整合三维光片与二维多重成像技术用于躯体小鼠胶质母细胞瘤的深度组织学表征

《iScience》：Integrated 3D light sheet and 2D multiplex imaging for deep histological characterization of somatic mouse glioblastoma

　　

## 摘要亮点

- 在一个胶质母细胞瘤体细胞小鼠模型中，对肿瘤在空间和时间上的生长进行三维分析
- 绘制小鼠中肿瘤及微环境细胞状态的空间蛋白质组图谱
- 将组织透明化、三维显微成像与二维多重成像整合到同一工作流程中

## 摘要

胶质母细胞瘤是一种极具破坏性的脑癌，数十年来患者生存率基本未发生实质性变化，凸显了改进疾病建模和分析工具的迫切需求。神经干细胞已被确定为胶质母细胞瘤的起源细胞，从而推动了体细胞谱系模型的发展。这类模型虽然在测序方面已被深入表征，但系统的组织学分析仍然有限。在此，我们提出了一种多模态组织学表征方法来研究胶质母细胞瘤体细胞小鼠模型。利用三维光片成像，我们表明该模型具有高度可重复性，并能够在队列水平上对肿瘤生长进行定量评估。通过MACSima?成像循环染色多重成像技术，我们绘制了肿瘤及其周围环境的细胞图谱和分子架构，并提供了一套经过筛选的适用于小鼠的抗体资源。最后，我们证明了组织透明化和光片显微成像能够与多重成像无缝结合，从而实现对预先界定的三维肿瘤进行空间蛋白质组表征。

## 图形摘要

## 引言

胶质母细胞瘤是大脑中最常见的恶性脑肿瘤，但目前仍缺乏有效疗法，中位生存期仍低于20个月。尽管数十年来研究不断，临床进展有限，凸显了对能更精准模拟疾病生物学的实验系统以及先进分析工具的需求。

侧脑室下区神经干细胞被确认为胶质母细胞瘤的起源细胞，为研究提供了切入点。事实上，体内电穿孔能够高效地操控位于脑室壁不同区域的神经干细胞，基于CRISPR-Cas9的体细胞谱系模型已被用于在完全免疫健全的小鼠中生成高级别IDH1野生型胶质瘤。这些基于神经干细胞的体细胞模型具有多种分析优势：它们从定义明确的细胞群体开始，允许在肿瘤微环境和更广泛的大脑实质中对癌细胞进行荧光谱系追踪，并保持完整的免疫相互作用。它们已被用于解析例如肿瘤启动的转录调节因子、侵袭边缘的生物学、脑浸润机制以及胶质母细胞瘤的免疫图谱。

因此，体细胞小鼠模型在胶质母细胞瘤研究中日益重要，凸显了对高效且可重复的分析方法的需求。批量测序和单细胞测序在此领域已被广泛使用，并提供了关于细胞群体和分子调控的宝贵见解。然而，对肿瘤发育从最早期阶段到跨越整个大脑的复杂三维肿瘤的深入组织学分析目前仍然稀缺。此外，对这类肿瘤及其周围微环境和宏观环境的蛋白质组景观的系统性认识有限，这在一定程度上是由于经过验证的小鼠特异性抗体的稀缺。

在此，我们提出了一套深入的组织学和空间分析框架，用于研究胶质母细胞瘤体细胞小鼠模型。利用脑电穿孔结合CRISPR/Cas9技术和PiggyBac重组，我们建立了一种肿瘤诱导系统，该系统再现了胶质母细胞瘤的经典组织病理学特征，并证明它允许从转化后的早期阶段研究肿瘤发生。利用组织透明化和三维光片荧光显微成像，我们追踪了肿瘤发育过程，并证明该模型具有快速、高度可重复且可在全脑尺度上进行定量测量的特点。随后，我们应用自动化循环免疫荧光染色生成了肿瘤和微环境细胞状态的全面空间蛋白质组图谱，为胶质母细胞瘤研究提供了一套经过筛选的有功能的、适用于小鼠的抗体资源。最后，我们表明基于光片显微成像的三维映射能够与后续的多重成像分析无缝整合，从而实现对预识别肿瘤区域进行最高空间精度的分子谱分析。

## 结果

### 通过电穿孔诱导胶质母细胞瘤

我们使用基于电穿孔的双质粒系统诱导脑肿瘤（图1A）。该方法同时灭活两个抑癌基因TP53和PTEN，并通过EGFRvIII过表达组成性激活表皮生长因子受体通路——这是一种与胶质母细胞瘤经典亚型相关的突变谱。具体来说，TP53/PTEN基因灭活由CRISPR/Cas9系统驱动，而PiggyBac转座酶系统介导第二个质粒的基因组整合，确保EGFRvIII和mCherry在所有靶向细胞及其谱系中高表达。

**图1 使用质粒电穿孔诱导胶质母细胞瘤**

**(A)** 电穿孔所用质粒的示意图。一个游离质粒携带CRISPR/Cas9系统，介导TP53和PTEN的灭活，并支持PiggyBac转座酶的表达，允许编码EGFRvIII和核mCherry基因的第二个质粒进行基因组整合。U6启动子驱动引导RNA的表达，而Cas9和hyPBase在Cbh启动子的控制下共同转录。EGFRvIII和nls-mCherry从单一转录单元表达，同样由Cbh启动子驱动。电穿孔后，只有被两个质粒靶向的细胞才会诱导永久表达mCherry的肿瘤（小箭头：U6启动子；大箭头：Cbh启动子）；sgRNA：引导RNA；hyPBase：高活性PiggyBac转座酶；PB：PiggyBac元件；P2A：P2A自切割肽；IRES：内部核糖体进入位点。

**(B)** 电穿孔后4周（4wpe）的脑冠状切片。星号标示侧脑室；箭头显示肿瘤细胞通过胼胝体侵入对侧大脑半球。

**(C)** 对照组（n=10）、EGFRvIII组（n=12）和TP53/PTEN/EGFRvIII组（n=11）小鼠的Kaplan-Meier生存分析。???：p<0.00001。

**(D–I)** 电穿孔后6周的脑冠状切片组织学分析。**(D–G)** 高倍放大下的苏木精-伊红染色显示坏死栅栏（E，箭头）、伴内皮细胞有丝分裂像的肾小球样血管（F，箭头）以及侵入胼胝体的肿瘤细胞（G，箭头标示迁移前沿）。**(H和I)** Ki-67（H）和Olig2（I）的免疫组织化学染色。cc：胼胝体；Cx：皮层；Sp：隔区；St：纹状体。比例尺，1000 μm（B和D）；50 μm（E、G、H和I）；20 μm（F）。

将两个质粒共电穿孔到衬覆前脑脑室的神经干细胞中，4周后在所有动物中形成大型mCherry阳性肿瘤。这些肿瘤延伸至同侧相邻结构，包括纹状体、胼胝体和隔区（图1B）。在大多数脑中，在较晚阶段，对侧半球也检测到荧光细胞，其中胼胝体似乎为主要浸润途径（箭头）。

生存分析显示，接受两个质粒的动物在电穿孔后约5周开始表现出疾病和死亡，并在随后的三周内病情加重（图1C）。相比之下，仅接受对照质粒或仅转染表达EGFRvIII的质粒和PBase的动物在观察期内未出现致死性（图1C）。

为了表征诱导的肿瘤，我们首先采用经典组织病理学。来自电穿孔后6周（肿瘤进展期）动物的代表性切片显示双侧半球广泛浸润和大范围组织病变（图1D，箭头）。高倍放大下可见坏死栅栏（图1E，箭头）和伴内皮-毛细血管增生的肾小球样血管（图1F；有丝分裂由白色箭头标示），后者是肿瘤血管生成的标志。在几只动物中，胼胝体内可见清晰的侵袭前沿（图1G，箭头），这与先前发现白质纤维束作为癌细胞主要浸润途径的结果一致。增殖标志物Ki-67和胶质标志物Olig2的免疫组织化学显示肿瘤内阳性细胞密度高（图1H和1I）。因此，该双质粒谱系模型有效诱导了再现胶质母细胞瘤IV期主要组织病理学特征的肿瘤。

### 肿瘤发育最早期的成像

由于靶向脑室壁神经干细胞的体内电穿孔提供了精确的起始点和定义明确的起源细胞群体，我们研究了转化后最早的细胞事件。胶质母细胞瘤诱导系统如前所述被电穿孔到侧脑室壁或背侧脑室壁。对于这些实验，胞质GFP被引入作为荧光标记，便于详细分析细胞大小和形态。

