低温保护剂辅助 plunge freezing 厚脑组织对靶向生理相关原位冷冻成像

《Cell Reports Methods》：Cryoprotectants-assisted plunge freezing of thick brain tissue specimens for targeted physiologically relevant cryo-imaging in situ

　　

在原位冷冻电子断层扫描（cryoET）和冷冻聚焦离子束/扫描电子显微镜（cryo-FIB/SEM）体积电子显微镜（volume-EM）成像可在近天然水相环境中提供生物系统的时空快照。对厚生物标本进行冷冻及后续减薄以用于冷冻成像是耗时且具有挑战性的工作，需要先进方法学。研究人员以小鼠脑活检为例，基准化了使用常见 plunge freezing 装置实现厚标本生理相关冷冻的方案。结果表明一套适用于冷冻成像的溶液不会干扰细胞超微结构，从而显著降低生理相关原位冷冻成像的最低设备要求。研究人员使用敲入小鼠模型实现靶向 cryo-FIB/SEM 体积电子显微镜与 cryoET 成像；在液态金属离子源（LMIS）与等离子体制冷 cryo-FIB/SEM（pFIB）上半自动制备 lamellae；可视化神经血管单元（NVU）并验证输出生理相关性。该流程利用常规玻璃化装置，有望推动生理相关原位冷冻成像研究的大众化。

研究背景方面，在原位冷冻电子断层扫描（cryoET，cryoelectron tomography）与冷冻聚焦离子束/扫描电子显微镜（cryo-FIB/SEM）体积电子显微镜（volume-EM）中，厚脑组织等标本的玻璃化（vitrification）与后续减薄长期依赖高压冷冻（HPF，high pressure freezing）及复杂提升转移方案。常规 plunge freezing（PF）虽常见于单颗粒分析（SPA，single particle analysis）实验室，但传统认为仅适用于10 μm以下标本；厚组织若用甘油、海藻糖等低温保护剂（cryoprotectant），其渗透压升高可能干扰蛋白水壳并影响生理相关性。因此，亟需一套可由普通冷冻电镜平台采用、既保证玻璃化质量又保留近天然形态的厚脑标本流程。

研究人员以小鼠海马、皮质与纹状体切片为对象，测试多种低温保护剂组合，用渗透压评估生理适用性，用 on-grid 减薄结合 cryoET 判断冰晶质量，并用 Cx30-CreERT2 与 Ai14 敲入（KI，knock-in）小鼠中 tdTomato 标记星形胶质细胞定位神经血管单元（NVU，neurovascular unit）与星形胶质细胞突起，在 LMIS 与 pFIB 仪器上半自动制备 lamellae，最终得出：15% PVP 可全玻璃化且渗透压可接受，10% PVP 加0.3 M trehalose 为近生理可用方案；NVU 与亚细胞器形态较室温电镜（r.t. EM）扩张而非收缩，证明标本处于近天然状态。该工作发表于《Cell Reports Methods》，意义在于把厚组织生理相关原位冷冻成像从专用 HPF 平台转向常规 PF 平台，推动方法学普及。

关键技术方法上，样本来自成年 C57BL/6 小鼠及 Cx30-CreERT2 交叉 Ai14 的3至4月龄转基因小鼠；主要方法包括振动切片机（vibratome）制厚片、低温保护剂孵育后 Leica EM-GP2 plunge freezing、外置冷冻荧光显微镜（cryo-FLM）定位 tdTomato 阳性区域、LMIS 与 pFIB 上 on-grid 半自动 FIB 铣削至120至200 nm lamellae、cryo-FIB/SEM 体积成像与 Titan Krios 上 cryoET 倾斜序列采集，以及 Warp、AreTemo、Isonet、cryoCARE、Dragonfly 等软件用于对齐、去噪与分割。

