nsp3 宏结构域 1（Mac1）突变在不损害体外复制的情况下减弱 PEDV 的体内毒力

《Journal of Virology》：Mutations in the macrodomain 1 of nsp3 attenuate PEDV virulence in vivo without impairing in vitro replication

　　

冠状病毒 nsp3 中保守的宏结构域1（Mac1）可逆转蛋白质的 ADP-核糖基化，并有助于病毒毒力。尽管 Mac1 已在多种冠状病毒中被表征，但它在猪流行性腹泻病毒（PEDV）中的作用仍然未知。由于 D445 和 N462 是多种 β 冠状病毒中功能重要的残基，研究人员在 PEDV Mac1 重组蛋白和感染性病毒中均引入了这两个残基的突变，并在体外（in vitro）和体内（in vivo）进行了分析。序列比对显示，N462 高度保守，而 D445 在猪冠状病毒中保守性较低。N462A 突变显著损害 Mac1 的 ADP-核糖结合和水解活性，而 D445A 的影响甚微。与野生型 PEDV 相比，两种 PEDV 突变体（icPC22A-nsp3-D445A 和 icPC22A-nsp3-N462A）在 Vero、猪肾 LLC-PK1 和猪肠上皮 IPEC-J2 细胞中的复制效率均与野生型一致。出乎意料的是，与先前表征的 SARS-CoV-2 和 MHV-JHMV 株的 Mac1 突变体相反，两种突变病毒在 LLC-PK1 和 IPEC-J2 细胞中诱导的干扰素（IFN）水平显著降低。此外，icPC22A-nsp3-N462A 病毒在 Vero 细胞中对 IFN-β 处理的敏感性显著降低。这些结果表明，PEDV Mac1 具有干扰素诱导因子的功能。在无菌新生仔猪中，与野生型 PEDV 相比，icPC22A-nsp3-N462A 的病毒脱落峰值降低且出现延迟，表型减弱。总之，这项工作首次提供了体外和体内证据，表明 PEDV Mac1 结构域中保守的 N462 残基对 ADP-核糖结合和水解、诱导 IFN 产生以及毒力均至关重要。然而，这些通路之间的联系值得进一步研究。

**论文解读：PEDV nsp3 宏结构域1（Mac1）的功能与减毒机制**

**研究背景与问题**：冠状病毒（CoVs）是重要的人兽共患病原，其中猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于α冠状病毒，感染各年龄猪，导致新生仔猪急性腹泻、呕吐和脱水，死亡率可高达100%。2013年高致病性PEDV在美国暴发并造成巨大经济损失，且目前对PEDV易感猪群仍缺乏有效疫苗。PEDV基因组编码的nsp3是最大的多结构域非结构蛋白，其中宏结构域1（Mac1）在所有已知冠状病毒中保守，可结合并水解ADP-核糖，逆转宿主蛋白的ADP-核糖基化，从而调节病毒与宿主互作。在β冠状病毒（如SARS-CoV、SARS-CoV-2、MHV）中，Mac1已被确认为关键毒力因子，其突变通常导致干扰素（IFN）应答增强和体内减毒。然而，Mac1在猪肠道或肠道型冠状病毒中的作用尚未明确。D445和N462是在多种β冠状病毒中功能重要的残基，分别参与ADP-核糖结合和水解。本研究针对这两个残基，旨在填补PEDV Mac1功能研究的空白。

**研究内容、结论与意义**：研究人员通过序列比对和结构预测分析PEDV Mac1中D445和N462的保守性与空间位置；构建野生型及D445A、N462A突变重组Mac1蛋白，测定其ADP-核糖结合亲和力与水解活性；利用PEDV感染性克隆icPC22A反向遗传系统拯救两种突变病毒，在Vero、LLC-PK1和IPEC-J2细胞中检测复制能力、IFN诱导水平及对外源IFN-β的敏感性，并在无菌新生仔猪中评估N462A突变体的致病性。结果表明，N462是PEDV Mac1功能所必需的残基，其突变显著降低ADP-核糖结合和水解活性、减少IFN诱导、降低体内毒力，但不损害体外复制。这一发现首次提供了猪肠道α冠状病毒Mac1的功能证据，并提示N462可作为PEDV减毒活疫苗设计及抗病毒药物开发的合理靶点。论文发表在《Journal of Virology》。

**主要技术方法**：研究人员使用AlphaFold2预测PEDV Mac1三维结构并借助AlphaFill进行ADP-核糖配体对接；采用基于荧光共振能量转移（FRET）的方法测定Mac1与单ADP-核糖基化GAP肽段的解离常数；通过dot blot法以MARylated SRPK2为底物检测ADP-核糖水解活性；利用反向遗传学在PEDV感染性克隆icPC22A中引入点突变并拯救病毒；结合RT-qPCR和RNA-seq分析病毒诱导的IFN及差异基因表达；体内实验使用3日龄无菌（gnotobiotic）新生仔猪，仔猪来源于剖腹产的PEDV阴性母猪，经口服接种100 TCID₅₀/头进行攻毒评价。

**研究结果**：

**1. D445和N462残基在PEDV nsp3的Mac1结构域中保守**
序列比对显示N462在所有冠状病毒中高度保守，而D445在猪冠状病毒中保守性较低：猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪呼吸道冠状病毒（PRCV）在对应位置为丙氨酸（A），猪丁型冠状病毒（PDCoV）为谷氨酸（E）。AlphaFold