低pH诱导的刺突蛋白构象变化通过增强病毒与猪氨基肽酶受体的结合效率促进猪丁型冠状病毒感染

《Journal of Virology》：Low-pH-induced conformational changes in the spike protein promote porcine deltacoronavirus infection by enhancing viral binding efficiency to the porcine aminopeptidase receptor

　　

猪丁型冠状病毒（PDCoV）是一种重要的肠道病原体，可引起新生仔猪严重腹泻，其首要传播途径为粪-口传播。然而，PDCoV适应宿主酸性胃环境的分子机制仍不清楚。本研究表明，模拟哺乳仔猪胃部微环境的低pH预处理（pH 4.0）可显著增强PDCoV在猪肠道上皮IPEC-J2细胞中的感染性，表现为病毒吸附、复制和子代病毒滴度升高。相应地，中和仔猪胃酸可有效减弱PDCoV在体内的感染性和致病性。在机制上，酸性pH诱导PDCoV刺突（S）蛋白发生具有重要功能意义的构象重排，从而显著提高其与细胞受体猪氨基肽酶N（pAPN）的结合亲和力，解离常数（K_D）从pH 7.2时的20.20 μM降至pH 4.0时的1.69 μM。研究人员解析了酸性条件下PDCoV S蛋白的高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）结构，这是首个在低pH条件下解析的丁型冠状病毒S蛋白结构。与中性pH下的闭合构象进行结构比较显示，低pH驱动S1 C末端受体结合结构域向外旋转14°，减少三聚体头部内的结构域间相互作用，产生一种介于完全闭合与完全开放状态之间的中间激活构象，而S2融合核心在结构上保持保守。这种pH依赖性构象预激活为具有亚基内S1结构域组装的α-和δ冠状病毒所共有，不同于β冠状病毒在内体中通过pH调控膜融合的机制，并代表了病毒对粪-口传播途径的一种进化适应。上述发现挑战了胃酸仅作为宿主防御屏障的传统观点，揭示了宿主生理环境在病毒感染中的预激活作用，为肠道冠状病毒生物学提供了新见解，也为防控策略提供了新靶点。

研究背景与科学问题

猪丁型冠状病毒（PDCoV）是一种经粪-口途径传播的猪肠道冠状病毒，可导致新生仔猪严重腹泻，对养猪业构成较大威胁，并具有跨种传播潜力。冠状病毒刺突（S）蛋白是介导受体识别和膜融合的关键蛋白。以往对S蛋白构象的研究主要集中于β和γ冠状病毒的“上/下”构象，而δ冠状病毒S蛋白仅观察到“下”构象，其受体结合结构域（RBD）如何在天然S三聚体中暴露并实现受体结合仍不清楚。PDCoV经口感染后需通过宿主胃部酸性环境，但低pH是否影响其感染性一直缺乏直接的分子机制证据。针对这一问题，研究人员系统研究了低pH对PDCoV感染性、S蛋白构象及受体结合的影响，并将结果发表于《Journal of Virology》。

研究人员通过细胞感染实验发现，pH 4.0预处理能显著增强PDCoV在猪肠道上皮IPEC-J2细胞中的感染性；随后利用仔猪体内模型证明中和胃酸可有效抑制PDCoV感染和致病性。在机制层面，低pH诱导S蛋白发生构象重排，显著增强其与猪氨基肽酶N（pAPN）受体的结合，从而促进病毒吸附。研究人员进一步解析了低pH条件下PDCoV S蛋白的冷冻电镜（cryo-EM）结构，首次揭示了δ冠状病毒S蛋白在酸性环境中的中间激活构象，提出“胃酸预激活”机制，为肠道冠状病毒感染机制和防控策略提供了新靶点。

主要关键技术方法

关键技术方法包括：利用pH 4.0或7.2预处理PDCoV后感染IPEC-J2细胞，结合间接免疫荧光、Western blot、RT-qPCR和TCID₅₀测定评估感染性；开展22头5日龄仔猪（来自无PDCoV感染/疫苗接种史商业猪场，随机分为Al(OH)₃处理组、PBS未处理组和未攻毒对照组）的胃酸中和攻毒实验；采用4℃病毒吸附实验结合共聚焦显微成像、pull-down、表面等离子共振（SPR）和ELISA检测S蛋白与pAPN的结合；利用cryo-EM解析低pH下S蛋白结构，并结合结构比对、界面面积分析和分子对接模拟阐明构象变化机制。

研究结果

低pH预处理显著增强PDCoV在肠道上皮细胞中的感染性

通过pH 4.0与pH 7.2预处理比较，pH 4.0组在感染后18 h的免疫荧光阳性区域比例、PDCoV N基因RNA表达水平和N蛋白表达量均显著升高；感染后6、12、18、24 h的子代病毒TCID₅₀滴度均显著高于对照组，证明低pH预处理可增强PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制和子代病毒释放。

中和胃酸可有效抑制PDCoV在哺乳仔猪体内的感染

5日龄仔猪经口服Al(OH)₃凝胶三次后胃内pH升至约6.9，高于PBS对照组的约4.5。攻毒后18 h和24 h，免疫组化显示Al(OH)₃组肠道组织病毒抗原显著低于PBS组，RT-qPCR也显示肠道组织PDCoV RNA水平显著降低，证明中和胃酸可有效抑制PDCoV在体内的感染和致病性。

低pH通过增强S蛋白与pAPN的结合效率促进病毒吸附

在4℃吸附实验中，pH 4.0预处理的病毒颗粒在IPEC-J2细胞表面的数量显著增多，且分别使用抗S和抗N抗体检测结果一致；pull-down实验显示pH 4.0处理后的S蛋白可拉下更多pAPN；SPR检测表明，S蛋白与pAPN结合的K_D由pH 7.2时的20.20 μM降至pH 4.0时的1.69 μM；ELISA也显示低pH处理组的结合活性呈剂量依赖增强。多维度实验一致证明低pH可提高S蛋白与pAPN受体的结合效率。

低pH处理PDCoV融合前S蛋白的冷冻电镜结构

研究人员利用ExpiCHO系统表达并纯化PDCoV S蛋白胞外域三聚体，经pH