《Journal of Virology》：Protein kinase D1 regulates innate immune signaling pathways to promote hepatitis C virus replication
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丙型肝炎病毒（HCV）已进化出多种机制破坏宿主天然免疫应答以促进其复制。蛋白激酶D1（PKD1）是一种参与细胞增殖与脂质代谢的丝氨酸/苏氨酸激酶。研究人员通过分析PKD1对HCV复制的影响发现，HCV在感染早期经蛋白激酶C（PKC）激活PKD1，并在感染后期经
丙型肝炎病毒（HCV）已进化出多种机制破坏宿主天然免疫应答以促进其复制。蛋白激酶D1（PKD1）是一种参与细胞增殖与脂质代谢的丝氨酸/苏氨酸激酶。研究人员通过分析PKD1对HCV复制的影响发现，HCV在感染早期经蛋白激酶C（PKC）激活PKD1，并在感染后期经caspase-3诱导PKD1裂解。PKD1沉默不影响HCV进入细胞，但降低细胞内HCV RNA水平，表明PKD1在促进HCV复制中具有重要作用。PKD1沉默还可诱导干扰素（IFN）及IFN刺激基因（ISG）表达，并增强HCV诱导的TNF-α表达，从而加强IFN应答。值得注意的是，缺失PKD1时HCV感染细胞中炎症小体（inflammasome）的诱导受损，表明PKD1在促进炎症小体应答中具有重要作用。综上，结果表明HCV激活PKD1以抑制IFN应答与TNF-α信号，同时诱导炎症小体应答。这些结果揭示了HCV与宿主天然免疫之间有趣的交互作用，以及PKD1在这一复杂交互中的重要作用。
重要性部分指出，HCV在多数感染者中建立慢性感染，可导致脂肪变、肝硬化和肝细胞癌等严重肝病。PKD1调控脂质代谢、细胞增殖和凋亡。研究人员发现HCV可激活PKD1抑制干扰素应答与TNF-α信号以促进复制，同时增强炎症小体应答，为理解HCV持续感染与致病机制提供重要见解。
《Journal of Virology》发表的该研究围绕丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）与蛋白激酶D1（protein kinase D1，PKD1）的相互作用展开。当前研究中，HCV如何破坏宿主天然免疫建立慢性感染仍是关键科学问题；PKD1已知参与增殖、脂质代谢和高尔基体相关分泌，但其在HCV感染天然免疫调控中的角色尚不清楚。研究人员因此探究PKD1是否被HCV调控、如何影响抗病毒免疫及病毒复制，并进一步分析其机制。
研究结论显示，HCV感染早期经蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活PKD1，后期经caspase-3裂解PKD1；PKD1不依赖病毒进入或内部核糖体进入位点（internal ribosomal entry site，IRES）翻译，而是促进HCV RNA复制。PKD1通过抑制TBK1（TANK-binding kinase 1）/IRF3（interferon regulatory factor 3）/IFN轴削弱干扰素与IFN刺激基因（IFN-stimulated gene，ISG）应答，并通过抑制TNF-α及其受体TNFR1，降低IFNAR2（IFN-α and -β receptor subunit 2）水平，使细胞对I型IFN不敏感。同时，PKD1介导NLRP3样炎症小体活化，促进caspase-1、gasdermin D（GSDMD）裂解及IL-1β、IL-18成熟释放，诱导细胞焦亡（pyroptosis）。该研究的重要意义在于揭示HCV利用PKD1同时压制抗病毒IFN/TNF-α信号并放大炎症损伤的双重策略，为HCV持续感染与肝病进展机制提供新解释。
主要技术方法上，研究人员使用人肝癌Huh7细胞、原代人肝细胞（primary human hepatocytes，PHH）、稳定携带HCV亚基因组复制子（subgenomic replicon）的Sg-PC2细胞，以及CRISPR/Cas9构建的PKD1敲除Huh7细胞系KO-I613；采用siRNA敲低、外源PKD1回补、PKD特异性抑制剂CRT0066101、PKCδ抑制剂Rottlerin与激活剂PMA、caspase-3抑制剂z-DEVD-FMK处理；通过免疫印迹检测磷酸化与裂解事件，免疫荧光观察病毒感染早期核心蛋白定位，qRT-PCR定量HCV RNA、IFN与ISG转录本，双顺反子荧光素酶报告系统评估HCV IRES翻译活性。