在对照条件下（图2A–2F），两种电穿孔方式后均观察到预期的出生后神经发生进程。电穿孔后2天，侧脑室下区存在具有放射状胶质细胞形态的GFP阳性神经干细胞（图2A），与先前观察到的出生后电穿孔特异性靶向该细胞类型的结果一致。此外，还检测到少数缺乏放射状突起的细胞，可能代表由初始靶向的神经干细胞衍生而来的增殖性传递扩增前体细胞（图2A–2D，红色箭头），这些前体细胞产生迁移性前体细胞，最终定位于嗅球。

**图2 胶质母细胞瘤诱导后早期细胞事件的表征**

电穿孔（侧壁：A–C及A′–C′；背侧壁：D–F及D′–F′）后显示GFP阳性细胞及其后代的代表性脑冠状切片，使用对照质粒（A–F）或胶质母细胞瘤诱导质粒（A′–F′）。动物分别在电穿孔后2天（A, A′, D, D′）、4天（B, B′, E, E′）或7天（C, C′, F, F′）处死。白色箭头标示放射状胶质细胞前体的突起；红色箭头显示迁移中的神经母细胞；红色箭头标示室管膜下区的可能神经元前体细胞；黄色箭头指向纹状体和皮层中具有多极形态的细胞，类似于预期的胶质细胞；白色箭头标示异常多极细胞；黄色箭头显示在对照组中从未观察到的细胞聚集体。通过EdU掺入定量LWE（G）或DWE（H）后靶向细胞的增殖率（对照或胶质母细胞瘤条件）。LWE（I）或DWE（J）后靶向细胞数量的定量。对照组：LWE n=11，DWE n=10；胶质母细胞瘤组：LWE n=15（n代表2次独立实验中小鼠总数），DWE n=5（1次实验中的小鼠数）。柱状图表示均值±标准误。统计检验（Mann-Whitney U检验）：?p≤0.05，??p≤0.01，???p≤0.001。比例尺，50 μm。cc：胼胝体，cp：脉络丛，Cx：皮层，lv：侧脑室，St：纹状体，SVZ：室管膜下区。

电穿孔后4天，侧脑室下区仍含有少量放射状胶质细胞样细胞（图2B，白色箭头），同时观察到具有迁移性嗅球神经母细胞特征的双极形态和切向定向的细胞（图2B，红色箭头）。相邻纹状体中偶尔出现的GFP阳性细胞可能代表室管膜下区来源的胶质前体细胞（图2B，黄色箭头）。在背侧室管膜下区，存在大量GFP阳性放射状胶质细胞型细胞（图2E，白色箭头），而表明神经元前体细胞存在的伸长形态则较为罕见，与该区较低的神经发生活性一致。上方皮层中的GFP阳性细胞可能对应室管膜下区来源的胶质前体细胞（图2E，黄色箭头）。

到电穿孔后7天，侧脑室（图2C）和背侧室管膜（图2F）下区仍含有大量GFP阳性细胞。其中一些表现出迁移性形态，与神经母细胞向嗅球迁移一致。散布在纹状体和胼胝体中的多极GFP阳性细胞可能代表新产生的胶质细胞（图2C–2F；黄色箭头）。

接下来我们检查了胶质母细胞瘤诱导条件下侧壁和背侧电穿孔的效果（图2A′–2F′）。电穿孔后2天，GFP阳性细胞几乎完全定位于室管膜下区，只有少数放射状定向的细胞位于上方的胼胝体中。细胞形态、定位和数量（图2A′、2D′、2I和2J），以及增殖率（图2G和2H），均与对照组相当。

然而，到电穿孔后4天，转化细胞表现出明显改变的分布。侧脑室和背侧室管膜下区中增殖的GFP阳性细胞比例均显著增加（图2G和2H），导致背侧壁沿线GFP阳性细胞总数更高（图2J）。值得注意的是，这种增加在侧壁未被检测到，可能是因为正常条件下侧壁在2至4天之间存在快速的神经发生分裂（图2I）。

在形态学上，侧脑室下区中转化的GFP阳性细胞不再表现出放射状胶质细胞或迁移性前体细胞典型的双极定向，而是表现出多个突起（图2B′，白色箭头），并倾向于形成聚集体，在纹状体边界处聚集（图2B′，黄色箭头）。在电穿孔后4天的背侧室管膜下区，放射状胶质细胞形态丧失、多突起表型获得和聚集形成更为显著（图2E′，白色箭头）。

到电穿孔后7天，这些异常被显著放大。

大量转形细胞聚集体沿侧脑室壁和背侧室壁累积（图2C′–2F′，黄色箭头），增殖显著增强（图2G和2H），LWE后多极细胞侵袭邻近的纹状体，DWE后还侵袭胼胝体和皮层（图2I和2J）。总之，将转形驱动突变引入SVZ NSCs迅速破坏了正常的神经发生，诱导了严重的异常，包括增殖增加、形态改变以及转形细胞在靶祖细胞区旁累积。这些早期事件标志着该模型中肿瘤起始的发生。

**肿瘤在时空中的生长**

为了系统地描述和量化GBM的整体生长，我们结合组织透明化和LSFM技术，实现了全脑肿瘤大小和形状的三维分析。小鼠通过LWE、DWE或内侧壁电穿孔（MWE）转染对照质粒或GBM诱导系统。组织透明化采用CUBIC方案，该方案可保留mCherry等标记蛋白的荧光。

电穿孔后一周（1 wpe），沿脑室壁出现小型mCherry阳性细胞簇（图3A和3A′；视频S1），与单独靶向的神经干细胞（NSCs）作为起源细胞一致。到2 wpe时，单个细胞簇融合成覆盖脑室壁并延伸至邻近结构的大型mCherry阳性团块，表明克隆融合为共同的肿瘤（图3B和3B′；视频S2）。在此后的两周内，肿瘤继续扩张，侵袭周围组织如嗅球（OB）和皮层（Cx）（图3C、3C′、3D和3D′；视频S3和S4）。DWE或MWE诱导的肿瘤表现出类似的生长和侵袭模式（图S1A–S1D）。

**图3 通过三维成像可视化肿瘤进展**

（A–D）针对侧脑室侧壁（LWE）电穿孔后1、2、3和4 wpe的半脑mCherry阳性肿瘤的LSFM成像三维视图。使用TOPRO3核染色（蓝色）可在脑中定位肿瘤位置。注意细胞密集的SVZ衬于脑室壁，以及代表SVZ向嗅球的头侧延伸的嗅球迁移流。

（A′–D′）mCherry信号分割后的对应三维图像，显示肿瘤表面。三维动画见视频S1、S2、S3和S4。

（E）LWE后1、2、3和4 wpe时肿瘤体积的生长情况。每个圆圈代表一只动物。每个时间点每种条件的平均体积以柱状图显示。比例尺，1000 μm。

视频S1. 1 wpe时实验性GBM的代表性三维投影
视频S2. 2 wpe时实验性GBM的代表性三维投影
视频S3. 3 wpe时实验性GBM的代表性三维投影
视频S4. 4 wpe时实验性GBM的代表性三维投影

肿瘤大小定量分析表明，在所分析期间，动物间的生长具有高度可重复性（图3E、S1C和S1D）。值得注意的是，与其他电穿孔模型相比，肿瘤发展——及随之而来的致死性（图1C）——相当迅速。这种快速进展可能是因为Cbh启动子驱动的EGFRvIII高表达水平，以及通过PiggyBac系统实现的多拷贝基因组整合。

**通过MICS进行多重成像分析**

为了深入了解诱导肿瘤的病理学细胞景观和分子组成及其微环境和宏观环境，我们使用基于MICS技术的超高含量成像，研究了在2 wpe时不同脑室壁诱导的肿瘤，此时观察到完全外显的致密GBM（图3B、S1A和S1B）。

最初，我们对来自LWE、DWE或MWE诱导肿瘤脑的5个不同切片测试了总共77种荧光素偶联抗体，其中大多数已在人体组织中验证但未在小鼠中验证。其中38个标记物在细胞水平显示出高质量染色，并在后续步骤中进行了深入分析（表1，单个图像见图S2）。

