人肝细胞对瑞格列奈的代谢揭示了CYP2C8的主导作用，以及肝脏亚细胞组分和重组酶对CYP3A4的错误归属

《Drug Metabolism and Disposition》：Repaglinide metabolism by human hepatocytes reveals CYP2C8 dominance and mis-assignment of CYP3A4 by liver sub-cellular fractions and recombinant enzymes

　　

摘要

瑞格列净是一种抗糖尿病药物，也是FDA认可的CYP2C8临床探针，其在人体中的代谢谱已得到充分表征，其中主要代谢物M2（一种二羧酸）占总给药量的66%。其余剂量分布于M1（4%）、未代谢的瑞格列净（2%）、M4（<0.5%）、若干微量代谢物（各<1%）以及部分未鉴定代谢物中。尽管大量的体内证据支持瑞格列净作为CYP2C8探针，但体外研究表明CYP3A4对其整体代谢的贡献更大。以往使用化学抑制剂在人体肝细胞亚细胞组分和重组酶中进行的研究，一致将M1和M4的生成分别归因于CYP3A4和CYP2C8，而M2的生成则主要通过CYP3A4介导的首步反应，随后由胞质酶完成后续转化。然而，在人体肝细胞（HH）中并未进行使用化学抑制剂的相应实验。受我们近期数据启发——该数据表明人肝微粒体（HLM）和重组酶可能导致CYP3A4参与程度的错误归属——本研究将这些基质与HH进行了比较。在此研究中，HLM、肝S9组分和重组酶同样将M1和M4的生成分别归因于CYP3A4和CYP2C8。相比之下，在HH中，略超过一半的M1生成归因于CYP2C8，鉴于该酶肝脏表达量较低且对亚细胞组分的贡献极小，这一结果令人意外。M4的生成在HH中仍主要依赖CYP2C8。关键的是，与亚细胞组分中的结果相反，HH显示CYP3A4对主要体内代谢物M2的生成几乎没有参与，从而确立了CYP2C8作为主要酶的地位。这些发现为阐明瑞格列净的药代动力学提供了有力数据，并表明仅依赖肝亚细胞组分或重组酶存在将CYP3A4错误归属的实际风险。

引言

瑞格列净是一种氨基甲酸苯甲酸衍生物（图1），用于2型糖尿病的管理¹。作为一种短效胰岛素分泌刺激剂，其有效使用需要透彻了解其药代动力学及影响药代动力学的因素，以实现最佳血糖控制²。事实上，关于瑞格列净代谢的大量文献已经存在，体外研究提示细胞色素P450 2C8（CYP2C8）是主要代谢酶^3,4,5,6。相比之下，体外研究支持CYP3A4是瑞格列净的主要代谢酶^7,8,9。尽管已进行广泛调查，CYP2C8和CYP3A4对瑞格列净代谢贡献不一致的机制基础仍不清楚。

一项使用放射性标记瑞格列净在健康志愿者中开展的ADME研究显示，主要代谢物M2——一种二羧酸（图1）——占总给药量的66%¹⁰。剩余剂量分布于M1（芳香胺，4%）、未代谢的瑞格列净（2%）、M4（4'-羟基瑞格列净，<1%）以及若干其他代谢物（各<1%）中。¹²鉴定出的一种直接酰基葡萄糖醛酸苷可能解释了van Heiningen等人¹⁰之前报告的某些未鉴定代谢物。超过90%的放射性物质从粪便中回收，其中仅有2%为未代谢药物。

