通过空间代谢组学与转录组学绘制雄性斑马鱼VX诱导神经毒性的分子网络

《Chemico-Biological Interactions》：Mapping the Molecular Network of VX-Induced Neurotoxicity in Male Zebrafish through Spatial Metabolomics and Transcriptomics

　　

摘要

VX是一种持久性有机磷神经毒剂，其环境风险不容忽视。传统的匀浆多组学方法无法解析毒素分布的空间异质性或相应的局部分子变化。空间分辨质谱成像技术克服了这一局限，能够直接在脑区中可视化VX及其代谢物与失调的内源性分子的空间分布。本研究将雄性斑马鱼连续暴露于三种浓度的VX（低浓度=19.36 μg/L，中浓度=77.43 μg/L，高浓度=154.86 μg/L）中96小时。行为学检测显示，运动活性和探索行为呈剂量依赖性降低。组织病理学分析揭示了进行性脑损伤，TUNEL染色显示神经元凋亡随剂量增加而显著增多。相应地，脑内乙酰胆碱酯酶（AChE）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性随VX浓度升高而显著下降。DESI-MSI可视化了VX在脑内的剂量依赖性蓄积和空间分布。整合转录组学和空间代谢组学分析鉴定出花生四烯酸代谢和铁死亡为主要的神经毒性通路。重要的是，本研究建立了从VX在脑中的空间分布到局部分子扰动和全身毒性的整合性关联，表明行为和组织学缺陷伴随AChE抑制、氧化应激相关变化、凋亡以及脂质代谢和程序性细胞死亡通路的改变。本工作提供了一种评估化学战剂在水生生态系统中毒性生态风险和健康风险的新型多尺度分析框架。

引言

海洋生态系统中废弃的化学弹药构成了持续而严重的生态威胁[1]。海水长期浸泡逐渐腐蚀金属外壳，导致有机砷化合物和神经毒剂等危险化学战剂持续释放[2,3,4]。随着腐蚀进程加剧，预计未来几十年内这些剂量的沉积物浓度将达到峰值[4]。值得注意的是，VX是一种V系列有机磷（OP）神经毒剂，其特点是无色无味、挥发性低且环境持久性极强：其中性水溶液（pH 7）中半衰期约为4.78天，而在寒冷海洋条件（4°C）下可达数年[5]。这种高度持久性结合多种环境传输途径（如雨水侵蚀、地表径流和土壤渗透），显著增加了VX污染水生生态系统的风险。然而，关于VX在水生生物中毒理学机制的研究仍然相对有限。

VX主要通过乙酰胆碱酯酶（AChE）的不可逆磷酸化和抑制发挥神经毒性作用，导致乙酰胆碱（ACh）在突触间隙蓄积，引起神经肌肉功能障碍等急性症状。其毒性效应还因丁酰胆碱酯酶（BChE）的抑制以及与非酶靶标的相互作用而加剧，整体神经毒性源于多条通路的协同作用[6,7,8]。近期利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的运动神经元模型的研究表明，VX可诱导内在和外在凋亡通路的浓度和时间依赖性激活，同时抑制神经突起生长[9]。多组学方法进一步推动了VX研究。Nirujogi等人[10]将定量磷酸化蛋白质组学应用于大鼠梨状皮层，鉴定出VX诱导的关键蛋白磷酸化改变——包括离子通道、转运蛋白、激酶和磷酸酶——这强调了信号网络的显著破坏。类似地，Glaros等人[11]在水豚中将鸟枪法蛋白质组学与非靶向代谢组学相结合，揭示VX暴露调节糖酵解和三羧酸循环（TCA）相关酶以及血浆中相关的代谢前体。尽管取得这些进展，VX暴露的全面转录组学分析和空间分辨分子图谱仍然缺乏，阻碍了对VX整体机制景观的全面理解。

鉴于VX毒性的复杂性，选择合适的体内模型对机制毒理学研究至关重要。虽然AChE抑制已被确立为VX的核心毒性机制，但大多数先前研究聚焦于哺乳动物模型和传统毒理学终点[7,12]。因此，VX在水生生物中的神经毒性效应和多维度调节机制仍然知之甚少。斑马鱼（Danio rerio）是一种与人类共享约70%基因同源性的脊椎动物模型，广泛应用于生态毒理学和神经毒性研究。这一实用性归因于其脑结构和关键信号通路与哺乳动物的高度进化保守性，以及胚胎光学透明性、高繁殖力和短世代时间等实验优势[13,14]。Fan等人进一步证明环境污染物可在斑马鱼中产生神经发育行为、氧化应激和转录改变，支持了该模型在机制神经毒性评估中的敏感性[15]。作为水生物种，斑马鱼在水中完成整个生命周期，能够直接且生态相关地模拟水中暴露场景。其半透性皮肤和高效鳃系统使其对VX等水溶性神经毒素高度敏感，从而便于研究环境污染的急性和慢性效应——这是陆地啮齿类模型无法充分复制的暴露途径。新兴证据证实，包括VX在内的化学战剂会在斑马鱼中诱发有害效应[16,17]。此外，成年斑马鱼比幼体表现出更复杂且常具性别二态性的行为表型[18,19]，使其成为评估VX等污染物行为性和分子性神经毒性的特别适宜模型。