研究结果如下。厚标本 PF 与 on-grid 减薄：研究人员通过渗透压表筛溶液，发现20%甘油加1 M trehalose 渗透压达3404 mOsm/kg，而15% PVP 为352 mOsm/kg；经 LMIS 与 pFIB 制备 lamellae 后，15%甘油虽全玻璃化但出现疑似高渗弯曲伪影，10% PVP 加0.3 M trehalose 冰质中等，15% PVP 全玻璃化且渗透压接近生理，但高浓度 PVP 带来网状伪影。结论为10% PVP 加0.3 M trehalose 与15% PVP 是最适低温保护组合。

ROIs 定义用于 NVU 的 cryo-FIB/SEM 体积EM成像：利用 tdTomato 星形胶质细胞信号在 cryo-FLM 与集成荧光模块（iFLM）下锁定血管周足区域，在 pFIB 中采集约32000 μm³体积，分割出管腔、内皮细胞、周细胞与三个星形胶质细胞终足。结论是可荧光引导靶向厚组织 NVU。

cryo-FIB/SEM 体积EM成像输出的生理相关性：与已发表 r.t. EM 比，内皮层厚度约增3倍，周细胞长度约增1.4倍，星形胶质细胞终足约增4倍；管腔直径与面积也较 r.t. EM 更大。研究人员解释为此系近天然水相环境相对化学固定取代水分所致，说明标本未被挤压，形态具生理相关性。

ROIs 定义用于星形胶质细胞突起的 cryoET 成像：借助冷冻共焦地图将荧光坐标转入 FIB 铣削，获得含突起的 lamellae，倾转采集后在 tomogram 中可见管状结构、分泌颗粒样囊泡、溶酶体、自噬泡、线粒体、过氧化物酶体及髓鞘碎片，并经采后荧光验证位置一致。

cryoET 输出的生理相关性：分泌颗粒样囊泡较 r.t. EM 更长且直径更窄，管状结构直径由约20 nm 增至55.2 nm，呈1.6倍扩张；髓鞘碎片与溶酶体、自噬泡、过氧化物酶体邻近，提示突起正降解内化髓鞘。所有量值均落于文献报告区间，验证 cryoET 较 r.t. EM 更具生理相关性。

讨论部分总结：研究人员强调 PF 可稳健玻璃化约100 μm 小鼠脑片，10% PVP 加0.3 M trehalose 的2倍渗透压短时浸泡不影响低分辨率形态，但海藻糖羟基可能扰蛋白构象，故高分辨率宜用 PVP 类；脑组织蛋白致密且内源低温保护成分可能是 PF 成功关键，肝心等器官经配方优化亦可能适用。局限在于该流程专为小鼠脑优化，无高分辨率蛋白结构输出，最理想低温保护配方仍待定。

研究结论部分翻译：此处研究人员基准化了小鼠脑组织上的 PF 及随后在 LMIS 与等离子体型仪器上跨全厚度的靶向 lamellae 制备。手中数据显示约100 μm 组织片可稳健玻璃化，但该极限因器官与低温保护剂而异。基于冰质数据，10% PVP 加0.3 M trehalose 与15% PVP 被定义为玻璃化最适组合。研究人员通过约32000 μm³ 大体积 cryo-FIB/SEM 数据确认无 r.t. EM 典型脑收缩；10% PVP 加0.3 M trehalose 的2倍渗透压升高在30分钟浸泡内不产生可见伪影，可用于低分辨率形态评估，但为免海藻糖干扰天然蛋白构象，建议高分辨率结构测定用 PVP 混合物。未来低于15% PVP 的配方最有希望兼顾生理相关与稳健 PF 玻璃化。研究人员靶向5 μm 荧光区，若需百纳米级亚细胞定位，仍需超分辨 cryo-FLM 与三重合活荧光监测发展。脑组织因天然低温保护剂与高蛋白密度成为 PF 理想模型，肝、心经优化亦可能入列。该流程为以基础玻璃化仪器开展多尺度生理相关冷冻成像奠定基石。