（表1翻译：MICS用的抗体面板表）

在对2 wpe时LWE诱导肿瘤的冠状切片进行分割和Z分数归一化后（图4A），我们使用MACsiQ软件（Miltenyi Biotec）根据经典标记物的表达定义了四个主要细胞群体：神经元（NeuN+，N = 7,264）、内皮细胞（CD105/endoglin+，N = 1,375）、髓样细胞（CD11b+，N = 1,584）和癌细胞（mCherry+，N = 4,037）。四个群体的表达谱分析（热图展示见图4B）证实，NeuN+细胞共表达神经元标记物如TH、突触素和CD171（L1-CAM）。CD105+内皮细胞显示血管相关标记物如CD146、CD34和EphA2的最高水平。CD11b+髓样细胞与免疫标记物如CD45、CD18、CD11c和CD169呈强相关性。最后，mCherry+癌细胞以肿瘤相关标记物包括CD44、Nestin、GFAP和P2X7R的稳健表达为特征。总体而言，每个细胞类型内的标记物聚类（聚类空间展示见图4C）是一致的，支持了分割和分类流程的准确性，进一步验证了该模型用于研究脑肿瘤及其相关微环境的适用性。

**图4 使用MICS进行高分辨率病理学分析**

（A）用于MICS分析的冠状切片，显示2 wpe时LWE诱导的肿瘤（T）。核mCherry可识别癌细胞。

（B）分割细胞中蛋白表达的热图展示。聚类通过初始门控神经元（NeuN）、血管细胞（CD105）、髓样细胞（CD11b）和mCherry（癌细胞）来定义。每个聚类中的细胞数量已标注。

（C）B中定义的四个细胞聚类的空间表示。

（D–H）超高含量成像可对肿瘤及其微环境进行详细的病理学概览。（D）显示用于B中聚类选择的标记物（NeuN、CD105、CD11b、mCherry）的肿瘤及其环境总览图像。神经丝（NF）被添加以突出轴突束。框选区域以高倍率在（E–H）中呈现。（E）MICS获得的高分辨率病理学示例，显示CD11b+髓样细胞（箭头）和CD105标记的血管（箭头）被mCherry+癌细胞包围。（F–H）经典肿瘤标记物（GFAP、Nestin、CD44、ITGA7、GLAST、CD133）在肿瘤中显示差异标记。比例尺，100 μm（A、C和D），20 μm（F–H），5 μm（E）。cc：胼胝体；Cx：皮层；lv：侧脑室；Sp：隔区；St：纹状体。

我们将个别标记物组合起来，以提供肿瘤以及其微环境和宏观环境的详细病理学概览。我们使用mCherry标记癌细胞（红色），CD11b标记髓样细胞（黄色），CD105标记血管内皮细胞（蓝色），NeuN标记神经元（绿色），神经丝标记轴突投射（洋红色；图4D；图4E中E区域的高倍率视图）。所有主要细胞类型均可区分，mCherry阳性癌细胞核与NeuN阳性神经元核之间存在清晰的分离和互补性（图4D和4E）。此外，髓样细胞和大直径血管在肿瘤区域内明显累积（图4D和4E）。通过DWE和MWE诱导肿瘤的冠状切片分析提供了复杂性和质量相当的图像（图S3A–S3D）。

接下来，我们关注经典肿瘤标记物的存在。与诱导肿瘤的星形胶质细胞起源（来自出生后NSCs）一致，GFAP在靠近侧脑室的肿瘤区域强烈表达，此处为转形细胞的起源位置，但在远端区域表达较弱。相比之下，Nestin是一种未分化脑细胞标记物，与高级别胶质瘤和较低的患者生存率相关，在整个诱导肿瘤中显示出强且均匀的染色，包括其侵袭边缘（图4F）。

同样地，CD44在整个肿瘤区域内广泛且均匀表达，这与其在人肿瘤细胞系和人GBM中的组成性表达一致（图4G）。相比之下，ITGA7在特定的肿瘤细胞群中显示最强表达，这与先前的发现一致，该发现将该整合素鉴定为GBM干细胞的标志物。

星形胶质细胞的谷氨酸-天冬氨酸转运体GLAST在肿瘤近脑室区域显示最强表达，并以较低水平延伸至远端区域（图4H），与GFAP的表达（图4F）相似。最后，CD133/prominin-1在衬于脑室壁的细胞上强烈存在，这与其在纤毛室管膜细胞亚群中的已知表达一致（图4H）。

接下来，我们检查了肿瘤免疫微环境（图5A–5E），并定量评估了髓样亚群在肿瘤不同区域及周围环境中的空间分布。CD45+/CD11b+的血源性细胞和脑驻留小胶质细胞在肿瘤核心内高度富集（图5A、5B、5B′和5F；对比图4D）。在此区室中，大量亚群还表达CD169，这与从循环中浸润的抗肿瘤的血液单核细胞来源巨噬细胞的存在一致（图5B″–5F；白色箭头）。在这些细胞中，少数群体还表达CD11c，可能代表树突状细胞或启动小胶质细胞（图5B?；白色箭头）。相比之下，CD11b+/CD11c+双阳性细胞（图5B–5B?；洋红色箭头）在此肿瘤阶段仅检测到极低水平（图5F）。

**图5 使用MICS对GBM标志物进行高分辨率病理学分析**

（A–F）肿瘤免疫微环境。

（A）用mCherry（癌细胞）、CD11b、CD169和CD11c标记的切片总览。框选区域界定B–E中以高倍率展示的区域。（B）肿瘤内视野的高倍放大。如预期，CD11b阳性细胞共表达CD45，这是髓样细胞的通用标记物和活化髓样细胞的标记物（B′）。髓样细胞亚群通过CD169（B″）和CD11c（B?）的存在来识别（白色箭头）。箭头指示不表达CD11c的CD11b+；CD169+细胞。洋红色箭头显示CD11b+/CD11c+细胞。（C–E）核心肿瘤周围视野的高倍放大，此处单个癌细胞侵入脑实质。髓样细胞通过CD11b和CD45共标记在C中识别（白色信号；星号）。（F）髓样细胞亚群在五个不同ROI中的分布（左侧显示），包括核心肿瘤内（#1、2）、肿瘤边缘（#3、4）和包含少量癌细胞的周围实质（#5）。

（G–J）肿瘤相关血管新生。（G）泛内皮标记物CD105的表达揭示了肿瘤内比周围实质更高的血管密度。框选区域在H和I中以高倍率展示。（H）与CD105相比，CD146在肿瘤相关血管中的表达相对更强于非肿瘤血管。（I）EphA2局限于肿瘤，与CD105阳性内皮细胞上的表达相关（箭头）。血管周围弥漫性染色代表其他细胞的EphA2表达。H和I中的虚线代表肿瘤边界。（J）使用不同血管标记物定量肿瘤内外的血管密度（n = 12 ROIs；ROI描述见M&M）。

（K–N）肿瘤细胞侵袭。（K）被神经丝（NF）染色识别的纤维束包围的肿瘤（mCherry）总览。框选区域界定L–N中以高倍率展示的视野。（L和M）沿神经纤维迁移。（L）在胼胝体中，癌细胞与L1CAM和NF阳性轴突纤维对齐。一些CD11b阳性髓样细胞存在于被侵袭的胼胝体中（箭头）。（M）在核心肿瘤边缘，mCherry+/EGFR+癌细胞与纹状体NF标记识别的轴突束相关。（N）沿血管迁移。在隔区，单个mCherry+/EGFR+癌细胞与CD105表达的血管内皮细胞紧密结合（白色箭头），并由CD169表达的外周肿瘤相关巨噬细胞伴随（蓝色箭头）。比例尺，250 μm（A、F、G和K），50 μm（H、I、L和M），10 μm（B–B?、N），5 μm（C、D和E）。cc：胼胝体；lv：侧脑室；Sp：隔区；St：纹状体。柱状图表示平均值±SEM。统计学：**** = p值<0.0001（Mann-Whitney U检验）。

除了肿瘤核心外，髓样细胞还存在于侵袭边缘，此处单个mCherry+癌细胞浸润周围实质（图5C–5E）。在这里，CD45+/CD11b+细胞的存在（图5C）表明对侵袭癌细胞的早期免疫识别。

