱预处理间充质干细胞的细胞外囊泡中的 miR-6538 增强了类风湿关节炎的治疗疗效

《Biomaterials》：The miR-6538 in extracellular vesicles derived from lycorine-pretreated mesenchymal stem cells enhances therapeutic efficacy in rheumatoid arthritis

　　

## 摘要

间充质干细胞来源的细胞外囊泡（MSC-EVs）被开发为一种靶向平台，用于递送石蒜胺（Lycorine, LYC）——一种具有抗炎和抗肿瘤特性的天然异喹啉生物碱。石蒜胺在炎症性疾病中展现出治疗潜力，但其临床应用受到全身毒性限制。因此，我们建立了一种新型LYC-MSC-EV治疗系统用于类风湿关节炎（RA）的治疗。我们表征了在体外及胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型中评估的经LYC预处理MSC分离的EVs。LYC-MSC-EVs相较于未处理MSC-EVs展现出更优的抗炎效果，显著抑制促炎细胞因子释放（TNF-α、IL-6）及巨噬细胞过度激活。在CIA小鼠中，LYC-MSC-EVs减轻关节炎症，减少骨侵蚀，并调节免疫微环境极化。高通量分析揭示，由于miR-6538的特异性富集，LYC-MSC-EVs具有重塑的miRNA载货谱，从而发挥强效抗炎生物活性。机制研究表明，LYC-MSC-EVs中miR-6538的富集是主要介质，通过直接调控Cd274（PD-L1）表达靶向NF-κB-PD-L1信号轴。RNA测序证实了通路调节作用，而miR-6538抑制则消除了治疗效果。本研究证实MSC-EV介导的递送增强了LYC的抗关节炎活性，同时减轻毒性，并鉴定miR-6538为关键功能组分。靶向NF-κB-PD-L1轴的机制为开发基于EV的无细胞疗法治疗RA及相关炎症性疾病奠定了基础。

## 引言

类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，全球患病率为0.5%-1%，女性更为常见。其特征是持续性滑膜炎，通常呈多关节对称性分布，导致疼痛、肿胀、僵硬及进行性畸形。2019年EULAR/ACR分类标准推荐采用达标治疗（T2T）策略进行疾病管理。该模式将一线对症治疗（NSAIDs、糖皮质激素）与改善病情抗风湿药（如甲氨蝶呤）及生物制剂（如TNF-α抑制剂）相结合，以抑制炎症并防止关节侵蚀。一个重大挑战是长期药物治疗后出现的多种不良反应，如胃肠道紊乱至严重感染、器官毒性及潜在恶性病变。因此，当代研究重点已转向个性化精准医学，寻求具有持久疗效和更优安全性的新型疗法，以最终改善长期预后。

纳米尺寸（30-150 nm）的细胞外囊泡（EVs）以脂双层为定义，通过其载有的蛋白质和核酸，是细胞间通信的关键介质。其高生物相容性和固有靶向特异性使其成为药物递送的优选范式。将治疗剂负载入EVs可显著增强疗效并减轻药物相关毒性。在RA中，间充质干细胞（MSC）来源的EVs已通过递送生物活性分子（如miRNAs、蛋白质）抑制滑膜炎症、调节免疫并保护骨和软骨，在动物模型中展现出疗效。在此基础上，研究人员已成功工程化MSC-EVs以携带多种载荷——从传统药物（甲氨蝶呤）和核酸（siRNA）到天然产物（雷公藤红素）。该策略利用囊泡对炎症组织的天然趋化性，确保药物靶向递送至关节炎性关节，增强局部药物浓度并同时减少全身副作用，为RA提供了强效且精准的疗法。

微RNA（miRNAs）是一类内源性小型非编码RNA，长度约为22个核苷酸，作为基因表达的关键转录后调控因子发挥作用。其失调在RA发病机制中起重要作用。临床前研究表明，靶向特定miRNAs具有潜在治疗策略价值，如抑制促炎miR-155或恢复miR-146a功能。目前，MSC来源的EVs已成为一种有前景的治疗途径，主要通过递送其载货miRNAs（包括miR-124a、miR-146a、miR-150-5p和let-7b），这些miRNAs具有抗炎和免疫调节特性。这些miRNAs通过抑制异常成纤维样滑膜细胞增殖、减少促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）产生以及恢复T细胞和B细胞反应平衡来发挥免疫调节作用。值得注意的是，无论这些miRNAs是由MSCs自然分泌还是通过工程方法主动装载，它们都能实现协同多靶点治疗并增强疗效。

