幼虫时期的味觉暴露会引发成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）在特定化合物作用下的行为变化

《iScience》：Larval taste exposure creates compound-specific behavioral modifications in adult Drosophila melanogaster

　　研究亮点：
- 幼虫期接触罂粟碱会减弱成年后对罂粟碱的回避行为
- 罂粟碱诱导的味觉可塑性具有化合物特异性和味觉器官特异性
- 成年后的味觉变化需要幼虫阶段的苦味感知以及mlSEZt神经元
- cAMP依赖的记忆通路支持跨变态期的味觉可塑性

摘要：
动物辨别味道的能力对于选择营养物质和排斥潜在有毒物质至关重要。年龄、饮食、环境和内部状态等因素也会影响与食物相关的行为结果。其中一个因素——早期发育过程中对味觉信号的暴露——目前了解甚少。在本研究中，我们探讨了幼虫时期的味觉体验如何影响黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）成年的进食偏好。研究发现，幼虫期接触苦味生物碱罂粟碱会减弱成年果蝇对罂粟碱的回避行为。这种行为改变具有化合物特异性，仅发生在接触罂粟碱的情况下，而对其他测试的苦味物质没有影响；同时，这种改变具有选择性，其他苦味物质的进食偏好并未改变。研究结果表明，幼虫的苦味感知功能、味觉投射神经元以及环腺苷酸（cAMP）-磷酸二酯酶dunce在支持这种行为改变中起关键作用。这些发现共同表明，早期接触苦味化合物的经历可以通过特定的感觉和神经回路组件改变味觉相关的行为。

引言：
在不同物种中，味觉通过促进营养物质的摄入和毒素的避免来指导重要的进食决策。尽管天生的味觉反应已被很好地研究，但味觉感知具有高度的可塑性，能够适应环境变化、营养状态和先前的感觉体验。味觉感知能够动态调整以适应营养物质的可用性，从而维持体内平衡。重要的是，发育阶段会影响生物体的感觉可塑性：在生命早期，动物通过强大的神经和解剖学变化快速整合环境信息。然而，早期味觉体验如何影响成年后的进食行为的具体通路仍不清楚。
早期生活中的感觉体验对成年后的进食偏好有长期影响。研究表明，哺乳动物在产前或出生后早期接触某些味道会深刻影响其后的饮食选择；最近的研究还发现，让断奶的小鼠接触蔗糖会长期增强对蔗糖的偏好，因为这会干扰岛叶皮层中的抑制性回路。同样，昆虫幼虫接触某些化学信号后也会表现出成年后的行为改变。相比之下，幼虫体验对成年行为的味觉驱动条件作用研究较少。一些蛾类物种会根据幼虫时期的经历改变产卵基质的选择，这表明味觉可能是影响成年行为的潜在途径。然而，观察到的行为变化在变态过程中的彻底重组中如何持续存在仍不甚明了。
最近的研究揭示了跨变态期行为持久性的复杂机制。尽管大多数幼虫期神经连接在变态过程中会丧失，但行为信息可以通过三种不同的方式持续存在：神经重塑以维持功能、转分化以服务于替代回路，以及蛹期发育期间的解剖重组。关键的是，这些研究表明，跨变态期的行为效应不需要神经的直接持续存在，而是可以通过重建功能等效回路的发育程序来实现。此外，研究发现幼虫微生物群暴露可以通过Gr66a+神经元的阶段特异性需求来影响成年果蝇的味觉反应，这为味觉发育的关键时期效应提供了直接证据。研究发现，幼虫发育的前48-72小时是味觉回路编程的关键窗口，无菌果蝇会完全失去对细菌肽聚糖的味觉反应。
幼虫时期的味觉体验还可能通过表观遗传机制影响成年后的行为，从而在变态过程中形成稳定的分子记忆。研究表明，幼虫的营养条件会通过蘑菇体中的组蛋白修饰引起成年后多巴胺信号的持久变化，而G9a介导的组蛋白甲基化则通过染色质重塑调节行为差异。这些表观遗传途径可能为味觉记忆提供分子基础，使其能在变态过程中复杂的神经重组中存活下来。

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是一个多用途的模型，可用于探讨这些问题。该果蝇的味觉系统包括专门的感觉神经元（如感知糖分的GRNs和感知苦味的GRNs），能够对各种类型的味觉物质产生强烈的反应，并在过去二十五年中在行为和分子水平上得到了广泛研究。在成年果蝇中，联想性味觉学习涉及蘑菇体中的多巴胺能输入等明确的中枢回路。其他形式的味觉可塑性可能源于外围感觉神经元的适应和习惯化，这些过程可能涉及更高层次的神经元回路。最近的连接组学分析表明，味觉回路在二阶神经元处具有明显的模式特异性分离，但在三阶神经元处实现跨模式的整合，为理解早期味觉体验如何影响成年回路功能提供了解剖学框架。
尽管像黑腹果蝇这样的全变态昆虫在变态过程中经历了剧烈的解剖学和神经系统重组，但幼虫时期的食物相关感觉体验仍能影响成年后的行为。已有研究表明，幼虫期接触某些化学物质后会影响成年后的行为反应。然而，关于这种跨变态期效应的机制和特异性仍存在一些关键问题未得到解决。例如，幼虫接触厌恶性化合物是否总是会增加成年后的回避行为，还是可以通过习惯化机制减弱这种效应？这种效应是否适用于所有厌恶性化学物质，还是化合物特异性效应反映了特殊的神经回路或分子机制？苦味回路的下游成分如何控制对再次接触的反应？
值得注意的是，尽管大多数幼虫期感觉神经元（除了咽部GRNs）在变态过程中会丧失，但味觉信息似乎能够跨变态期持续存在。此外，变态过程中蘑菇体的巨大重组表明，任何持久的解剖学痕迹都需要复杂的分子机制来保持功能相关性。生态学考虑进一步支持了发育期味觉可塑性的生物学意义。在自然环境中，幼虫几乎整个发育期都浸泡在富含味觉线索的营养环境中，这使得研究味觉体验如何影响长期进食决策在生态学和神经生物学上都非常重要。
在这里，我们利用黑腹果蝇来探讨幼虫时期接触厌恶性味觉物质是否以及如何改变成年后的进食行为。我们使用三种苦味化合物建立了发育期暴露范式，并通过多种行为测试来表征成年后的反应。通过遗传学方法（包括突变体分析、靶向神经元沉默和时间控制系统），我们研究了行为改变所需的神经回路。主要发现表明，幼虫时期接触罂粟碱（PAP）会以化合物特异性和味觉器官特异性的方式减弱成年后的PAP回避行为，这种效应至少持续两周。遗传解析实验揭示了幼虫发育期间Gr33a+苦味GRNs、苦味投射神经元（mlSEZt、mediolateral SEZ tract）和环腺苷酸（cAMP）信号通路（dunce和amnesiac）的需求，以及涉及Obp49a（气味结合蛋白49a）和GABA（γ-氨基丁酸）信号的苦味-甜味整合通路。单感觉细胞记录（SSRs）进一步表明，幼虫期接触PAP可能会减弱甜味神经元的反应。值得注意的是，接触其他苦味化合物（诺斯卡品[NOS]和十氯芬[DEN]）并没有产生自我减弱的效果，反而增强了成年后的PAP回避行为，揭示了化合物间的相互作用。这些发现表明，特定的早期味觉体验可以以特定于味觉物质的方式产生持久的行为改变，并为研究跨变态期味觉体验传递的精确细胞和分子基础提供了可行的模型。