CD11b+/CD169+细胞的数量低于肿瘤核心区域，而CD11b+/CD169+/CD11c+细胞极为罕见（图5D-5F）。因此，肿瘤免疫微环境包含空间有序分布的驻留小胶质细胞和浸润髓系细胞的混合体，且其标志物谱从肿瘤核心到侵袭边缘呈梯度变化。随后，我们研究了与血管生成相关的标志物表达，这是胶质母细胞瘤（GBM）的另一大特征（图5G-5J）。CD105（Endoglin）在大脑各区域的血管上均强烈表达，且肿瘤区域的表达水平显著高于非肿瘤脑组织，这与预期的血管新生高度活跃相一致（图5G-5J）。CD146的表达在肿瘤内与CD105大量重叠（图5H，箭头所指），但在周围正常脑实质的血管上表达水平明显较低（图5H-5J），这提示该VEGFR2共受体在肿瘤血管新生中发挥重要作用，此发现与既往报道相符。EphA2已被报道为多种实体瘤中的血管生成信号分子，既表达于肿瘤细胞本身，也表达于新生内皮细胞。支持这一发现的，我们观察到EphA2存在于肿瘤内CD105+/CD146+血管上（图5I，箭头所指），以及在周围GBM组织中呈弥漫性染色。如预期般，EphA2在肿瘤区域外的正常脑组织中几乎不存在（图5I和5J）。接下来，我们利用MICS数据研究肿瘤细胞侵袭，这是GBM的另一重要特征。白质纤维束，尤其是胼胝体（CC），是GBM中主要的浸润通路。与此一致，MICS分析显示胼胝体内NF和L1-CAM阳性纤维束中整合了一串mCherry+细胞（图5K和5L）。在电穿孔诱导肿瘤的初始阶段胼胝体中未见mCherry+细胞（图2），表明SVZ来源的肿瘤细胞通过胼胝体结构迁移以侵袭邻近组织，这与人类中的观察结果一致。值得注意的是，图5L中箭头所指处可见数个CD11b+髓系细胞位于胼胝体中且邻近肿瘤细胞。除胼胝体中的大量细胞流外，还观察到远离侧向肿瘤边缘的散在细胞，其分布模式提示肿瘤正侵袭邻近纹状体（图5M）。有趣的是，这些mCherry+/EGFR+肿瘤细胞分布并不均匀。具体而言，在以NeuN+神经元为主的区域中它们较为稀少，但沿NF+纹状体轴突束及其内部聚集，进一步支持白质引导的肿瘤细胞侵袭模式。最后，我们观察到GBM通过脑血管侵袭组织的另一种典型模式。我们发现，位于隔部、对侧侧脑室旁、距主肿瘤较远的两条主要CD105+动脉上（图5K-5N），均存在mCherry+/EGFR+肿瘤细胞（图5N，白色箭头）。在此背景下值得注意的是，覆盖肿瘤细胞的血管上还存在多个CD169+骨髓来源巨噬细胞（图5N，蓝色箭头），再次表明侵袭性肿瘤细胞与免疫细胞之间存在早期相互作用。总之，传统组织学方法、光片三维显微成像和MICS超高内容成像的结合，为深入了解该小鼠模型中脑癌的发育过程提供了深刻见解，所获得的肿瘤致密且具有复杂的形态学结构，广泛侵袭至大脑健康区域。这些综合分析强有力地表明，该模型忠实地再现了人类GBM中观察到的大多数细胞和分子过程。本工作还为小鼠兼容抗体提供了资源。将三维光片显微成像与二维MICS结合：我们的三维光片显微成像揭示了诱导的小鼠GBM高度复杂，并广泛分布于所分析大脑的脑首-脑尾轴和内侧-外侧轴上（图3）。与此同时，利用MICS进行的分子研究表明，分子和细胞具有高度复杂性，但这一复杂性只能在标准平面的单独组织切片中检测，无法考虑诱导肿瘤的完整三维范围和形态学复杂性。我们的目标是通过以下方式进行整合：对已经用组织透明化和LSFM分析过的大脑进行高分辨率MICS分析。这些分析中，我们将从基于水的CUBIC透明方案切换到基于有机溶剂的Miltenyi透明试剂盒。虽然这一改变使得LSFM无法直接成像荧光蛋白，但提供了更好的组织硬度，从而实现更高倍率的成像，并展现出与MICS分析所需的后续切片更好的兼容性。我们采用电穿孔诱导实验性GBM，但表达细胞质GFP而非核mCherry，以便观察细胞形态并用抗GFP纳米抗体进行检测。在电穿孔后2周灌注，对大脑进行通透处理，用抗GFP纳米抗体偶联物染色，并使用MACS? Deep Clearing Kit进行透明化（图6A）。获取三维图像，并使用IMARIS软件生成表面（详见Bigott等）。该方法实现了高质量GFP阳性肿瘤的识别与成像（图6B和6C，三维动画见Video S5；脑表面为青色，GBM为红色）。主肿瘤（T）覆盖侧脑室壁，位于胼胝体下方，并向下方纹状体延伸出相互连接的细胞群（图6B和6C；箭头所指）。此外，在侧脑室腹侧面发现一大群GFP阳性细胞，与主肿瘤分离（图6B和6C；箭头所指）。最后，在纹状体中发现一个较小的孤立GFP高表达细胞团（图6B和6C，星号；见Video S5）。图6 光片显微成像引导切片及MICS：（A）光片显微成像后引导切片并随后进行MICS分析的实验方案示意图。（B）电穿孔后2周大脑的三维原始图像。主肿瘤（T）延伸至邻近脑实质（箭头所指）。纹状体中有一小群脱离的细胞（星号），沿脑室腹侧面观察到一大块与主肿瘤不相连的肿瘤细胞团（箭头所指）。（C）对应的三维视图，显示分割后的肿瘤阳性信号。动画见Video S5。（D）三维视图的光学切片，用于确定最佳目标平面。肿瘤显示为红色，组织自发荧光显示为青色。（E）所选光学切片与对应组织切片的MICS图像（绿色）叠加。（F）使用超高内容成像对3D-2D方案生成的切片进行高分辨率组织学分析。所选标志物显示肿瘤细胞（EGFR）、白细胞（CD18）、血管（CD146）、神经元（NeuN）和轴突纤维束（神经丝，NF）的标记。G-L：在五个不同ROI（图G所示）中量化标志物表达，这些ROI位于纹状体（ROI1）或肿瘤的不同区域（ROI2-5）。（H-L）小提琴图展示五个ROI中14个肿瘤和非肿瘤标志物的表达水平。各ROI分割的细胞数：471个细胞（ROI1）、412个细胞（ROI2）、398个细胞（ROI3）、375个细胞（ROI4）和473个细胞（ROI5）。标尺：1000 μm（B和C），内嵌图150 μm和80 μm（D）。CC：胼胝体，Cx：皮层，fi：终足，Hi：海马体，St：纹状体。Video S5：使用3D-2D方法分析的2wpe时段的肿瘤三维分割视图。基于这些三维数据，我们利用光学切片定义了一个最佳平面，在单一组织切片中覆盖肿瘤的最大范围，包括孤立的细胞团（图6D）。对于所示大脑，我们确定偏离正中矢状面12°为最佳角度，并建立了在该角度精确进行冷冻切片的方案（图6A）。经复水、冷冻保护、角度校正和速冻后，选取了该层面10 μm厚度的切片。基于LSFM的投影图像（图6D）与用于MICS的物理切片之间完美重叠（图6E）。MICS分析后，3D2D方法中使用的38个标志物中的13个在仅二维MICS方法中提供了高质量染色（表1，表2，各图像见补充图S4）。此外，低亲和性神经营养因子受体CD271（p75）在仅MICS分析中未提供高质量染色，但在3D2D方法中展现出优异且特异性的染色效果，并进一步进行了分析。抗原 / 克隆号 / 稀释比例 / 货号 / 荧光染料 / 公司：CD18 / REA1226 / 25 / 130-124-120 / APC / Miltenyi Biotec；CD29 / REA1074 / 50 / 130-119-165 / PE / Miltenyi Biotec；CD44 / REA664 / 100 / 130-119-121 / APC / Miltenyi Biotec；CD45 / REA737 / 50 / 130-110-796 / FITC / Miltenyi Biotec；CD54（ICAM-1）/ REAL289 / 25 / 130-115-986 / APC / Miltenyi Biotec；CD146（LSEC）/ REA1064 / 50 / 130-118-406 / FITC / Miltenyi Biotec；CD271（LNGFR）/ REA648 / 25 / 130-118-793 / PE / Miltenyi Biotec；EGF受体 / REA939 / 200 / 130-115-506 / APC / Miltenyi Biotec；GFAP / REA335 / 50 / 130-118-351 / PE / Miltenyi Biotec；GLAST（ACSA-1）/ ACSA-1 / 100 / 130-118-344 / PE / Miltenyi Biotec；MOG / REAL797 / 25 / 130-128-468 / PE / Miltenyi Biotec；Nestin / REA575 / 50 / 130-120-164 / APC / Miltenyi Biotec；NeuN / REA1131 / 50 / 130-119-492 / FITC / Miltenyi Biotec；神经丝 / REA1127 / 50 / 130-119-496 / PE / Miltenyi Biotec。表2：2D3D MICS的抗体面板。图6F展示了肿瘤细胞（EGFR）、免疫细胞（CD18）、血管（CD146）、神经元（NeuN）和轴突投影（NF）叠加染色的代表性图像。与三维投影（图6B和6C）一致，主EGFR+肿瘤团块位于胼胝体（由NF标记，品红色）下方，对上方皮层（NeuN）几乎无侵袭，但向纹状体深层延伸（箭头所指）。除主肿瘤团块外，在侧脑室腹侧面检测到一大群eGFP+/EGFR+细胞（图6B-6F；箭头所指）。最后，根据三维数据的预期，在纹状体轴突束中发现一小群与主肿瘤分离的EGFR+细胞，提示肿瘤细胞通过白质通路从主肿瘤侵袭该区域（图6B-6F，星号）。总体而言，组织切片与LSFM检测到的肿瘤之间对应良好。我们量化了不同肿瘤区域及下方正常纹状体中14个标志物的表达。经MACSiQ进行分割和Z分数标准化后，定义了五个ROI（图6G），并在细胞水平分析了标志物强度。正常纹状体组织（ROI 1）中的细胞表现出强烈的神经元和胶质细胞标志物表达，包括NeuN、NF、MOG、MBP和GLAST，与健康脑实质一致（图6G和6H）。相比之下，肿瘤不同区域（ROI 2-5）中的细胞表现出高水平转基因过表达的EGFR，这是预期的，同时伴随CD44、CD29、CD271、GFAP和Nestin等经典肿瘤标志物的稳健表达（图6G和6I-6L）。值得注意的是，这些预定义的肿瘤区域表现出显著的空间异质性。例如，GFAP和Nestin呈现相反的表达式样：ROI 2中GFAP低表达/Nestin高表达（图6I），而ROI 5中GFAP高表达/Nestin低表达（图6L）。CD271在ROI 3和5中强表达（图6J-6L），但在ROI 2和4中表达水平相对较低（图6I和6K）。总之，这突出了整体肿瘤团块中细胞区域的特异性分子状态。接下来，我们观察到经典肿瘤细胞标志物在三维预定义区域中的细胞和组织表达情况。Nestin在诱导肿瘤的各个区域中广泛且均匀表达（图7A-7D）。Nestin与CD44表达的叠加在主肿瘤位于胼胝体附近的区域中非常强（图7C）。主肿瘤向下方纹状体的延伸区域同样呈强烈的Nestin阳性，但CD44整体表达水平较低（图7B-7D）。图7 三维预分析组织的超高内容成像：使用相关的标志物组合对图6F所示的同一切片在不同细胞和分子背景下进行了分析。（A-D）高分辨率图像显示肿瘤标志物Nestin、CD44和CD271的差异性空间标记。CD271是肿瘤干细胞和侵袭性肿瘤细胞的标志物，仅限于主肿瘤中的亚群（B-D高倍放大，箭头所指），并在纹状体中的侵袭细胞中表达（图6A内嵌图）。（E-H）高分辨率图像显示肿瘤细胞（GFAP、CD54（ICAM1）、EGFR）、血管（CD146）、纤维束（NF）和神经元（NeuN）的染色。框选区域在F-H中以高倍放大显示。F和G中肿瘤细胞用eGFP标记。H中肿瘤细胞通过高EGFR水平识别。注意EGFR阳性肿瘤细胞周围存在GFAP阳性细胞，表明存在反应性星形胶质细胞。标尺：100 μm（A和E），50 μm（B-D和F-H）。如上所述，另一提供高质量染色的肿瘤标志物是CD271（p75），它是肿瘤起始干细胞及从主肿瘤迁移从而逃避手术切除的高侵袭性细胞的标志物。事实上，在人类中，高表达水平与高级别胶质瘤和较差的总体生存率相关。MICS分析显示，在诱导肿瘤的各个区域中，CD271在Nestin+/CD44+细胞团中均有表达（图7A-7D，箭头所指）。

