敲低CDC20可通过TSC1介导的mTOR通路抑制成纤维细胞活化，从而减轻肺纤维化

《Cellular Signalling》：Knockdown of CDC20 attenuates pulmonary fibrosis by repressing fibroblast activation via the TSC1-mediated mTOR pathway

　　

摘要

特发性肺纤维化（IPF）是一种致命的纤维化肺部疾病，与成纤维细胞激活密切相关。细胞分裂周期蛋白 20 同源物（CDC20）调节细胞周期进程，但其在肺纤维化中的作用尚不清楚。本研究旨在探索 CDC20 在 IPF 中的功能，并调查 CDC20 影响肺纤维化进展的潜在机制。在这里，我们发现 CDC20 的表达水平在博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化小鼠肺组织以及活化的成纤维细胞中均上调。通过增强自噬，CDC20 敲低抑制了 TGF-β1 触发的 MRC-5 激活。然而，氯喹（CQ）介导的自噬抑制废除了这种对成纤维细胞激活的调节作用。CDC20 敲低还抑制了 TGF-β1 诱导的成纤维细胞迁移和收缩。CDC20 沉默对 BLM 诱导的小鼠肺损伤具有保护作用，且 CDC20 敲低抑制了肺组织中的纤维化并促进自噬。通过 IP/LC-MS 筛选了与 CDC20 相互作用的蛋白 TSC1，免疫共沉淀分析显示 TSC1 与 CDC20 相互作用，且 CDC20 促进了 TSC1 的泛素化降解。在机制上，CDC20 增强了 TSC1 的泛素化和降解，TSC1 的减少促进了 mTOR 通路的激活，从而抑制成纤维细胞自噬，进而促进成纤维细胞激活。总体而言，CDC20 通过阻断 mTOR 信号通路抑制成纤维细胞自噬，从而加剧了肺纤维化，这表明靶向 CDC20 可能对 IPF 具有潜在的治疗效果。

引言

特发性肺纤维化（IPF）是一种病因不明的上皮驱动的间质性肺疾病。其特征为成纤维细胞异常过度增殖和细胞外基质过度沉积，伴随着肺功能进行性、不可逆恶化及高死亡率 [1]、[2]。病理过程涉及肺泡上皮细胞的反复损伤和异常修复，导致肺实质纤维化和炎症反应；然而，IPF 的有效治疗手段仍然极其有限 [3]。除了肺移植 [4] 外，一线临床抗纤维化治疗药物如吡非尼酮和尼达尼布已被证明能有效减缓 IPF 的进展 [5]。尽管如此，它们与一系列不良反应相关，这些反应会损害患者预后，包括与胃肠道、肝胆系统、皮肤、神经系统和血管相关的副作用 [6]、[7]。

细胞分裂细胞周期蛋白同源物 20（CDC20）作为后期促进复合物/细胞周期蛋白的高度保守激动剂，通过靶向并介导核心细胞周期调节因子的降解，在有丝分裂中发挥关键的调节作用。越来越多的研究表明，CDC20 在各种恶性肿瘤中过表达 [8]、[9]。它通过控制有丝分裂动力学和细胞凋亡促进肿瘤的发生和进展。累积的研究揭示了 CDC20 在纤维化发病机制中的关键参与作用。整合泛癌分析表明，CDC20 表达与大多数肿瘤类型中的癌症相关成纤维细胞浸润呈正相关 [10]。在肾纤维化模型中，抑制 CDC20 通过调节β-catenin 核转位减轻肾小管上皮细胞和成纤维细胞中的纤维化反应 [11]。此外，在 TGF-β1 刺激的成纤维细胞中沉默 CDC20 显著缓解了细胞激活和细胞外基质沉积 [11]。IPF 的本质在于由肺泡上皮细胞反复损伤和丢失驱动的病理过程 [12]。这一过程刺激成纤维细胞增殖并激活为肌成纤维细胞，从而推动肺纤维化的发生和进展 [13]、[14]。活化的成纤维细胞是 IPF 及其他相关纤维化疾病中的核心效应细胞 [15]。总之，这些发现提示 CDC20 可能在抑制肺成纤维细胞激活方面具有治疗潜力。