结果：
- 幼虫期接触苦味物质会以特定于环境和剂量的方式减弱回避行为
我们使用了三种代表先前选择实验中不同回避反应水平的苦味化合物来研究幼虫期接触这些化合物的影响。通过这种方法，我们研究了在含有咖啡因（CAF）、PAP或DEN的培养基中饲养的野生型果蝇成年后对这些化合物的行为。这些化合物在之前的选择实验中分别引发了低、中和高的回避反应。当幼虫达到游走第三龄期或开始化蛹时，我们收集并清洗它们，然后转移至含有标准食物培养基的培养管中。我们的对照组“天真组”在整个发育过程中都接触标准培养基，处理方式相同，包括在转移至含有标准食物的羽化培养管之前清洗晚期幼虫和早期蛹（见STAR方法）（图1A）。

图1：幼虫期的接触以特定于味觉物质、剂量和性别的方式减弱回避行为
- （A）饲养和实验流程示意图，包括暴露模型。幼虫在实验培养基中饲养至第三龄期末/化蛹，清洗后转移至羽化室（含有对照培养基的培养管）。羽化后2-4天，饥饿的果蝇在二进制选择环境中进食2小时。通过肠道解剖来评估食物偏好。
- （B–D）雌性（上）和雄性（下）在200 mM蔗糖和混合有不同浓度PAP（♀ [n = 4–46]，♂ [n = 3–45]）、CAF（♀ [n = 10–12]，♂ [n = 11–12]）或DEN（♀ [n = 3–12]，♂ [n = 3–12]）之间的进食偏好（PI，偏好指数）。条形图和误差条代表平均值 ± 标准误（SEM）。所有剂量-反应曲线均通过双向方差分析（two-way ANOVA）后进行?ídák多重比较测试。每张图右侧标出了饲养效应的统计测试；特定剂量处的星号表示天真组和暴露组之间存在显著差异。?p < 0.05 和 ??p < 0.01；ns = 无显著性（p > 0.05）。

我们在2-4日龄的成年果蝇中进行了剂量反应实验，让它们在200 mM蔗糖和含有苦味化合物的蔗糖之间进行选择。我们选择这种选择范式是因为苦味物质在低浓度下就能被检测到；我们预测高浓度可能会掩盖行为变化，因为高浓度可能会产生绝对回避。在整个剂量-反应图中，PAP饲养的雌性果蝇对蔗糖-PAP混合物的回避程度低于天真组，而雄性也有类似但不显著的趋势（图1B）。值得注意的是，PAP饲养的雌性果蝇对2 mM PAP的反应与天真组对0.5 mM PAP的反应相似，表明在这一浓度范围内有大约4倍的差异（图1B）。在CAF培养基中饲养的幼虫导致成年雄性的CAF敏感性降低，但雌性没有（图1C）。幼虫期接触DEN并未在任一性别中产生可检测到的敏感性变化（图1D）。总体而言，幼虫期的接触效应具有化合物和剂量特异性，可能存在性别间的浓度依赖性差异。

- 持久的敏感性变化与发育毒性或化合物持久性无关
我们研究了观察到的行为敏感性变化是否反映了发育过程中摄入苦味物质可能产生的生理后果。接触PAP、DEN和CAF的幼虫的化蛹率与对照组幼虫相当（图2A），表明变态过程正常启动。在苦味环境中饲养的幼虫成年后的羽化频率也与对照组相似（图2B），并且从卵孵化到羽化的时间在各种培养基之间没有显著差异（图2C）。由于在苦味环境中饲养可能会影响幼虫的进食行为，我们接下来使用比色消耗测定法研究了幼虫食物摄入是否受到含有苦味化学物质的环境的影响（图2D）。我们发现，接触PAP和CAF的食物摄入量与对照组没有差异，尽管接触DEN的食物摄入量略有增加。这些结果表明，我们的苦味饲养条件不会对生存、发育时间或幼虫食物摄入产生不利影响。

- 苦味饲养不会引起毒性或在变态过程中产生显著的化学物质持久性
（A–D）在含有对照培养基（CD）或添加了1 mM PAP、DEN或CAF的培养基中饲养的果蝇的（A）化蛹率、（B）羽化率、（C）发育时间和（D）食物摄入量（n = 6–10）。
- （E和F）8–10天（n = 7–15）或30–32天（n = 7–9）龄的果蝇在200 mM蔗糖和含有2 mM PAP的蔗糖之间进行选择的进食偏好（PI，偏好指数）。果蝇在幼虫期分别接受CD（天真）或含有1 mM PAP的CD（PAP暴露）。
- （G）通过质谱法测得的雌性（左）和雄性（右）组织的平均PAP检测峰值（n = 2–4）；峰值由PAP的标准保留时间确定。所有条形图代表平均值 ± 标准误。发育、消耗和质谱数据（A–D和G）均通过Welch’s ANOVA和Dunnett’s T3多重比较测试进行分析。行为数据（E和F）通过Welch’s t检验进行分析。?p < 0.05和???p < 0.001。鉴于果蝇的进食行为会随着年龄的增长而变化，因为代谢成本和能量需求也随之变化，我们接下来测试了这些敏感性差异是否会随时间持续存在。我们在二元选择实验中测试了在含有PAP处理过的食物中饲养的8至10天大的成年果蝇，比较它们对200 mM蔗糖与200 mM蔗糖+2 mM PAP的偏好。此时，距离上次接触PAP已经过去了12-14天，暴露于PAP的果蝇仍然显著地比未接触过的同龄果蝇更少避开蔗糖/PAP混合物（图2E）。虽然30-32天大的PAP饲养雌性果蝇对PAP的回避反应有所减弱，但并未达到统计学上的显著性（图2F）。因此，幼虫时期接触PAP的影响会持续到成年期，但正如先前研究中所描述的那样，这种影响可能会随时间而逆转。之前提出的“化学遗产”假说认为，来自幼虫环境的微量化学物质可能会在整个变态过程中留在昆虫体内，并影响其行为反应。原则上，我们的饲养和处理协议通过对收集到的幼虫和蛹进行彻底冲洗来处理外部化学残留物。然而，我们无法排除动物摄入的微量化学物质可能影响成年后行为的可能性。对整个成年果蝇体的质谱分析显示，与空白样本相比，在暴露于PAP的雌性和雄性果蝇中没有检测到与PAP相关的峰值（图2G）。相比之下，在幼虫和成虫阶段都持续接触PAP的果蝇显示出显著更高的检测峰值。这些发现表明，由PAP饲养引起的行为变化不太可能是由于成年组织中残留的化学物质所致，尽管我们承认这种方法存在检测限。