然而，CD271表达细胞的数量在不同肿瘤区域中存在异质性，从延伸至纹状体区域的仅个别分散细胞（图7A、7B、7D和6I–6K），到接近中央管（CC）区域以CD271+肿瘤细胞为主（图6J和7C），以及位于侧脑室腹侧的一群肿瘤细胞（图7A，星号标记，图6L）。有趣的是，CD271也在整合于纹状体轴突束中的孤立细胞簇中表达（见图7A插入图），这进一步表明该细胞群是组织侵袭的结果。在3D2D方法中显示出高质量染色的其他标记物还包括CD146、CD54和GFAP（图7E–7H）。与仅采用2D的MICS分析（图4G）相比，CD146是肿瘤内血管的可靠标记物，在周围正常脑组织中表达水平较低（图7E和7F）。CD54是一种强效的癌细胞分泌的免疫细胞趋化因子，与GFP标记的癌细胞共定位，但在正常脑组织中不存在（图7E–7G）。如预期般，GFAP在不同肿瘤区域强烈表达，与Nestin和CD44的存在高度重叠（图7E，对比图7A）。有趣的是，在纹状体中上述分离的EGFR+癌细胞簇周围也检测到具有星形胶质细胞形态的强GFAP+细胞（图7E–7H），表明周围脑实质发生了快速的炎症反应。总之，这些分析表明，组织透明化和3D成像与MICS提供的后续高含量空间成像方法兼容，允许对预定位的脑区域进行分子分析。

**讨论**

通过对临床前模型进行深入表征——由全面的工具箱提供支持——对于有效利用这些模型并将实验发现转化为临床应用至关重要。在这项工作中，我们将经典组织学与尖端3D成像和空间蛋白质组学相结合，对一种具有临床相关性的基于电穿孔的胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型进行了表征。

通过将TP53和PTEN的CRISPR/Cas9介导的突变与转座酶驱动的EGFRvIII癌基因基因组整合相结合，我们建立了一个简单可靠的模型，满足所有高级别胶质瘤的组织病理学标准。与传统方法不同，该模型可应用于小鼠的任何遗传背景，无需费力且耗时的复杂等位基因组合构建。

该模型的快速发作和高时间精度使研究者能够研究转化后仅两天的早期事件。利用组织透明化和3D LSFM，我们证明了肿瘤生长在不同队列和较长时间段内具有高度可重复性和可量化性，最早可在转化后一周检测到。此外，多重组织成像使我们能够解析诱导肿瘤的分子和细胞组成。我们提供了适用于高分辨率GBM及其微环境和宏环境分析的经过筛选的小鼠兼容抗体列表。最后，我们证明了组织透明化和LSFM与通过MICS技术进行的后续多重空间蛋白质组学分析兼容，使串行3D至2D分析成为可能。

在过去十年中，已开发了大量小鼠模型来研究高级别胶质瘤，为了解GBM生物学及其与正常组织的相互作用提供了见解。许多这些模型依赖于功能获得性EGFR突变，这是神经干细胞增殖、迁移和分化的强效驱动因子，也是GBM的关键癌基因以及CAR-T细胞疗法的有前景的靶标。与其他基于EGFR的模型——肿瘤诱导和进展跨越数周或数月不同——我们的模型实现了快速且均一的肿瘤诱导，这可能是由于基于肌动的CBh启动子驱动的EGFRvIII高表达所致。尽管如此，我们的组织病理学分析证实，所产生的肿瘤表现出高级别胶质瘤的所有特征。此外，肿瘤诱导的速度和可重复性使研究者能够前所未有地触及NSC转化的最早阶段。在此，我们展示了转化细胞离开祖细胞区域发生在非常早期，且独立于肿瘤质量增长。该模型均一且可量化的生长——由LSFM验证——及其与多种遗传背景的兼容性使其成为研究脑癌发展的分子调控以及治疗方法的临床前测试的有力工具。