自噬作为一种关键的细胞内回收和稳态维持机制，对于维持肺组织稳态不可或缺。研究表明，特发性 IPF 患者的肺组织中存在自噬流受损和功能降低 [16]、[17]。这表现为自噬体数量减少、自噬体 - 溶酶体融合受损以及细胞内 p62 和泛素化蛋白的积累。这种自噬功能缺陷既是 IPF 的关键病理特征，也是其进展的直接驱动因素。进一步的研究表明，成纤维细胞过度增殖部分与自噬受损有关 [18]。同时，自噬通过调节成纤维细胞凋亡和肺上皮衰老在减轻纤维化病理方面发挥保护作用 [19]。因此，恢复或增强自噬功能成为改善 IPF 的潜在治疗策略。除了其在细胞周期进程中的经典作用外，CDC20 已被证明是一种多功能调节因子，能够通过多条通路影响细胞自噬活性 [20]、[21]、[22]。在心力衰竭小鼠模型中，心脏组织中的 CDC20 表达显著上调。敲低 CDC20 通过增强自噬流减轻了心脏损伤 [20]、[22]。这表明 CDC20 表达水平与自噬活性之间存在密切的功能关系。总之，这些研究揭示了 CDC20 在有丝分裂之外细胞稳态调节中的广泛作用，特别是在调节自噬这一关键生存通路方面。鉴于 CDC20 在纤维化和自噬调节中的双重作用，我们假设 CDC20 可能通过调节自噬活性影响 IPF 的疾病进展。

为了研究 CDC20 调节 IPF 的机制，我们建立了博来霉素（BLM）诱导的实验性肺纤维化小鼠模型和 TGF-β1 刺激的人肺成纤维细胞模型。这些体外和体内实验表明，CDC20 敲低增强了自噬活性并改善了 IPF 的进展。我们进一步发现，CDC20 通过泛素化和降解结节性硬化复合物 1（TSC1）来抑制自噬，从而促进 mTOR 通路。这导致 p62 和α-SMA 表达增加，最终驱动肺纤维化进展。这些观察表明，CDC20 介导的 mTOR 信号增强是通过促进 TSC1 降解实现的。随后激活的 mTOR 通路抑制细胞自噬，从而推动 IPF 的疾病进展。

章节片段

细胞系、试剂和抗体

人胚胎肺成纤维细胞 MRC-5 购自 Cellverse 有限公司。细胞在含有 10% FBS（Servicebio）的 DMEM 中培养。所有细胞均在 37°C、5% CO₂条件下培养。在体外，MRC-5 细胞被感染 CDC20 shRNA 或 TSC1 shRNA 质粒以获得 CDC20 敲低或 TSC1 敲低的 MRC-5 细胞。对于自噬抑制，转染细胞用 5 ng/mL TGF-β1 联合 20 μM 氯喹（CQ）处理 24 小时。

TGF-β1 购自 MedChemExpress

CDC20 在 BLM 小鼠肺组织和 TGF-β1 刺激的 MRC-5 中的表达增加

为了探索 CDC20 在肺纤维化中的表达，我们检测了 BLM 诱导的实验性肺纤维化中 CDC20 的转录和表达。H&E 结果显示，BLM 诱导了小鼠肺泡结构损伤、胶原沉积和小叶间隔增厚（图 1a-b）。BLM 小鼠中的胶原纤维也显著增加，表明 BLM 确实在小鼠中诱导了肺纤维化。CDC20 在肺纤维化中的表达增加（图 1a-c），并且显示了

讨论

IPF 是一种特发性间质性肺病，以异常成纤维细胞增殖和分化为标志，最终导致不可逆的肺功能障碍、进行性呼吸衰竭和较差的临床预后 [2]、[35]。在这里，我们证明 CDC20 在 BLM 损伤小鼠的肺部和 TGF-β1 诱导的成纤维细胞中显著上调，与纤维化相关标志物呈正相关。CDC20 通过促进...促进了 TGF-β1 诱导的成纤维细胞激活

结论

总之，我们发现 CDC20 通过促进 TSC1 泛素化降解，从而激活 mTOR 信号通路，促进成纤维细胞激活。这些发现不仅加深了我们对 IPF 发病机制和成纤维细胞转分化机制的理解，而且表明抑制 CDC20 可能代表一种改善和治疗 IPF 的有前景的治疗模式。

动物对象

本研究是根据 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行的。本研究获得郑州大学第一附属医院机构动物护理和使用委员会批准（批准号 2025-KY-1240-003）

伦理批准

所有动物实验均按照郑州大学第一附属医院机构动物护理和使用委员会批准的伦理标准进行（2025-KY-1240-003）。

CRediT 作者贡献声明

Yatao Guo：撰写 – 初稿，资金支持，正式分析，概念化。Mengchan Zhu：方法论，正式分析，数据管理。Ruyi Li：方法论，调查，数据管理。Jia Li：方法论，数据管理。Jiming Si：调查，数据管理。Yuanhua Liu：方法论，数据管理。Jingjing Mei：可视化，验证，正式分析。Yan Kang：验证，方法论，调查。Jianjun Jin：撰写 – 审查与编辑，监督，资源，

资金支持

本研究由河南省医学科技研究计划联合建设项目（编号 LHGJ20200350）支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的 competing 财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文所述工作的发表。

Yatao Guo|Mengchan Zhu|Ruyi Li|Jia Li|Jiming Si|Yuanhua Liu|Jingjing Mei|Yan Kang|Jianjun Jin

郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，中国河南郑州