先前有研究表明，果蝇会减少其口器伸出反应（PER），这是接受味道的迹象，并且会对厌恶性味道物质作出反应而收回口器。为了更好地理解幼虫时期的苦味暴露如何影响成年后的进食行为，我们询问了在PAP环境中饲养的果蝇在唇瓣受到刺激时是否表现出改变的PER反应（图3A）。我们测试了含有从0 mM到2 mM PAP不同浓度的蔗糖混合物，以随机顺序呈现刺激以防止反应条件反射。在雌性和雄性果蝇中，PAP饲养的果蝇在唇瓣受到刺激时的PER频率显著高于未接触PAP的果蝇（ANOVA p [rearing] < 0.0001）（图3B和3C）。

**图3 幼虫时期PAP暴露会导致口器伸出反射中的苦味脱敏反应**
**图例说明：**
(A) 唇瓣口器伸出反应（PER）实验示意图，其中刺激物被呈现给固定在移液管尖端内的果蝇。
(B and C) 成年雌性（B）和雄性（C）在所示味道物质刺激下的PER指数（n = 14–22）。
(D) 足须PER实验示意图，其中刺激物被呈现给固定在显微镜载玻片上的果蝇的足须，通过其胸部的背面进行刺激。
(E and F) 成年雌性（E）和雄性（F）在所示味道物质刺激下的PER指数（n = 11–18）。果蝇在幼虫时期被给予对照组饮食或含有1 mM PAP的对照组饮食。数据点代表每组的平均PER频率±SEM。PER数据通过双因素ANOVA分析后进行?ídák多重比较检验。每个图表右侧标明了饲养效应的统计测试；特定剂量下的星号表示有显著的成对差异（?p < 0.05和???p < 0.0001）。ns = 不显著（p > 0.05）。

不同外周器官发出的味觉信息具有特定的投射模式，这表明对于不同的输入源可能存在专门的处理回路。为了确定行为中对苦味的敏感性变化是否特定于唇瓣味觉回路，我们进行了足须引发PER实验，评估了足须感受器受到刺激时的口器伸出反应（图3D）。当我们刺激足须时，PAP饲养的果蝇与未接触PAP的果蝇在PER上没有差异（图3E和3F）。这一发现与幼虫时期PAP暴露会导致特定器官味觉敏感性变化的观点一致。

考虑到在PER实验中观察到的唇瓣特异性味觉敏感性变化，我们探讨了幼虫时期PAP经历是否会影响与唇瓣使用相关的进食行为特征。利用果蝇液态食物互动计数器（FLIC），我们测量了果蝇与食物来源的互动持续时间和频率。我们测试了在含有200 mM蔗糖或200 mM蔗糖+0.1 mM PAP的溶液中饲养的PAP饲养或未接触PAP的雌性果蝇。PAP饲养的果蝇与蔗糖-PAP溶液的互动频率更高，并且互动时间也更长（图4A–4C），这表明它们的趋化感觉介导的接近行为增加。

**图4 幼虫时期PAP暴露会增强成年果蝇对含PAP食物的接近行为**
**图例说明：**
(A–C) 成年雌性在FLIC实验中仅给予200 mM蔗糖或含有0.1 mM PAP的蔗糖混合物时的微观进食参数。图表显示：(A) 总舔舐次数，(B) 平均互动事件持续时间，(C) 每只果蝇的总互动次数（n = 47–103）。
(D and E) 每15分钟在指定食物表面上记录的果蝇分布（n = 7–17）。果蝇在幼虫时期被给予对照组饮食或含有1 mM PAP的对照组饮食。所有数据显示平均值±SEM。互动数据（A–C）通过Mann-Whitney检验进行分析。停留数据（D, E）通过双因素ANOVA和?ídák多重比较检验进行分析。星号表示未接触PAP组和接触PAP组之间的显著差异（?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, 和 ????p < 0.0001）。

先前的研究表明，当果蝇在不同底物之间进行选择时，味觉输入会影响其对底物的偏好。因此，我们询问在PAP暴露的果蝇中观察到的行为敏感性变化是否改变了停留行为。我们将雌性果蝇群体放置在含有蔗糖或蔗糖-PAP混合物的两种琼脂基质上，并每15分钟计数停留在每种基质上的果蝇数量，持续2小时。当提供给蔗糖和蔗糖+PAP混合物时，PAP饲养的果蝇在两种基质上的停留次数更多（图4D），表明在含有PAP的环境中接近/停留行为增加。重要的是，当果蝇在蔗糖与水之间进行测试时并未观察到这种效应（图4E），这表明PAP暴露并不普遍增加活动或蔗糖驱动的停留行为。在PAP可用的环境中，PAP饲养的果蝇可能会表现出更强的趋化感觉介导的接近行为，可能是通过降低对PAP的行为敏感性，尽管环境影响的特异性仍需进一步研究。

**图5 幼虫时期苦味暴露引起的改变具有味道物质特异性**
在果蝇中观察到了苦味反应的异质性，表明不同的苦味化合物可能会招募不同的行为机制。早期接触PAP是否会减弱对其他苦味化合物的反应？相反，接触任何一种苦味化合物是否足以减少对PAP的回避？为了解决这些问题，我们在含有三种苦味化学物质之一的培养基中饲养了果蝇：PAP、NOS或DEN。NOS和PAP都是苯基异喹啉alkaloids，具有典型的罂粟衍生物骨架，而DEN是一种合成衍生的阳离子（图5A）。