体细胞GBM小鼠模型（如本文所述）的主要优势在于，肿瘤发育发生在完全免疫功能正常的环境中。在人类中，免疫细胞可占肿瘤质量的40%，主要由脑驻留的小胶质细胞和骨髓来源的髓系细胞组成。主流假说认为，髓系细胞最初被招募以清除癌细胞，但随后被重编程以支持肿瘤生长。然而，大多数支持证据来自晚期人类肿瘤或完全建立的小鼠模型，忽略了免疫参与的关键早期阶段。将允许从早期胶质瘤发生到致死性肿瘤的受控进展的体细胞模型与通过空间蛋白质组学进行深度分子表型分析相结合，为推进这一治疗相关领域提供了一种稳健的方法。在该模型中，我们观察到在诱导后仅两周，小鼠肿瘤即包含丰富的CD11b+/CD45+细胞。我们还鉴定出表达CD169的重要免疫亚群，代表参与抗肿瘤免疫的血液来源髓系细胞。此外，一部分CD11b+/CD45+髓系细胞表达CD11c，这是激活的小胶质细胞和浸润的单核细胞来源树突状细胞的标记物，CD11c可单独或联合CD169表达。尽管该标记物集并不穷尽，但为在体细胞小鼠模型中进行肿瘤-免疫相互作用的深度空间蛋白质组学分析奠定了基础。

本工作的一个核心目标是提供新的工具和概念，以利用高含量多重成像对诱导的小鼠胶质瘤进行分子表征。虽然MICS多重空间蛋白质组学已成功应用于人类组织，但其在小鼠GBM研究中的应用仍然有限。据我们所知，多重空间成像此前尚未应用于如本文所述这样的体细胞小鼠模型。

多重方法应用的一个主要障碍是小鼠组织经验证的抗体稀缺。事实上，大多数可用抗体——靶向癌细胞或微环境和宏环境的组成部分——是为人类样本开发和优化的。与此一致，我们筛选了初始77种人类验证抗体面板，发现38种在小鼠GBM切片中产生高质量染色。虽然这提供了有用的起点，但既不全面也无偏倚，凸显了在不同生物学背景下系统选择与验证标记物的必要性。尽管如此，我们鉴定的抗体几乎涵盖了所有相关的肿瘤和非肿瘤细胞亚群。经典脑肿瘤标记物——如GFAP、nestin、CD44和GLAST——在肿瘤区域的癌细胞中强烈表达，其模式和细胞定位进一步验证了我们模型的临床相关性。我们检测到CD271，这是与化疗抗性癌细胞干细胞和侵袭性癌细胞功能相关的标记物，后者在人类GBM中可逃避手术切除。在我们的小鼠模型中，CD271不仅在肿瘤核心内的细胞亚群中强烈表达，还在沿白质束迁移的细胞中表达，反映了患者中观察到的侵袭性行为。

在一个工作流程中整合组织透明化、3D显微镜和目标2D多重成像代表了一项重大技术进展，具有广泛的应用前景。3D显微镜能够在真实空间背景下检测有限的标记物集。2D多重分析提供了深度分子和细胞见解——但通常来自标准解剖平面（冠状面、矢状面或水平面）随机选择的切片。通过利用高分辨率3D图像，我们定义了最佳目标平面以制备与感兴趣区域精确对齐的组织切片——我们称此工作流程为光片引导切片。该方法确保切片捕获多个预识别的肿瘤区域，从而能够在完整的3D背景下进行直接比较。此外，由于MICS耗时且昂贵，我们的3D至2D方法通过定位理想组织切片以在给定实验背景下提供最大信息来优化效率。关键的是，它还允许识别远离肿瘤核心的侵袭细胞，而这些细胞在常规组织学切片中很可能被遗漏。因此，光片引导采样最大化了空间信息回收并增强了分析精度。

在预定义组织切片的后续MICS分析中，初始识别的38个标记物（加上CD271）中有13个为癌细胞及肿瘤微环境和宏环境提供了高质量染色。尽管该面板有限，但可识别脑肿瘤中存在的所有主要细胞群体，证实了该方法的可行性和实用性。系统性扩展——测试更广泛的标记物谱以及固定方法和抗体浓度等变量——很可能会产生更为全面的适用于串行3D至2D分析的抗体列表。

先前的研究表明，经CUBIC透明化并经LSFM分析的人类组织对经典免疫组织化学保留抗原性。然而，由于经典染色是低通量的，只能评估有限数量的标记物，限制了对复杂机制和相互作用的分析，而这些分析可通过高通量分析系统（如MICS）进行。或者，诸如MS-DISCO等方法允许在3D成像后对组织进行大规模和系统性蛋白质组分析，通过使用LSFM识别感兴趣区域（ROI），然后通过机器人提取分离并通过质谱分析。虽然这种方法为预定义区域提供了无偏倚的蛋白质组数据，但缺乏细胞或亚细胞分辨率——这一局限性被我们的LSFM/MICS工作流程克服。

因此，3D光片成像和2D多重蛋白质组学的结合使用为体细胞高级别小鼠胶质瘤的空间解析分子分析提供了强大的框架。尽管啮齿类动物验证的抗体有限，我们鉴定出了功能性标记物集，并证明光片引导采样能够实现精确、信息丰富的切片。这一整合工作流程扩展了小鼠GBM研究的工具箱，并为系统空间蛋白质组学表征肿瘤生态系统建立了实用途径。显然，这种方法不仅限于癌症生物学，还可以设想从发育生物学研究到各种疾病背景的广泛应用。

**研究局限性**

• 在本手稿中，我们表征了一个特定的基于p53/PTEN突变和EGFRvIII过表达的体细胞小鼠GBM模型，其特点是生长非常迅速。虽然这种聚焦分析清晰地展示了模型的特性，但并行对不同电穿孔基GBM模型进行比较评估无疑将极具信息价值，因为这有助于确定研究结果在不同遗传背景和肿瘤行为中的普适性。

• 本工作的一个局限性涉及MICS分析所用标记物面板的大小和内容。在2D MICS工作流程中初步测试的77种抗体（均来自Miltenyi Biotec）中，有38种产生了适合在小鼠组织中进行深入分析的染色质量。虽然这代表了一个相当大的集合，但并不全面或无偏倚，且需要在不同生物学背景下进行系统性的标记物选择与验证。此外，在我们的3D-2D组合工作流程中，14个标记物在我们的实验条件下证明了稳健的染色。该面板足以验证原理并提取生物学上有意义的信息，但在肿瘤分析背景下尚需扩展抗体库并优化替代固定和染色方案，以实现该技术在更广泛生物学问题上的系统性和多样化应用。

• 在本研究中，我们使用CUBIC透明化方案直接成像mCherry，并在3D2D方法中改用商业化的Miltenyi试剂盒。原则上，MICS染色方案应与CUBIC透明化兼容，但我们未系统测试这一可能性。

**资源可用性**

**主要联系人**
进一步信息和资源的请求应发送至并由主要联系人Marie-Catherine Tiveron（[e-mail]）处理。

**材料可用性**
本研究中生成的质粒将根据请求提供，但如果存在商业应用的可能性，我们可能需要完成材料转让协议。

**数据和代码可用性**
• 数据：本文报告的数据将由主要联系人根据请求共享。
• 代码：本文未报告原始代码。
• 所有其他项目：重现本论文报告数据分析所需的其他任何信息均可从主要联系人处根据请求获得。

**致谢**
我们感谢JH Lee（韩国科学技术院，韩国大田）和Karine Loulier（法国蒙彼利埃神经肌肉研究所）分别提供了CRISPR和pBASE质粒。感谢Caroline Blanc在实验工作中的帮助。Cremer实验室获得了法国癌症研究协会（ARC）和Cancéropole PACA的支持。Yliana Huriaux Fontana获得了法国医学研究基金会（FRM）的博士奖学金资助。

我们还感谢IBDM的成像设施，该设施是法国国家基础设施France-BioImaging的成员（https://ror.org/01y7vt929），由法国国家研究署支持（ANR-24-INSB-0005 FBI BIOGEN），以及动物设施。Tchoghandjian实验室获得ANR（MEGA01，ANR-21-CE18-0047-01）、Cancéropole PACA（PETRA结构化行动）以及脑肿瘤研究患者协会（ARTC Sud）的支持。

作者贡献
概念化：H.C.、M.C.T.、N.C.、A.B.、K.B.和A.T.；方法学：M.C.T.、K.B.、N.C.、H.C.、F.E.Y.、S.R.、M.J.和D.F.B.；实验工作：M.C.T.、N.C.、K.B.、V.S.、Y.H.F.、M.C.、L.V.和F.E.Y.；分析：M.C.T.、N.C.、H.C.、F.E.Y.、K.B.、V.S.、D.F.B.和A.T.