瑞格列净的药代动力学在患者中表现出显著的人间差异¹³，在健康志愿者中，有机阴离子转运多肽1B1（OATP1B1）和CYP2C8的多态性被证明是影响这种差异的重要因素^5,14。因此，FDA认可瑞格列净作为CYP2C8活性的临床探针。尽管CYP3A4抑制剂会改变瑞格列净的药代动力学¹⁵，但与CYP2C8抑制剂相比¹⁶，暴露量的变化通常较小。对于某些抑制剂如非诺贝特和环孢素（同时抑制OATP1B1），很难区分酶介导的变化和转运体介导的变化对瑞格列净暴露量的影响。总体而言，体内研究将瑞格列净代谢描述为以CYP2C8为主导，尽管M4是唯一与体内CYP2C8活动可靠相关的代谢物³，且仅代表总剂量的不到0.5%¹⁰。这一差异使该药物作为CYP2C8探针的适用性存疑，因为如此微小的代谢物不应解释支撑其探针地位的观察到的暴露量变化。

使用人肝微粒体（HLM）、人肝S9（HLS9）和重组酶进行的体外研究一致发现CYP3A4和CYP2C8分别对M1和M4的生成贡献最大^7,9,12。Sall、Houston和Galetin⁹以及¹²的研究表明M2的生成是一个涉及CYP和胞质酶的多步过程。关键的是，尽管这两项研究均包含人体肝细胞（HH），但通过化学抑制剂进行的CYP鉴定是使用HLS9完成的，两项研究均将CYP3A4确定为M2生成中涉及的主要CYP。

最近，使用cMET抑制剂savolitinib，我们证明HLM和重组酶可能错误地将CYP3A4指定为主要代谢酶¹⁷。相比之下，HH准确地将CYP1A2识别为主要酶，与临床药物-药物相互作用（DDI）数据一致^18,19。因此，本研究旨在利用HH调查CYP3A4和CYP2C8在瑞格列净代谢中的相对作用，并提供可阐明其药代动力学（包括临床DDI数据）的可靠数据，同时强调仅依赖肝亚细胞组分和重组酶时错误将CYP3A4指定为主要酶的实际风险。

各节片段

材料与方法

化学品与试剂。瑞格列净、阿莫地喹和孟鲁司特在AstraZeneca内部合成。还原型NADPH和azamulin购自Sigma-Aldrich。主要瑞格列净代谢物2-脱哌啶基-2-(5-羧基戊胺

瑞格列净)(M2)购自BOC Sciences。重组酶CYP2C8(456252 批次2411123和2507030)和CYP3A4(456202 批次2304045)均共表达NADPH-P450还原酶和细胞色素b₅，购自Discovery Life Sciences。HLM(150例混合样本)

结果

重组CYP3A4和CYP2C8对瑞格列净的相对代谢。本研究关注三个关键代谢物的生成，它们是围绕CYP2C8和CYP3A4对瑞格列净代谢贡献争议的核心，包括芳香胺M1、主要体内代谢物M2（二羧酸）以及4'-羟基瑞格列净M4¹⁰。由于M2的生成是一个两步过程，需要CYP催化的首步反应随后由胞质酶完成^9,12，

讨论

自发现CYP3A4被HLM和重组酶错误指定为savolitinib的主要代谢酶¹⁷以来，后续内部研究揭示了其他化合物也存在类似的CYP3A4错误归属（未发表）。值得注意的是，在所有案例中，HH都准确识别了主要代谢酶，与临床DDI发现一致。对于某些化合物如咪达唑仑（图4 a – c ii），所有体外模型一致地将CYP3A4识别为主要

数据可用性

作者声明，支持本研究结果的所有数据均包含在论文内

CRediT作者贡献声明

Tashinga E. Bapiro：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，方法学，形式化分析，概念构思。

CRediT作者贡献声明

Tashinga Bapiro：概念构思，调查，方法学，可视化，撰写—初稿，审阅与编辑。

致谢

作者感谢与许多AstraZeneca同事（过去和现在的）进行的许多有益讨论

资金支持

资金支持由AstraZeneca提供

利益冲突：作者声明与本文章内容不存在实际或感知的利益冲突

Tashinga E. Bapiro

DMPK，肿瘤研究与开发部，AstraZeneca，英国剑桥