石蒜胺（LYC）是一种天然异喹啉生物碱，主要从石蒜属植物（如红花石蒜和郁金香）中分离获得，已对其抗肿瘤和抗病毒特性进行了广泛研究。其显著的抗炎和免疫调节活性也引起了自身免疫性疾病和炎症性疾病潜在应用的关注。值得注意的是，LYC已被证明通过抑制NF-κB和MAPK通路等关键炎症信号通路来减轻关节炎症、肿胀和骨破坏。然而，其直接临床转化受到脱靶不良效应阻碍——如细胞毒性、胃肠道刺激和潜在心脏毒性——归因于其广泛机制和缺乏组织特异性。如上所述，在分离MSC-EVs之前用药物预处理MSCs可实现"增效减毒"的效果。为克服LYC的上述局限性，本研究用LYC预处理MSCs并收集制备LYC-MSC-EVs。LYC-MSC-EVs不仅保留了LYC和MSC-EVs的联合抗炎功能，还利用了EVs的靶向能力、低免疫原性和软骨保护特性。该方法通过实现精准递送来达到"增效减毒"，从而最大限度减少LYC的直接不良效应同时增强治疗效果。我们的策略为开发基于天然产物和小分子化合物的精准RA疗法提供了有前景的新方向。

微RNA-6538（miR-6538）是一种具有功能重要性的非编码RNA，与多种疾病通路相关。来自miRNA分析和实验验证研究的新兴证据表明，miR-6538在肠道缺血/再灌注损伤、糖尿病心肌病（DCM）和辐射诱导组织损伤等病理模型中表现出显著失调，使其成为多种临床状况的潜在诊断生物标志物和治疗候选分子。值得注意的是，比较高通量结果揭示LYC-MSC-EVs中miR-6538相比常规MSC-EVs上调超过20倍。这一独特的分子特征强烈提示miR-6538作为LYC-MSC-EVs观察到的增强抗关节炎活性的关键介质。我们的实验数据表明LYC-MSC-EVs在体外模型和体内RA系统中均展现出显著治疗功效。机制上，miR-6538通过NF-κB通路调节驱动PD-L1下调，有效减少促炎细胞因子产生并减轻滑膜炎症。这种双重调控机制有助于在CIA小鼠模型中明显缓解RA相关病理病变。

这些发现不仅验证了工程化细胞外囊泡的治疗潜力，还突出了炎症性关节炎管理的一种新型植物化学物-EV组合方法，为自身免疫性疾病的精准医学提供了平台。

## 方法

### 细胞培养与LYC预处理

小鼠间充质干细胞（m-MSC）、人间充质干细胞（hu-MSC）、RAW264.7、L929和THP-1细胞购自ATCC。m-MSCs、hu-MSC、RAW264.7和L929在含10%新生牛血清（FBS）的Dulbecco改良 Eagle培养基（DMEM）中，于37°C、5% CO?条件下培养。THP-1在含10%新生牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO?条件下培养。传代5-15代的m-MSCs和hu-MSC用1μmol LYC（纯度>98%）预处理。

### 细胞外囊泡（EVs）的表征与内化

采用上述提取方法从经LYC处理或未处理的MSC中分离EVs。透射电子显微镜（TEM）分析显示，MSC-EVs和LYC-MSC-EVs均呈现典型的圆形形态和完整的脂双层膜结构。纳米流式细胞术（NanoFCM）表征进一步证实MSC-EVs和LYC-MSC-EVs均具有特征性的囊泡尺寸分布，粒径范围为50至150 nm。

## 讨论

MSC-EVs已成为一种有前景的治疗策略，在治疗癌症、类风湿关节炎、神经和心血管疾病以及免疫调节方面具有重大潜力和优势。与指南推荐的RA一线药物相比，MSC-EVs具有更高的生物相容性、更低的免疫原性和更优的组织靶向性，能够高效递送至炎症关节滑膜，降低治疗风险。

## CRediT作者贡献声明

屈元晴：验证。许玉林：验证。王雨平：验证、调查。Jürgen Hescheler：撰写——审阅与编辑。张定齐：调查。秦波：验证。许雄飞：验证、调查、概念化。杨九杰：方法论。杨晨旭：撰写——审阅与编辑。郑硕：验证、调查。高杰：验证。Vincent Kam Wai Wong：撰写——审阅与编辑、监督、资源、项目管理、概念化。陈乐怡：（贡献内容缺失）。

## 数据可用性

数据可通过合理请求获得。数据可通过通讯作者以合理请求方式获取。

## 伦理批准与参与同意

所有受试者在纳入前均已由所有法定监护人签署书面知情同意书。本研究经澳门医学与科技研究协会伦理委员会批准（批准编号：MUST-FDCT-20260205001）。

## 出版同意

所有法定监护人在纳入前已签署出版同意书。

## 利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

## 资助

本研究由澳门科学和技术发展基金（FDCT）资助（项目编号：0004/2025/AIJ；002/2023/ALC）。

## 利益冲突声明

? 作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在利益冲突：Vincent Kam Wai Wong报告获得了FDCT的资金支持。如有其他作者，他们声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

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郑五燕 | 许雄飞 | 杨晨旭 | 王雨平 | 张定齐 | 陈乐怡 | Jerome P.L. Ng | 郑硕 | 高杰 | 王志康 | 吴万雨 | 屈元晴 | 秦波 | 杨九杰 | 许玉林 | Jürgen Hescheler | Vincent Kam Wai Wong

Dr. Neher药物发现创新生物物理实验室，中药机制与质量国家重点实验室，澳门科技大学中药学系、药学院，中国澳门特别行政区