**图5 幼虫时期苦味物质暴露对成年果蝇进食反应的影响具有不对称性和味道物质依赖性**
**图例说明：**
(A) 罂碱（PAP）、诺斯卡品（NOS）和苯乙基异喹啉（DEN）的化学结构。PAP和NOS具有共同的苯基异喹啉骨架。
(B) 在幼虫时期被给予对照组饮食（未接触PAP）或含有2 mM NOS（NOS暴露）或0.5 mM DEN（DEN暴露）的果蝇的进食偏好（ Preference Index, PI）；果蝇在二元选择实验中面对200 mM蔗糖与200 mM蔗糖+2 mM NOS（n = 9–45）（左）或200 mM蔗糖+0.5 mM DEN（n = 3–9）（右）的选择。
(C–F) 经过幼虫时期交叉暴露处理的果蝇在面对NOS、DEN或PAP时的进食偏好（PI）和口器伸出反应（PER指数）。所有数据显示平均值±SEM。n = 3–47（PI）和n = 8–11（PER指数）。根据数据的正态性，PI比较使用Welch’s t检验或Mann-Whitney检验进行。PER剂量-反应曲线通过双因素ANOVA和?ídák多重比较检验进行分析。?p < 0.05, ??p < 0.01, 和 ???p < 0.001。

与PAP类似，DEN和NOS在未接触PAP的果蝇中也能引发强烈的回避反应，但与PAP不同，幼虫时期接触DEN或NOS并未减少成年果蝇对相应化合物的回避行为（图5B）。为了测试幼虫时期PAP暴露如何影响成年果蝇对其他苦味化合物的反应，我们在含有PAP的培养基中饲养了果蝇，并测试了它们对NOS在选择和PER实验中的反应。PAP暴露的果蝇在面对NOS时表现出与未接触PAP的果蝇相似的强烈厌恶行为（图5C）。接下来，我们探讨了PAP暴露对成年果蝇对另一种结构不同的苦味物质DEN的反应，并再次观察到幼虫时期PAP经历对成年果蝇对DEN的反应没有明显影响（图5D）。相反，当我们在幼虫时期接触NOS的果蝇中测试成年果蝇对PAP的反应时，我们观察到PAP的回避行为增加（图5E）。在对蔗糖+PAP混合物的反应的PER分析中，线性回归分析显示NOS暴露的果蝇的曲线截距显著更低，这与二元选择实验中的回避增加一致（图5E）。DEN饲养的果蝇在回避PAP方面也表现出类似的改变（图5F），并且与未接触PAP的果蝇相比，其对蔗糖+PAP溶液的PER也有所降低（图5F）。这些结果揭示了两种化合物特异性的发现：首先，成年果蝇对PAP的回避减少需要特定的幼虫时期PAP暴露；其次，幼虫时期接触其他苦味化合物似乎增强了而不是减少了成年果蝇对PAP的回避。

**图6 幼虫时期的暴露依赖性行为变化涉及味觉通路**
为了确定味觉通路在经历诱导的进食行为改变中的作用，我们研究了苦味激活和甜味抑制的作用，这两种过程都由各种苦味物质参与。Gr33a在苦味GRNs中广泛表达，并在幼虫和成年果蝇中发挥作用，有助于感知苦味化合物。Gr33a突变体对PAP的GRN反应减弱。因此，我们询问这些PAP感知受损的果蝇是否仍然表现出改变的行为敏感性。在选择实验中，未接触PAP的Gr33a突变体在我们的实验条件下仍然表现出强烈的PAP回避行为，这与部分破坏了苦味感知一致。然而，PAP暴露的Gr33a突变体不再能够减弱其回避行为（图6A）。

**图6 幼虫时期暴露对行为变化的影响涉及味觉通路**
**图例说明：**
(A and B) (A) Gr33a/Gr33a; +/+ (Gr33a) 和 Gr32aMI04430/Gr32aMI04430; +/+ (Gr32a) 和 Gr66a/Gr66a; +/+ (Gr66a) 突变体在200 mM蔗糖与200 mM含有2 mM罂碱（PAP）混合物之间的进食偏好（PI）。(n = 10–12)
(B) UAS-Kir2.1/+; Gr33a-GAL4/+ 果蝇在200 mM蔗糖与200 mM含有3 mM PAP的混合物之间的进食偏好（PI）。(n = 12–13)。
(C and D) Obp49a/Ob49a; +/+ (Obp49a) 和 Gr64f-Gal4/+; UAS-GABA-B-R2 RNAi/+ 果蝇在200 mM蔗糖与200 mM含有2 mM PAP的混合物之间的进食偏好（PI）。(n = 8–15)。
(E) 在幼虫或成年特异性沉默Gr33a GRNs的情况下，UAS-Kir2.1/tub-Gal80TS; Gr33a-Gal4/+ 果蝇在所示温度下的进食偏好（PI）。(n = 11)。
(F and G) 来自(F) S6感受器（n = 6–9次记录，4–6只昆虫）或(G) 选定的L感受器（n = 19–26次记录，5–10只昆虫）的单一感受器尖端记录结果，这些感受器用30 mM柠檬酸三辛酯刺激。
在(A?E)的实验中，果蝇在幼虫时期被给予对照组饮食或含有1 mM PAP的对照组饮食。所有数据显示平均值±SEM。二元选择实验（A–E）通过Mann-Whitney检验进行分析。单一感受器反应（F and G）通过双因素ANOVA和?ídák多重比较检验（F）或Dunnett’s T3进行成对比较（G）。数据（G）在应用Box-Cox变换后进行了平方根转换。?p < 0.05 和 ??p < 0.01。

