《Ecotoxicology and Environmental Safety》：6PPD-quinone aggravates airway inflammation in neutrophilic asthma: Evidence from network toxicology and
in vivo validation
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N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-对苯二胺醌（6PPD-Q）是一种新兴的轮胎来源环境污染物，广泛存在于空气颗粒物中，引发对其呼吸系统健康效应的关注。然而，其在哮喘中的作用仍知之甚少。研究人员采用结合网络毒理学、生物信息学分析、分子对接和体内验证的综合方法
N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-对苯二胺醌（6PPD-Q）是一种新兴的轮胎来源环境污染物，广泛存在于空气颗粒物中，引发对其呼吸系统健康效应的关注。然而，其在哮喘中的作用仍知之甚少。研究人员采用结合网络毒理学、生物信息学分析、分子对接和体内验证的综合方法，探讨6PPD-Q在哮喘中的作用机制。网络毒理学分析确定了6PPD-Q与哮喘之间的374个共享靶点，这些靶点富集于炎症和免疫相关通路，包括趋化因子、NF-κB和IL-17信号通路。蛋白质-蛋白质相互作用分析进一步确定了靶点网络中的10个hub基因。使用GSE143303数据集进行的验证表明，这些hub基因主要与中性粒细胞性哮喘相关，其特征是CCL2、CXCL8和CXCL10表达增加。将中性粒细胞性哮喘相关差异表达基因与网络来源靶点整合，并经最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归，确定了7个关键基因，其中CXCL8、C2和FGR显著上调。免疫浸润分析提示这些基因与固有免疫细胞反应密切相关。分子对接显示6PPD-Q与FGR之间存在强的预测性相互作用，结合能为?8.6 kcal/mol。体内实验中，单独暴露于6PPD-Q在非哮喘小鼠中引起轻度肺部炎症。在中性粒细胞性哮喘小鼠中，6PPD-Q进一步加重了气道炎症和高反应性，而在嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠中未观察到显著的额外变化。这些效应伴随肺FGR表达增加以及Src家族激酶的激活磷酸化。总之，6PPD-Q具有内在促炎作用，但优先加重中性粒细胞性哮喘，FGR可能作为候选介质，值得功能验证。
哮喘是一种常见的慢性呼吸系统疾病，以气道炎症、可逆性气流受限和黏液高分泌为特征，给全球健康带来沉重负担。2021年全球疾病负担研究显示，2005年至2021年全球哮喘患病率增加了9.24%，影响约2.6亿人。哮喘气道炎症具有显著异质性，可大致分为嗜酸性粒细胞性、中性粒细胞性和寡粒细胞性等表型。嗜酸性粒细胞性哮喘主要由2型免疫反应驱动，而中性粒细胞性哮喘通常属于非2型或2型低哮喘，以中性粒细胞浸润增加为特征，与1型和T辅助17（Th17）免疫反应相关。空气污染物暴露是哮喘发生和加重的重要危险因素。6PPD-Q是轮胎抗氧化剂6PPD经臭氧化、热氧化和光氧化生成的转化产物，在粉尘和PM
2.5中广泛检出。已有研究表明，6PPD-Q可损伤肺泡巨噬细胞固有免疫并加剧细菌性肺炎；网络毒理学研究提示6PPD/6PPD-Q可能通过干扰线粒体电子传递链、激活NF-κB和JAK/STAT通路促进呼吸道炎症。然而，6PPD-Q在哮喘，尤其是中性粒细胞相关气道炎症中的作用及机制仍不清楚。为此，研究人员开展了本研究。
研究人员采用网络毒理学、生物信息学分析、分子对接和体内验证相结合的策略，系统探讨6PPD-Q在哮喘中的作用机制。主要技术方法包括：利用ChEMBL、SwissTargetPrediction和TargetNet数据库获取6PPD-Q靶点，利用GeneCards和OMIM数据库获取哮喘靶点；通过STRING和Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并鉴定hub基因；使用R包clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析；采用GSE143303数据集（来自支气管活检，包含嗜酸性粒细胞性哮喘22例、中性粒细胞性哮喘9例、寡粒细胞性哮喘16例和健康对照13例）验证hub基因在不同哮喘表型中的表达；将中性粒细胞性哮喘差异表达基因与网络靶点取交集，并用LASSO回归筛选关键基因；采用CIBERSORT算法进行免疫浸润分析；运用AutoDock Vina进行分子对接；动物实验中，雌性SPF C57BL/6J小鼠购自武汉大学实验动物中心，采用HDM±LPS建立嗜酸性和中性粒细胞性哮喘模型，6PPD-Q以0.2 μM、10 μL/只/天鼻内暴露14天，累计8.4 ng/只，然后评估气道炎症、炎症细胞、细胞因子、气道高反应性（AHR）及FGR表达和Src家族激酶磷酸化水平。