依赖宏观终点的传统毒性评估提供的机制见解有限[20]。整合多组学策略（如将转录组学与代谢组学相结合）已被证明对重建毒理学通路高度有效[21,22]。例如，Li等人将代谢组学与网络药理学相结合，将创伤性脑损伤中与疾病相关的代谢改变与候选生物活性成分和分子靶标联系起来，促进了关键机制通路的识别及后续实验验证[23]。类似地，Jia等人结合16S rRNA测序、非靶向代谢组学、网络药理学和转录组学，表征了互补的微生物组、代谢物、靶标和基因水平响应，展示了多层数据整合在解析复杂生物机制中的价值[24]。近期水生生物中的整合多组学分析同样将转录组和代谢组学响应与协调的免疫代谢表型联系起来，支持了跨组学整合在鱼类模型中的效用[25]。然而，传统代谢组学丢失了空间信息。空间代谢组学，特别是质谱成像（MSI）的出现，克服了这一局限，能够在组织中进行无标记、空间分辨的代谢物图谱绘制[26]。近期的MSI研究揭示了暴露于异恶草啶和PFOS等污染物的斑马鱼中区域特异性代谢扰动，突出了其在毒理学中的强大能力[27,28]。除MSI外，新兴的扩增成像策略实现了斑马鱼发育过程中糖基化RNA的灵敏原位可视化，凸显了空间分子图谱技术在该模型中快速发展[29]。

在本研究中，我们整合空间代谢组学与转录组学，以行为和组织病理学验证为锚点，阐明了VX在雄性斑马鱼中的神经毒性机制。利用DESI-MSI，我们在斑马鱼组织切片中对VX及其主要代谢物乙基甲基膦酸（EMPA）的空间分布进行了图谱绘制。转录组学和空间代谢组学数据的整合使我们构建了分子网络，将基因表达变化与区域代谢紊乱联系起来。进一步与超微结构损伤（TEM）和行为功能障碍关联，使我们构建了全面的"空间分布-分子扰动-行为结果"框架。我们的发现为VX神经毒性提供了新的分子见解和空间明确的生物标志物，为评估化学战剂在海洋环境中的生态风险提供了一种强大的新方法。

材料与方法

试剂

VX（纯度98%）购自中国北京化学防御研究院分析化学实验室。质谱级乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）购自赛默飞世尔科技（中国上海）。EMPA（纯度>97%）和异丙基甲基膦酸（IMPA，内标，纯度>97%）购自Aldrich（美国威斯康星州密尔沃基）。分析级异丙醇（IPA）购自商业供应商。

实验动物与设计方案

成年雄性斑马鱼（总量…）

结果

VX暴露降低斑马鱼的运动行为

开阔场实验表明，VX暴露诱导斑马鱼出现显著且具有剂量依赖性的运动障碍。与对照组相比，总移动距离（图1D）在低浓度组降低约25.52±8.43%，中浓度组降低31.42±6.91%，高浓度组降低73.65±4.33%。同样，平均游泳速度（图1E）在低、中、高浓度组分别降低29.83±12.61%、38.84±6.16%和69.31±5.75%。累积运动时间（图1F）…

讨论

作为一种高毒性和环境持久性极强的化学战剂，有机磷神经毒剂VX的环境残留和潜在暴露风险值得严重关注。本研究考察了VX对斑马鱼运动和探索行为的影响，并确认暴露导致脑组织病理学损伤、凋亡和AChE抑制。我们进一步表征了VX及其…

结论

总之，本研究整合了行为学、组织病理学、生物化学、DESI-MSI、转录组学和空间代谢组学分析，表征了VX在成年雄性斑马鱼中诱导的神经毒性。VX暴露损害了运动和探索行为，引起脑损伤和凋亡，抑制AChE活性，并破坏了抗氧化防御。DESI-MSI揭示了VX和EMPA的脑关联蓄积以及空间代谢改变。整合多组学分析…

作者贡献声明

Chen Wang：撰写—审阅与编辑、监督、项目管理。Manzhu Cao：撰写—初稿、软件、方法论。Yi Zhang：软件、方法论。Mengxuan Dong：方法论。Jingjing Shi：方法论。Yuxin Lin：软件。Tong Shi：项目管理。Qian Jin：数据整理。Yuanqing Chen：方法论。Xingxing Zong：撰写—审阅与编辑、监督。

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经国家NBC危害防护化学重点实验室批准（批准号：NO. LAE-2024-08-001）。

机构审查委员会声明

所有程序均按照国家NBC危害防护化学重点实验室的指南进行（NO. LAE-2024-001）。

利益冲突声明

作者声明他们不存在任何可能影响本论文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

数据可用性

数据可根据合理要求提供。

资金

本研究未获得资助。

利益冲突声明

√ 作者声明他们不存在任何可能影响本论文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究由国家NBC危害防护化学重点实验室资助。

作者：Manzhu Cao|Yi Zhang|Mengxuan Dong|Jingjing Shi|Yuxin Lin|Tong Shi|Qian Jin|Yuanqing Chen|Xingxing Zong|Chen Wang

单位：国家NBC危害防护化学重点实验室，北京，中国，邮编102205