由于未接触PAP的Gr33a突变体仍保留了显著的PAP回避行为，我们接下来考虑了其他共受体的参与。在另外两种广泛表达的苦味共受体Gr32a和Gr66a的突变体中，无论是否在苦味环境中饲养，都观察到了对PAP的弱回避反应，并且PAP饲养并未影响这两种基因型的回避反应强度（图6A）。随后，我们使用Gr33a-Gal4来驱动内向整流钾通道Kir2.1的表达，进行了神经元沉默实验。当面对200 mM蔗糖和200 mM蔗糖+2 mM PAP的选择时，未经沉默处理的Gr33a果蝇对蔗糖/PAP混合物只有轻微的厌恶反应（图S1A）。将PAP浓度提高到3 mM时，未经沉默处理的果蝇表现出强烈的厌恶反应，但幼虫期接触PAP并未影响这种选择行为（图6B）。综合这些结果，我们表明对PAP的行为反应变化依赖于正常的苦味介导的神经回路（GRNs）活动。苦味物质还通过抑制甜味感知的GRNs来影响味觉系统。例如，Obp49a是气味结合蛋白（Obp）家族的成员，它在味觉器官的辅助细胞中表达，可能通过将苦味化学物质传递给甜味受体来抑制甜味感知；值得注意的是，这种抑制机制不需要苦味GRNs的激活。在PER检测中，Obp49a突变体在蔗糖背景下对不同浓度的PAP表现出强烈的反应，这与甜味感知受抑制的现象一致（图S1B）。在我们的选择实验中，经过幼虫期暴露于PAP的Obp49a突变体并未表现出行为反应的减弱（图6C）。除了直接抑制甜味GRNs外，苦味物质还通过突触前GABA能抑制作用来减弱甜味GRNs的活性。GABA-B受体在甜味Gr64f+ GRNs中表达，但在苦味GRNs中不表达，它们在苦味GRNs激活后接收来自GABA中间神经元的抑制性信号。我们在Gr64f+ GRNs中敲低了GABA-B受体的表达，发现幼虫期在含PAP的食物中饲养并不会导致成年后对PAP的回避反应减弱（图6D）。这些结果表明，幼虫期暴露引起的行为反应变化依赖于多种苦味介导的途径的正常功能：苦味GRNs的激活、通过Obp49a的直接抑制以及间接的GABA介导的抑制作用。

我们的饲养实验使动物在幼虫期接触到苦味化学物质。接下来，我们研究了苦味GRNs活性在何时对感觉敏感性的变化是必需的。利用TARGET（时间和区域基因表达靶向）系统，该系统中的泛表达温度敏感蛋白GAL80在18°C时会抑制GAL4的表达，而在29°C时则不会。我们以时间受限的方式在Gr33a+ GRNs中表达了Kir2.1。在幼虫期被沉默处理过的果蝇成年后无法减弱对PAP的回避反应（图6E，左）。相比之下，尽管成年后苦味GRNs被沉默处理，但具有完整幼虫期苦味GRNs活性的果蝇表现出预期的PAP回避反应减弱（图6E，右）。这些发现表明，幼虫期对苦味的感知对于成年后对相同苦味刺激的反应变化是必需的。

在确认苦味感知和甜味抑制途径都对于幼虫期PAP暴露后的效应减弱是必需的基础上，我们进一步探讨了这种暴露如何调节成年味觉神经元的生理反应。通过单感觉器尖端记录技术，我们测量了S6感觉器（代表含有广泛调谐的苦味GRNs的S型感觉器）和选定的L型感觉器（L3–4和L7–9，代表缺乏苦味GRNs的感觉器）对蔗糖和PAP混合物的反应。PAP饲养并未改变S6感觉器对1 mM或2 mM PAP的反应（图6F）。对于L型感觉器，我们测量了它们对单独蔗糖或含有不同浓度PAP的混合物的反应。总体而言，我们发现幼虫期PAP暴露对L型感觉器对蔗糖/PAP混合物的反应有微小但显著的影响（图6G）。在未经处理的果蝇中，对100 mM蔗糖+2 mM PAP的反应明显低于对纯蔗糖的反应，而在暴露于PAP的果蝇中，任何蔗糖/PAP混合物均未显著改变反应。由于如果我们仅分析L7–L9感觉器，则未发现两者之间的差异，这表明L型感觉器的反应可能并不均匀受到影响。这些结果提示，幼虫期PAP暴露可能减少了某些成年GRNs中对甜味的抑制作用。

苦味投射神经元和cAMP依赖的记忆途径影响了依赖经验的味道感知调整。味觉信息在大脑中整合，以影响未来的食物选择和优化代谢稳态与生存。那么，哪些神经元负责将幼虫期的味觉信息传递给成年果蝇以影响其行为结果呢？先前的研究已经确定了两种功能性的苦味投射神经元群体，TPN3和mlSEZt。Janelia FlyLight数据库的数据表明，只有mlSEZt神经元同时存在于幼虫期和成年期。与TPN3在幼虫期苦味信号传递中无功能作用相符的是，沉默TPN3神经元并未影响幼虫期PAP暴露的后果（图7A）。相比之下，沉默mlSEZt神经元则阻止了PAP暴露果蝇通常表现出的回避反应减弱（图7B），这表明mlSEZt在幼虫期的活动对行为脱敏有贡献。

图7 行为依赖的PAP效应减弱需要功能性的苦味投射神经元和cAMP相关的记忆信号传递。图注：(A–C) +/+；R11H09-GAL4/+ (TPN3-GAL4), UAS-Kir2.1/+; R11H09-GAL4/+ (TPN3 > Kir2.1), +/+ (A); R29F12-GAL4/+ (mlSEZt-GAL4), UAS-Kir2.1/+; R29F12-GAL4/+ (mlSEZt > Kir2.1) (B), dnc/dnc; +/+; +/+ (dunce), 和 amn/amn; +/+; +/+ (amn) (C) 果蝇在200 mM蔗糖和含有2 mM罂粟碱（PAP）的混合物之间进行选择。（n = 6–12）。(D) dnc-GAL4/+; UAS-dncRNAi/+; tub-GAL80TS/+ 果蝇在特定温度下使用GAL80TS沉默dunceRNAi的情况（n = 8–10）。(E) 幼虫期经历依赖的脱敏模型。PAP抑制甜味感知，被苦味GRNs检测到，后者抑制甜味处理。幼虫期暴露可能触发需要dunce途径和mlSEZt+投射神经元活动的突触变化，导致成年后回避反应减弱。

在(A–D)的实验中，果蝇在幼虫期被给予对照组饮食（未经处理）或含有1 mM PAP的对照饮食（PAP暴露）。条形图表示平均值±标准误差（SEM）。所有数据均通过Mann-Whitney检验进行分析。*p < 0.05。

由于mlSEZt神经元投射到较高层次的大脑区域，如上侧原脑（SLP）和侧角（LH），这些神经元传递的味觉信息可能导致这些区域的突触变化，进而影响未来的食物选择。这类突触变化可能与学习和记忆相关的分子机制有关。因此，我们研究了两个与记忆相关的基因dunce和amnesiac在介导幼虫期影响成年进食行为中的作用。dunce突变体缺乏在突触修饰过程中降解cAMP的磷酸二酯酶，因此在幼虫期PAP暴露后无法改变成年后的反应（图7C）。amnesiac突变体在神经肽合成方面受损，控制cAMP的产生，同样无法表现出幼虫期经历依赖的行为变化（图7C）。这些发现与 taste neurons 下游的可塑性在编码经验效应中的作用一致，尽管没有直接证明这一点。接下来，我们研究了在果蝇首次遇到改变的饮食条件时，记忆相关基因表达是否在幼虫期是必需的。使用TARGET系统，我们在幼虫期选择了性地敲低了dunce的表达，结果发现果蝇无法减弱成年后的PAP回避反应（图7D），表明在幼虫期需要完整的记忆巩固途径来支持成年后的行为变化。