研究结果如下：
3.1 使用网络毒理学鉴定6PPD-Q与哮喘共享靶点。从三个数据库共获得1004个6PPD-Q相关靶点，从GeneCards和OMIM数据库获得4564个哮喘相关靶点，二者交集得到374个共享靶点。基于PPI网络和最大团中心性（MCC）算法，鉴定出10个hub基因，包括CXCL8、CXCR4、CX3CL1、CXCL10、CCR2、CCR7、CXCL2、CCL2、CCR3和CCR5。
3.2 GO和KEGG富集分析。GO富集显示，生物学过程主要涉及MAPK级联正调控、外源刺激反应、趋化因子介导的信号通路、白细胞迁移等；细胞组分主要位于质膜外侧、膜微区和囊泡腔等；分子功能涉及趋化因子受体活性、G蛋白偶联趋化因子受体活性、细胞因子受体结合和蛋白酪氨酸激酶活性。KEGG分析显示，共享靶点显著富集于趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt、NF-κB、TNF、IL-17和NOD样受体信号通路等炎症免疫相关通路。
3.3 不同哮喘表型中hub基因验证。在GSE143303数据集中，中性粒细胞性哮喘患者CCL2、CXCL8和CXCL10显著上调；嗜酸性粒细胞性哮喘仅CXCL8显著上调；寡粒细胞性哮喘无hub基因显著差异表达，提示这些hub基因主要与中性粒细胞性哮喘相关。
3.4 中性粒细胞性哮喘相关关键靶点筛选。将中性粒细胞性哮喘DEGs与6PPD-Q-哮喘共享靶点取交集获得20个候选基因，LASSO回归进一步筛选出7个关键基因：SMARCC2、CXCL8、ABCC10、FGR、PRKCE、C2和LTC4S。其中CXCL8、FGR和C2在嗜中性粒细胞性哮喘中显著上调，其余显著下调。ROC分析显示这些基因具有良好的区分能力。免疫浸润分析显示中性粒细胞性哮喘中中性粒细胞、M1和M2巨噬细胞、活化CD4记忆T细胞比例增加，调节性T细胞和初始B细胞减少；关键基因与多种免疫细胞浸润显著相关。
3.5 6PPD-Q与FGR的分子对接分析。FGR被选为候选关键靶点，分子对接显示6PPD-Q与FGR的结合能为?8.6 kcal/mol，提示强结合亲和力；6PPD-Q与ASP404形成氢键，并与VAL281、LEU325、ILE336和ALA403等残基形成疏水相互作用。
3.6 6PPD-Q优先加重中性粒细胞性哮喘小鼠的气道炎症和高反应性。在非哮喘小鼠中，6PPD-Q单独暴露仅引起轻度肺组织炎症评分升高和BALF中IL-1β、IL-17A水平升高。在中性粒细胞性哮喘小鼠中，6PPD-Q显著增加肺组织炎症评分、BALF中性粒细胞数、总细胞数和巨噬细胞数，显著增加IL-1β、CXCL1和IL-17A水平，并显著增强乙酰甲胆碱诱导的气道高反应性；而在嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠中无显著额外变化。此外，6PPD-Q暴露增加中性粒细胞性哮喘小鼠肺组织FGR蛋白表达和Src家族激酶（SFK）Tyr416磷酸化水平，但总Src蛋白表达无显著改变；嗜酸性粒细胞性哮喘中未见该效应。
讨论部分指出，本研究表明6PPD-Q具有内在肺部促炎作用，并优先加重中性粒细胞性哮喘，FGR可能通过调控中性粒细胞激活和巨噬细胞极化参与该过程。但研究存在局限性：FGR的因果作用仍需功能实验验证，磷酸化SFK抗体无法区分FGR特异性激活，且暴露模型为受控鼻内滴注而非真实环境吸入。
结论翻译：总之，研究结果表明，6PPD-Q在非哮喘小鼠中发挥内在肺部促炎作用，并优先加重中性粒细胞性哮喘小鼠的气道炎症和高反应性，而在嗜酸性粒细胞性哮喘小鼠中未观察到显著额外效应。整合生物信息学分析确定FGR为与固有免疫激活和中性粒细胞性气道炎症相关的候选介质，体内验证显示肺FGR表达和SFK激活磷酸化同步增加。这项工作为轮胎来源污染物加重中性粒细胞性哮喘提供了新证据，并强调FGR是该过程的候选介质。