研究结果如下。HCV induces the phosphorylation of PKD1：研究人员用HCV感染Huh7与PHH，发现感染早期PKD1在Ser738/742被磷酸化，PKCδ抑制或沉默降低磷酸化与核心蛋白，PMA增强磷酸化与病毒蛋白，说明PKC介导入早期PKD1激活且激活程度与HCV复制正相关。HCV-induced cleavage of PKD1 is mediated by caspase-3：用caspase-3抑制剂z-DEVD-FMK可抑制PARP与PKD1裂解，证明感染后期PKD1裂解由caspase-3执行。PKD1 enhances HCV infection：siRNA敲低、CRISPR敲除均降低HCV核心蛋白与基因组RNA，外源PKD1回补恢复复制，表明PKD1正向促进HCV感染。PKD1 enhances the replication of HCV without affecting the entry：免疫荧光显示2小时与4小时感染时野生型与KO细胞核心信号无差异，24小时KO细胞信号减弱；亚基因组复制子中PKD1抑制降低NS5B，IRES报告基因不受影响，说明PKD1作用于进入后、IRES翻译后的RNA复制步骤。PKD1 enhances HCV infection via inhibition of the TBK1/IRF-3/IFN pathway：KO细胞中p-TBK1、p-IRF3与总IRF3升高，IFN-αA5、IFN-β1、IFN-γ及MxA、ISG15、OASL表达增强，说明PKD1抑制TBK1/IRF3/IFN轴。PKD1 restricts the IFN response by inhibiting the production of TNF-α：KO细胞基础与HCV诱导的TNF-α均升高；TNF-α沉默削弱IFN-α对STAT1磷酸化与抗病毒效果；PKD1缺失提升TNFR1与IFNAR2、增强p-STAT1，表明PKD1通过压制TNF-α/TNFR1使细胞对I型IFN脱敏。PKD1 enhances the inflammasome response and pyroptosis to suppress IFN response：HCV在野生型细胞诱导成熟IL-1β、IL-18、caspase-1与GSDMD裂解，KO细胞中这些事件减弱，说明PKD1驱动炎症小体与焦亡。
讨论部分总结：研究人员指出，HCV早期激活PKD1抑制TBK1-IRF3-IFN与TNF-α-IFNAR2-STAT1通路，利于复制；后期裂解PKD1可能解除分泌抑制、促进子代病毒释放。PKD1对TNF-α的抑制与TNF-α经caspase-3反馈裂解PKD1形成平衡，决定感染细胞命运。PKD1介导的炎症小体活化与焦亡可被I型IFN/STAT1负向调控，同时焦亡促进炎症因子释放与肝组织损伤，也可能助长病毒颗粒排出。该工作把PKD1定位为HCV协调“免疫逃逸—炎症致病—病毒释放”的枢纽分子。
结论部分翻译：PKD1参与增殖、脂质代谢和高尔基体相关分泌过程。本研究表明HCV感染早期经PKC激活PKD1，后期经caspase-3裂解PKD1；PKD1不影响HCV进入或IRES活性，但在完整感染与亚基因组复制子中均促进HCV RNA复制。HCV通过激活PKD1抑制TBK1与其下游效应分子IRF3，减少IFN与ISG产生。除抑制IFN信号外，HCV还经PKD1抑制TNF-α，间接削弱TNF-α支持的IFNAR2与I型IFN敏感性。PKD1同时介导炎症小体应答，促进成熟IL-1β与IL-18产生及GSDMD裂解所驱动的焦亡。综上，HCV调控PKD1以压制抗病毒应答并放大炎症应答，这解释了为何多数HCV感染者无法清除病毒并最终发展为严重肝病；早期PKD1促进复制与免疫逃逸，晚期PKD1裂解有利于子代病毒释放与组织损伤。