我们报告了幼虫期味觉感知如何通过对特定苦味化合物的反应来改变成年后的进食行为。我们的研究描述并验证了一个用于功能分析的味觉暴露模型，以研究成年果蝇味觉反应的预成虫期调节机制。行为、生理和代谢分析表明，幼虫期接触PAP（一种苦味异喹啉生物碱）足以通过涉及苦味感知和记忆相关途径的机制来减弱先天性回避反应。针对Gr33a+ GRNs功能、mlSEZt神经元群体和dunce表达的实验共同表明，有一条通路将外周的PAP感知Gr33a+苦味GRNs与这种经验的下游处理联系起来。下游处理似乎需要mlSEZt投射神经元的活性和dunce介导的记忆巩固（图7E）。由于我们使用的遗传工具影响了广泛的神经元群体，需要进一步的研究来确定记忆记忆与其他过程的特定作用。

我们的实验模型提出了重要的机制问题。我们发现，幼虫期接触PAP会导致成年后对同一化合物的行为反应变化，但DEN或NOS则不会引起这种变化。几种假设值得考虑：首先，所测试的浓度范围可能没有涵盖DEN诱导行为变化的最佳动态范围；其次，不同的苦味化合物可能在幼虫期味觉器官内和之间招募不同的受体和GRNs，这可以解释化合物特异性的可塑性；第三，跨化合物暴露的不对称效应可能反映了苦味感知途径之间的相互作用或抑制机制的差异性招募。确定区分PAP感知与其他苦味物质的特定调节受体和神经元可能有助于进一步研究这种表型的配体特异性。观察到这种可塑性似乎与发育过程中遇到的化学物质身份相关，这表明果蝇能够适应特定的持久性毒素，同时不牺牲整体的保护性回避行为。此外，早期生活压力因素（包括营养限制和氧化应激）已知会导致成年后感觉生理和行为的持久性变化。尽管具有推测性，但这些机制强调了化合物特异性或跨化合物暴露导致不对称效应的额外途径。

观察到的性别差异需要仔细解释。PAP暴露效应在雌性中最为显著，而CAF暴露效应在雄性中特异。唇须味觉棒和跗节味觉毛在感觉器数量和受体表达上存在性别差异。然而，这些解剖学差异是否解释了观察到的行为差异尚不清楚。其他解释可能包括对生物碱的代谢敏感性存在性别差异、激素对味觉敏感性的影响，或性别特异性的发育时间效应。这些差异的分子基础是未来研究的重要领域。几种机制可以解释依赖经验的进食行为调节。虽然已经证明苦味感知GRNs在成年后长期和短期暴露下都会脱敏，但PAP介导的S6感觉器中的苦味神经元反应似乎不受幼虫期PAP饲养的影响（图6F）。虽然其他苦味GRNs也可能受到幼虫期暴露的影响，但这一观察结果与成年后苦味GRNs活性似乎不是行为变化必需的发现一致。此外，幼虫期饲养期间需要苦味神经元的活性，这表明虽然饲养可能不会改变苦味神经元的响应能力本身，但发育过程中的苦味感知输入对后来的行为调节是必需的。GRN的脱敏不太可能通过Gr33a的变化来实现，因为我们没有观察到对其他依赖于Gr33a的苦味物质的普遍影响。然而，Gr33a还标记了咽部GRNs，这些神经元在变态过程中保持完整，且我们条件性沉默Gr33a+神经元时同时影响外部和内部群体的反应，因此观察到的行为脱敏也可能反映了咽部的变化。未来的研究将需要区分咽部与唇须输入在改变进食偏好中的相对贡献。有趣的是，L型感觉器的记录表明，幼虫期PAP饲养可能会影响甜味感知的抑制（图6G）。虽然未来研究需要进一步解析不同感觉器类的贡献，但结果表明发育期间的暴露可能直接或间接地扰乱了苦味物质介导的甜味神经元活性的调节机制。

第二，中央的回避通路控制器可能通过反复暴露而习惯化，这与我们发现的dunce和mlSEZt神经元的作用一致。第三，经典奖励条件反射可能是由于将苦味刺激与幼虫食物的营养特性配对，从而形成持续到成年的正向关联。第四，表观遗传修饰可能产生跨越变态期的分子记忆，正如最近的研究所示，饮食诱导的染色质变化会影响行为。跨变态期的行为持久性的挑战仍然是一个核心谜题。大多数幼虫期味觉神经元在变态过程中不会存活，而在此期间会发生广泛的蘑菇体重组。然而，几种机制可能促成信息传递。咽部味觉神经元中的许多神经元在变态过程中存活，代表了潜在的味觉记忆解剖学基础。或者，幼虫时期的味觉体验可能诱导表观遗传变化，这些变化会影响成年后的神经回路发育，从而在味觉通路中的神经元或辅助成分上产生解剖学或功能上的差异。最近的证据表明，通过突触重构可以持续记忆回路，这为理解幼虫时期的体验如何影响成年行为提供了一个框架，而无需直接的神经连续性。生态学考虑支持了发育过程中的味觉可塑性的生物学相关性。在自然环境中，发育中的昆虫会接触到多种植物次生化合物，包括生物碱，其浓度会因宿主植物和季节而异。根据早期暴露情况调整行为反应的能力可能为资源质量波动的环境提供适应性优势。因此，测试具有生态相关性的植物衍生味觉物质浓度非常重要，理想情况下应在自然复杂刺激的背景下进行，以进一步探究幼虫时期体验引发的行为变化的生态相关性。

总之，我们的工作建立了一个模型，用于研究早期味觉体验如何影响果蝇的成年行为。我们观察到的化合物特异性效应表明了发育过程中味觉可塑性的复杂机制，而记忆相关通路的上映表明这种机制可能与其他形式的经验依赖性行为修饰具有保守性。我们的研究为未来理解发育过程中味觉可塑性的机制及其对变态过程中行为编程的更广泛影响奠定了基础。