利益声明
K.B.、V.S.、S.R.、A.J.和A.B.是Miltenyi Biotec B.V. & Co.的员工。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作的过程中，作者仅使用AI工具进行文本编辑。作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物内容承担全部责任。

STAR★方法

关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **抗体** | | |
| Anti-Olig2 Clone EP112（兔IgG） | Zytomics | 货号：BSB2563 |
| Anti-Ki-67抗原克隆MIB-1（小鼠IgG1，kappa） | DAKO | 货号：GA626；RRID：AB_2687921 |
| anti-GFP Alexa Fluor 647纳米抗体 | Proteintech/ChromoTek | 货号：gb2AF647-50；RRID：AB_2827575 |
| **化学品、肽和重组蛋白** | | |
| 肝素钠盐 | Sigma-Aldrich | CAS：9041–08-1 |
| EdU | Sigma-Aldrich | CAS：61135–33-9 |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | CAS：26628–22-8 |
| 多聚甲醛32%溶液，电镜级 | Electron Microscopy Sciences | CAS：30525-89-4 |
| Tissue-Tek OCT化合物 | Electron microscopy Sciences | 货号：62550–01 |
| Mowiol 4–88；聚乙烯醇 | Sigma-Aldrich | CAS：9002-89-5 |
| Hoechst H33258溶液 | InVitrogen | CAS：23491-45-4 |
| 尿素 | Euromedex | CAS：57-13-6 |
| Triton X-100 | Euromedex | CAS：9036-19-5 |
| N,N,N',N'-四[2-羟基丙基]乙二胺 | Sigma-Aldrich | CAS：102–60–3 |
| TOPRO-3碘化物核染料溶液 | Life Technologies | CAS：157199-63-8 |
| PBS | Eurobio | 货号：EM-15714 |
| 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | CAS：39346–81-1 |
| 蔗糖 | Euromedex | CAS：57–50-1 |
| 无水乙醇 | VWR | CAS：64-17-5 |
| Tween? 20 | Euromedex | CAS：9005-64-5 |
| **关键商业检测** | | |
| Click-iT EdU成像试剂盒 | Life Technologies | 货号：C10340 |
| MACS? Deep Clearing试剂盒 | Miltenyi Biotec | 货号：130-136-470 |
| **实验模型：生物体/品系** | | |
| 野生型Rj:Swiss CD1小鼠 | Janvier labs | 不适用 |
| **重组DNA** | | |
| phU6-sgTP53-sgPTEN-Cbh-Cas9-Cre质粒 | Dr. Jeong Ho Lee，KAIST，韩国 | Lee等人；https://doi.org/10.1038/s41586-018-0389-3 |
| pCAAGS hyPBase质粒 | Dr. Karine Loulier | 不适用 |
| pPB-CMV-TO-EGFRvIII-IRES-nlsCherry | DR. Michael Elowitz | RRID：Addgene_116039 |
| **软件和算法** | | |
| ImSpector软件 | Miltenyi Biotec | 不适用 |
| IMARIS（版本10.2.0） | Oxford Instruments，瑞士苏黎世 | https://imaris.oxinst.com |
| GraphPad Prism（版本9.0） | Prism GraphPad Software，美国 | https://www.graphpad.com |
| NDP.view2软件 | Hamamatsu Photonics K.K，日本 | https://www.hamamatsu.com |
| R版本4.4.2 | The R Foundation | https://www.r-project.org/；RRID：SCR_001905 |
| R包RcmdrPlugin.coin | The R Foundation | https://CRAN.R-project.org/package=RcmdrPlugin.coin |
| FIJI软件 | ImageJ2 | https://imagej.net/ij/；RRID：SCR_003070 |
| MACSiQ View软件 | Miltenyi Biotec | 不适用 |
| ZEN软件 | Zeiss，德国 | https://www.zeiss.com |

**实验模型和受试者详情**

所有实验均在小鼠中进行。所有实验均已获得法国高等教育、研究与创新部伦理委员会批准（授权编号：34083-2021112215573540v5），依据欧洲共同体规则和法规进行。

Rj:Swiss CD1小鼠（Charles River，法国）在标准条件下（温度：22°C ± 2；湿度：50–70%）常规笼养，采用12小时光暗循环。除螺旋体和诺如病毒外，小鼠无病原体。出生当日定义为出生后第0天（P0），组织学分析每周进行一次，直至6周龄。在生存实验中以每日监测，当小鼠出现疾病症状（弓背、活动受限）时处死。所有实验均使用雄性和雌性小鼠。

**方法详情**

**质粒构建**

我们使用的两个用于诱导高级别胶质瘤的载体构建如下。允许表达CRISPR Cas9系统并同时表达PiggyBac转座酶的载体，由phU6-sgTP53-sgPTEN-Cbh-Cas9-Cre质粒（由Dr. Jeong Ho Lee慷慨赠送，韩国科学技术院，KAIST）改造而来，其中将Cre重组酶（Cre）序列替换为pCAAGS hyPBase（phyPBase，由Dr. Karine Loulier慷慨赠送）中来源于超级激活PiggyBac转座酶的hyPBase序列。携带EGFRvIII和核mCherry的PiggyBac表达载体，由pPB-CMV-TO-EGFRvIII-IRES-nlsCherry（由Michael Elowitz赠送，Addgene质粒# 116039）改造而来，将CMV启动子替换为Cbh启动子（PB-EGFRvIII-mCherry）。该构建体进一步修改，用eGFP序列替换nlsCherry基因，获得pPB-Cbh-EGFRvIII-IRES-eGFP（PB-EGFRvIII-GFP）。在对照实验中，从PB-EGFRvIII-mCherry和PB-EGFRvIII-GFP中删除了EGFRvIII序列。这些新的重组质粒分别与phU6-sgTP53-sgPTEN-Cbh-Cas9-hyPBase组合，用于电转实验以防止肿瘤诱导。

**出生后电转**

活体电转如前所述进行。简言之，P0-P1幼鼠通过低体温和注射1.5 μL混合溶液（每种质粒浓度为1 μg/μL）麻醉，注射至侧脑室。使用CUY21 edit设备（Nepagene，日本千叶）和7 mm镊电极（CUY650P7，Nepagene）对动物施加五个95V电脉冲（50 ms，间隔950 ms），电极涂有导电凝胶（Signagel，Parker Laboratories，美国）。为有效靶向背侧或侧侧室下区（V-SVZ），正极分别放置在眼睛上方或眼睛前方稍处，负极放在相反位置。电转后，动物在37°C培养箱中复苏，然后放回母鼠身边。

**脑组织制备**

小鼠用致死剂量的盐酸丁卡因和氯胺酮（分别为200和20 mg/kg）深度麻醉。首先用冰冷的PBS；肝素（5 u/mL；H3393，Sigma-Aldrich）进行心内灌注，以有效冲洗血管中的血细胞，然后用冰冷的4%多聚甲醛（32%母液，Electron Microscopy Sciences）在PBS中进行固定。随后取出脑组织，过夜后固定，然后保存在PBS中。为标记快速分裂的细胞，在灌注前1小时腹腔注射EdU溶液（50 mg/kg；B5002，Sigma Aldrich）。对于MICS分析，脑组织仅后固定2小时，快速用PBS洗涤，然后在30%蔗糖-PBS溶液中冷冻保护，嵌入OCT（Tissue-Tek）中，最后冷冻在干冰冷却的异戊烷中。样品用CM3050S冰冻切片机（Leica）进行冰冻切片，10微米冠状切片贴于Superfrost玻片上，保存在-80°C直至处理。对于光片显微镜与MICS的组合，脑组织仅后固定2小时，快速用PBS洗涤，保存在含0.09%叠氮化钠的PBS中（S2002，Sigma Aldrich）。

**免疫组织化学和组织学分析**

对于免疫荧光分析，固定脑组织在30%蔗糖中进行冷冻保护，然后用切片机（MICROM HM450）进行切片。EdU掺入在50 μm漂浮切片上使用Click-iT EdU成像试剂盒（C10340，Life Technology）进行检测。切片最终在Hoechst溶液（1/2000；H3570，InVitrogen）中孵育，并贴于Superfrost玻片上，用Mowiol? 4–88（475904，Sigma-Aldrich）封片。光学图像使用Axioplan2 ApoTome显微镜（Zeiss，德国）配合ZEN软件（Zeiss）获取，并使用Fiji软件进行处理。对于组织学分析，小鼠脑的连续5 μm甲醛固定石蜡包埋（FFPE）切片用苏木精和伊红（H&E）染色，在显微镜下检查肿瘤细胞的存在。免疫组织化学在相邻石蜡切片上进行。经蒸汽热诱导抗原修复后，FFPE样本切片检测Olig2（Clone EP112，Zytomics，稀释比例1:100）和Ki-67（Clone Mib-1，DAKO，稀释比例1:200）的存在。使用Benchmark Ventana自动染色仪（Ventana Medical Systems）进行检测，同时免疫染色所有切片以避免操作间的变异性。切片随后扫描（Nanozoomer 2.0-HT，Hamamatsu Photonics SARL France，Massy，法国），图像在NDP.view2软件（Hamamatsu）中处理。