**研究的局限性**
我们的工作提供了关于发育暴露后味觉行为修饰的关键见解，但必须承认几个局限性。首先，我们的结论主要基于行为测试，并辅以一些外周生理记录。其次，尽管我们的研究集中在三种苦味化合物上，但效应的特异性需要在涵盖多个化学类别的更广泛味觉刺激组中进行验证。第三，我们没有检查由长期暴露引起的分子水平变化，如基因表达或染色质修饰，这留下了一些关于机制途径的未解之谜。第四，应考虑其他解释：我们报告的行为变化可能反映了早期化学暴露的非特异性效应，而不是特定的味觉可塑性。例如，轻微的发育压力可能会诱导补偿性的进食行为变化，表现为明显的味觉改变，而我们观察到的跨化合物效应可能反映了发育中的味觉通路之间的相互作用，而不是特定的可塑性机制。尽管存在这些局限性，我们的发现为未来研究感官行为的发育可塑性及其对理解早期体验如何塑造成年行为库的更广泛影响提供了基础。

**资源可用性**
关于资源和试剂的更多信息及请求，请联系负责人Anupama Dahanukar（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究没有生成新的独特试剂。

**数据和代码可用性**
• 所有原始数据已存储在Mendeley Data上，并可公开获取：https://doi.org/10.17632/7sxh6df8pr。 Fly品系和化学标识符包含在关键资源表中。
• 本文未报告原始代码。
• 如需重新分析本文中报告的数据，可向负责人咨询以获取额外信息。

**致谢**
我们感谢Dahanukar和Ray实验室的成员提供的反馈。同时感谢S. Haga-Yamanaka、K. Abdulrazak、Y.C. Chen、M. Dey和A. Ganguly的有益讨论。这项工作得到了加利福尼亚大学河滨分校农业实验站、美国农业部国家食品与农业研究所（Hatch项目拨款号1011543）、教育部研究生国家需求援助奖以及加利福尼亚大学河滨分校（论文完成奖学金）的支持。

**作者贡献**
概念化：V.D.M.和A.D.
验证：V.D.M.
正式分析：V.D.M.
调查：V.D.M.、C.C.、M.V.-M.和A.D.
撰写-初稿：V.D.M.和A.D.
撰写-审阅和编辑：V.D.M.、C.C.和A.D.
可视化：V.D.M.
监督：A.D.
资金获取：V.D.M.和A.D.

**利益披露**
A.D.的配偶是两家初创公司Sensorygen Inc.和Remote Epigenetics Inc.的创始人兼总裁，并在UC Riverside提交的多个专利中被列为发明人。

**写作过程中的人工智能和技术使用声明**
在准备这项工作时，作者使用了Claude和ChatGPT 5.5来提高可读性并验证审稿人回应与手稿文本相应修订之间的一致性。作者审查并验证了所有手稿内容、解释和结论。没有使用任何AI工具进行数据分析、科学结论或图表生成。在使用这些工具后，作者审查并编辑了手稿，并对出版物的内容负全责。

**方法**
**关键资源表**
| REAGENT或资源 | 来源 | 标识符 |
| --- | --- | --- |
| 化学品、肽和重组蛋白 | Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 |
| 咖啡因 | Sigma-Aldrich | C8960 |
| 盐酸帕帕维林 | Sigma-Aldrich | P3510 |
| 苯甲酸苯扎托尼姆 | Sigma-Aldrich | D5765 |
| 盐酸诺斯卡品 | Sigma-Aldrich | N9007 |
| 靛红 | Sigma-Aldrich | I8130 |
| 硫罗夫罗达明B | Sigma-Aldrich | 230162 |
| 柠檬酸三胆碱 | Sigma-Aldrich | T0252 |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 |

**实验模型：生物/品系**
| D. melanogaster: CantonS | John Carlson |
| FlyBase: FBsn0000274 |
| D. melanogaster: Gr33a | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:31427; FlyBase: FBti0168370 |
| D. melanogaster: Gr32a | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:31427; FlyBase: FBti0168370 |
| D. melanogaster: Gr66a | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:6596; FlyBase: FBti001755 |
| D. melanogaster: Obp49a | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:55033; FlyBase: FBti016861 |
| D. melanogaster: UAS-Kir2.1 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:27699; FlyBase: FBti012888 |
| D. melanogaster: tubP-GAL80T | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:7019; FlyBase: FBti012888 |
| D. melanogaster: dnc | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:6020 |
| D. melanogaster: amn | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:5954 |
| D. melanogaster: UAS-dnc RNAi | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:78786 |
| D. melanogaster: R11H09-GAL4 (TPN3-GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:48478 |
| D. melanogaster: R29F12-GAL4 (mlSEZt-GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:49495 |

**实验设置细节**
- **幼虫暴露模型**：幼虫在含有1 mM指定苦味物质的标准饲料中饲养。除非另有说明，否则在25°C和12/12光暗周期下饲养。野生型实验使用Canton-S品系。其他突变体和转基因品系包括Gr33a、Gr32a、Gr66a、Gr33a-GAL4、UAS-Kir2.1、Obp49a、UAS-GABA-B-R2 RNAi、tub-GAL80ts、dunce、amnesiac、UAS-dunce RNAi、R11H09-GAL4 (TPN3-GAL4)和R29F12-GAL4 (mlSEZt-GAL4)。Gr32a和Gr66a突变体来自Hany Dweck博士；其他品系来自Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)。
- **处理饲料制备**：将标准饲料加热至重新悬浮状态，然后加入苦味物质溶液，直至达到最终浓度（用于暴露的所有苦味物质均为1 mM）。将果蝇加入处理过的饲料中并让其产卵。当它们进入第三期后期（表现为“游荡”现象，即从饲料中出来准备化蛹）或早期化蛹时，从处理过的瓶子中收集果蝇。用去离子水通过铝箔片上的孔冲洗果蝇。然后用画笔轻轻冲洗幼虫和蛹，直到水变清且没有食物残渣残留。再将幼虫和蛹转移到含有标准饲料的新瓶子中，让它们继续发育。
- **化蛹率测定**：交配后的Canton-S成年果蝇被允许在含有0.75%琼脂糖和200 mM蔗糖的培养基上过夜产卵。次日，用画笔在含有1 mM盐酸帕帕维林、1 mM苯甲酸苯扎托尼姆或1 mM咖啡因的标准果蝇饲料的瓶子中产卵。将瓶子置于25°C和50%湿度的培养箱中，每天监测每个瓶子中形成的蛹的数量。
- **羽化率测定**：实验设置与化蛹率测定相同，但增加了额外步骤。所有蛹形成后，计算每个瓶子中的蛹总数，并每天监测每个瓶子中羽化的成年果蝇数量。将成年果蝇数量标准化为每个瓶子中的初始蛹数量。
- **发育时间测定**：实验设置与羽化率测定相同，但增加了额外步骤。每天计算每个瓶子中羽化的成年果蝇总数。果蝇在播种后10天开始出现，并持续出现直到播种后12天。通过将出现天数乘以当天出现的成年果蝇数量再除以总出现果蝇数量来计算平均发育时间。
- **幼虫消耗测定**：交配后的Canton-S成年果蝇被允许在含有标准饲料或含有苦味物质（1 mM PAP、CAF或DEN）的饲料中产卵24小时。然后移除成年果蝇，将瓶子置于25°C和50%湿度的培养箱中。大约在产卵后4天，用20%蔗糖溶液将L3期幼虫从饲料中浮出，并放入含有标准饲料或含有苦味物质的60 x 15 mm培养皿中喂食1小时。所用饲料用Satin Ice Red Rouge Gel食用色素（0.75%）染红以追踪消耗率。喂食1小时后，用20%蔗糖溶液将幼虫从培养皿中浮出，并放入1.5 mL微量离心管中。
- **二元选择喂养测定**：喂养偏好测定按先前描述的方法进行，略有修改。除非另有说明，实验使用羽化后2-4天的果蝇。实验前24小时，16-20只果蝇（8-10只雌性+8-10只雄性）在含有浸湿Kimwipes的瓶子中禁食。向紧密贴合的培养皿中加入10 μL蔗糖或蔗糖/苦味物质溶液。每种食物选择分别用靛红（Sigma, #I8130）（0.25 mg/mL）或硫罗夫罗达明B（Sigma, #230162）染色。为了考虑染料偏好之间的相互作用，除了PAP的情况外，我们进行了染料替换。由于观察到帕帕维林会使靛红的可见性随时间减弱，因此所有含有帕帕维林的实验都使用靛红染色。果蝇在25°C和50%湿度的黑暗容器中喂养2小时。之后将培养皿冷冻，并解剖腹部进行视觉评分，按性别分组。每组中的至少50%的果蝇和每种性别的至少5只果蝇计入统计。
- **触角伸展反射（PER）测定**：实验前将果蝇在含有浸湿Kimwipes的瓶子中禁食24小时。对于唇瓣诱发的PER，将果蝇吸入预先切割的P200吸管尖端，以露出果蝇头部并固定胸部和腹部。然后将含有果蝇的尖端安装在显微镜载玻片上。使用大约1 mm厚的Kimwipes条带制成刺激物，并将其浸入味觉溶液中。对于跗节诱发的PER，将果蝇轻轻固定在显微镜载玻片上。刺激物是通过P10移液器尖端呈现的。在两个实验中，首先给苍蝇提供足够的水分以确保它们的伸展行为不是由于脱水引起的。然后，它们在味觉测试板中对每种化学物质进行了三次测试。每次实验前，味觉测试的顺序对实验者是隐藏的，并且会被随机打乱。对200 mM蔗糖这种阳性对照没有表现出积极反应的苍蝇以及那些在连续给予水后仍然伸展的苍蝇被排除在分析之外。对于每个符合条件的苍蝇，通过将正面伸展的次数（0、1、2或3次）除以3来计算其对每种味觉物质的反应率。对200 mM蔗糖没有反应或对水持续表现出积极反应的苍蝇也被排除在分析之外。

**FLIC测定**
Fly Liquid Interaction Counter（FLIC）测定在单食物选择或二元选择环境中进行。数据来自三个Drosophila Feeding Monitor（DFM）板。配对的雌性苍蝇在装有浸湿的Kimwipes的小瓶中禁食24小时。2-4天大的苍蝇被测试1小时。前5分钟的数据被排除在分析之外，以适应苍蝇进入DFM的过程。FLIC数据使用Pletcher实验室提供的脚本进行分析。

**质谱**
所有的质谱实验都在UC Riverside代谢组学核心设施进行。代谢物分析使用的是TQ-XS三 quadrupole质谱仪（Waters），该质谱仪与I-class UPLC系统（Waters）相连。分离过程使用的是ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 x 100 mm，1.7 μM）（Waters）。流动相分别为：(A) 含0.1%甲酸的水和(B) 含0.1%甲酸的乙腈。流速为250 μL/min，柱温保持在40°C。进样量为1 μL。梯度设置如下：0分钟时98% A；0.1分钟时98% A；2.5分钟时2% A；8分钟时2% A；8.1分钟时98% A；12分钟时98% A。代谢物的保留时间为2.93分钟。质谱仪以多反应监测模式运行。检测到了来自母离子340.30的跃迁202.10和171.04。源温和脱溶温度分别为150°C和600°C。脱溶气流速设置为600 L/hr，锥形气流速设置为150 L/hr。碰撞气流速设置为0.15 mL/min。所有气体均为氮气，除了碰撞气体是氩气。在正离子模式下，毛细管电压为1 kV。通过每六次进样分析一个质量控制样品（由所有样品提取物等体积混合而成）来监测系统稳定性。样品按随机顺序进行分析。

**细胞外记录**
成年苍蝇唇基味觉感受器的细胞外记录是按照先前的方法使用Syntech TastePROBE和IDAC4数据采集系统以及Autospike软件进行的。简要来说，苍蝇被固定后，一个装有Ringer溶液的玻璃参考电极通过胸部和口器插入唇基。味觉刺激物溶解在30 mM三羟基柠檬酸中，并使用玻璃记录电极施加到单个感受器的尖端。记录来自选定的L型感受器以及作为苦味神经元反应代表性的S6感受器。每次刺激接触大约持续2-3秒，对同一感受器施加不同刺激之间间隔超过1分钟。神经反应通过计数反应开始后的500毫秒内的动作电位来量化，并转换为每秒的尖峰数。对于L型感受器的记录，在统计分析之前对尖峰数进行了平方根转换。这种转换是基于对L型感受器数据集的Box-Cox分析选择的，该分析估计λ值约为0.67，置信区间不包括1但包括0.5，因此支持使用平方根转换。同样的分析方法不支持S型感受器数据集的转换，因为其置信区间包括1，表明不需要进行转换。

**定量和统计分析**
对于每个实验，我们首先使用Kolmogorov-Smirnov检验来分析数据的分布。如果分布呈正态分布，则除非另有规定，否则我们继续使用Welch’s t检验或Mann-Whitney U检验来处理两组数据。对于多维数据集（变量包括饲养条件和浓度），我们进行了双向方差分析（2-way ANOVAs），随后使用Sidak的成对比较来进行后续分析，以比较每种剂量下的饲养条件。每个实验的样本量在相应的图例中报告，每个图表的精确统计测试、测试统计量和p值在表S1中列出。

**补充信息（2）**
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文档S1：图S1
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表S1：统计分析总结