**脑组织透明化与3D成像用于肿瘤体积评估**

**透明化**

脑组织使用先进的Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails（CUBIC）方案进行透明化处理。在1、2、3和4周后（wpe）回收的固定半脑在37°C下轻柔摇动孵育于7 mL CUBIC试剂1中[25%尿素（Euromedex）、25% N,N,N',N'-四[2-羟基丙基]乙二胺（Sigma-Aldrich）和15% Triton X-100（Euromedex）]直至完全透明。第一天孵育后更换CUBIC试剂1溶液，之后每2天更换一次。当脑组织透明后，在PBS中洗涤1小时，然后在37°C下孵育于TOPRO-3碘化物核染料溶液（1:2000；T3605，Life technologies）中过夜。脑组织再用PBS洗涤2–3次，每次10分钟，然后再次浸入CUBIC试剂1中在37°C下孵育一天。

**光片成像**

透明化后的脑组织在CUBIC1溶液中水平放置，使用Ultra Microscope Blaze（Miltenyi Biotec，德国）进行成像，由ImSpector Pro 7.3.2控制，配备sCMOS 5.5Mpx相机、LaVision Bio Tec PLAN 1.1x/0.1 NA/≤16 mm WD物镜以及488、561和639 nm的LED激光器。使用的发射滤光片为525/50、595/40和680/30。对于4周后的较大脑组织使用0.6×放大透镜，其他样品使用1x，以便在单一视场中成像。样品由11.4 μm厚的激光光片从一侧或两侧照射，取决于样品大小。图像（TIFF格式）以6 μm的z步长采集，无动态聚焦。图像堆栈用于进行3D重建。

**图像分析**

3D投影使用Imaris软件（版本10.2.0，Oxford Instruments，瑞士苏黎世）进行。肿瘤体积（VTumor）通过基于mCherry标记使用Imaris软件的自动表面工具创建3D掩膜来定义。阈值处理在1周后的肿瘤上使用背景减法方法，其他阶段使用绝对强度。每个样品的阈值单独手动调整，以最佳适应背景差异。由于CUBIC方案会导致组织肿胀，肿瘤体积以齿状回（DG）体积为基准进行标准化，DG是一个定义明确的解剖结构。DG的轮廓使用TOPRO3信号通过Surface工具手动绘制，生成3D掩膜并定义DG体积（VDG）。标准化肿瘤体积通过将VTumor除以VDG获得。

**2D MICS**

**MICS的组织制备**

灌注后的脑组织按上述方法处理。样品用CM3050S冰冻切片机（Leica）进行冷冻切片，10微米冠状切片根据MACSwell?成像框架模板贴于Superfrost玻片上，保存在-80°C直至用MACSima?成像循环染色（MICS）技术进行处理。

**MICS的抗体和试剂**

MICS使用与FITC、PE和APC偶联的荧光素标记的初级抗体。所用抗体克隆、稀释比例和偶联荧光素见表1。

**循环染色**

MACSima?成像循环染色用于深度细胞表型分析。样品贴于选定的MACSwell?成像框架上，用MACSima?运行缓冲液水化2分钟。DAPI预染色（1 μg/mL）在MACSima?运行缓冲液中进行10分钟，然后用MACSima?运行缓冲液洗涤三次。随后应用MICS技术，通过迭代染色、成像和擦除循环，在单个样品上实现超高含量成像。

**3D-2D工作流程**

3D-2D工作流程的详细方案已发表于STAR Protocols。

**简言之：3D空间分析（LSFM）**

电转后两周，使用phU6-sgTP53-sgPTEN-Cbh-Cas9-Cre-hyPBase/PB-EGFRvIII-GFP载体组合，按照MACS? Deep Clearing试剂盒方案（Miltenyi Biotec，130–136-470）对半脑进行染色和透明化处理。简言之，灌注后，样品在室温下用Deep Permeabilization Solution透化处理24小时，然后在37°C下用anti-GFP Alexa Fluor 647纳米抗体偶联物（Proteintech/ChromoTek，gb2AF647-50，1:1000）免疫染色7天，并在室温下用Deep Antibody Staining Solution洗涤。脱水在28°C下以蒸馏水中递增的乙醇系列（30%、50%、70%、90%、100%、100%）进行，加入2% Tween 20（v/v）。组织在高折射率Deep Clearing Solution中变为透明，然后用UltraMicroscope Blaze?进行成像。3D光片数据使用1.1x/0.1 NA/≤17 mm WD和12x/0.53 NA/≤10.9 mm WD物镜分别获取总览和细节视图。通过ImSpector软件（Miltenyi Biotec）中"Fast Tiling Scan"和"Speed Mode"的结合，实现细节图像堆栈的快速成像。

**3D到2D转换**

在IMARIS分析软件中创建自发光和anti-GFP Alexa Fluor 647信号（GBM）的表面。通过这些表面，可以通过两个"Oblique Slicer"平面确定中矢状脑半球表面与GBM最佳目标截面之间的角度。生成具有该特定角度的琼脂糖块（1.5%低熔点琼脂糖）。在28°C下以蒸馏水中递减的乙醇系列（100%、90%、70%、50%、30%）进行水化，加入2% Tween 20（v/v），然后进行两次1x PBS孵育。样品在2°C–8°C下在30%蔗糖-PBS溶液中冷冻保护直至完全沉降。去除多余的蔗糖-PBS溶液，将组织放置在先前生成的角度琼脂糖块顶部，以使切割面与GBM目标截面协调一致。琼脂糖块和组织在冷冻模具中仔细覆盖最优切割温度（OCT）化合物，然后在液氮冷却的异戊烷中速冻。样品保存在-80°C直至进一步处理。

**2D样品制备**

样品在冷冻切片机中尽可能平行于刀片安装，以完全截切表面，从而最终保持表面与目标平面的协调一致。切片在-20至-23°C下进行，8–10 μm切片收集在带MACSwell?框架模板的SuperFrost?玻片上。

目标区域通过立体显微镜上的解剖学标志物进行了验证，同时也通过荧光显微镜检测保留了3D免疫荧光特征进行了确认。二维空间分析（MICS）：MACSima?成像循环染色（MICS）按照之前的描述进行（Kinkhabwala等人，2022）。GBM的3D免疫荧光特征在自动荧光采集过程中通过APC通道获取。定量分析：为对标志物表达进行定量分析，使用MACSiQ对组织切片进行分割，并进行Z分数标准化处理。在肿瘤的不同区域及其下方的纹状体中定义了五个感兴趣区域（ROI），并将所有14个标志物的细胞信号强度以小提琴图的形式进行可视化展示。定量分析与统计分析：定量分析——使用MACS iQ View软件（版本1.3.2）的分割流程对MICS图像数据集进行高级细胞分割。该软件使用核标志物和细胞膜标志物进行图像分割，以识别单个细胞。分割原理见Kinkhabwala等人的描述。对于图4B中展示的基因表达分析，我们通过Z分数对数据进行标准化处理，并基于细胞类型特异性标志物（NeuN、CD11b、CD105、mCherry）的强表达定义了四个细胞群。利用这一预先分类方法，我们分析了所有38个标志物在各亚群中的蛋白表达情况，结果以热图形式呈现。所有分析步骤均使用MACSiQ? View软件完成。血管密度以每个感兴趣区域（ROI）中标记像素所占的面积来计算。该分析使用Fiji软件完成。12个大小相同的ROI（24,858 μm2）分别放置在肿瘤内部或外部，避开拼接区域。为每个血管标志物（CD105、CD146或EphA2）定义了标记阈值，并选择高于该阈值的像素进行分析。统计分析：为分析生存数据，采用Kaplan-Meier方法，并使用GraphPad Prism 9.0版（GraphPad Software, USA）通过Mantel-Cox（对数秩）检验进行组间统计比较。对于组织学分析，图2G–2J和5J中的测量值以均值±标准误（SEM）呈现。使用R软件通过非参数Wilcoxon-Mann-Whitney检验进行统计比较。样本量（n值）在图例中给出。所有p值小于0.05均被认为具有统计学意义。补充信息（1）PDF（22.11 MB）文档S1：图S1–S4