《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Exploring the targets and mechanisms of 6PPD-Q-induced cardiotoxicity: A network toxicology and molecular docking study
编辑推荐：
6PPD-醌（6PPD-quinone, 6PPD-Q）是轮胎抗氧化剂6PPD的转化产物，是一种新出现的交叉交通相关污染物，在水生物种中具有已充分证实的生态毒性。其在空气颗粒物、道路粉尘和人尿中的近期检出引发了对潜在人体健康影响的关注。然而，其对哺乳动物细胞的
6PPD-醌（6PPD-quinone, 6PPD-Q）是轮胎抗氧化剂6PPD的转化产物，是一种新出现的交叉交通相关污染物，在水生物种中具有已充分证实的生态毒性。其在空气颗粒物、道路粉尘和人尿中的近期检出引发了对潜在人体健康影响的关注。然而，其对哺乳动物细胞的心脏毒性仍知之甚少。研究人员整合了网络毒理学、分子建模与体外实验，以探究6PPD-Q对人AC16心肌细胞系的影响及潜在机制。网络毒理学识别出144个与6PPD-Q诱导心脏毒性相关的推定的靶点，TP53为排名第一的枢纽基因，其后依次为TRAF6、MAPK1、SQSTM1、TNF与IL6。富集分析突出氧化应激、炎症、凋亡与自噬调控为关键生物学过程。分子对接提示6PPD-Q与这些枢纽蛋白的潜在相互作用，分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟支持预测的6PPD-Q–p53复合物动态稳定性。实验中，6PPD-Q在AC16细胞中诱导显著活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累，24 h暴露半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC50）为13.92 μM。其促进p53在Ser15位点磷酸化，但不增加总p53蛋白或TP53 mRNA表达，表明应激相关的翻译后激活。该反应伴随TRAF6上调、MAPK1磷酸化增强及IL6与TNF表达和分泌增加，支持炎症应激信号激活。功能上，6PPD-Q触发线粒体凋亡，表现为线粒体膜电位丧失、Bax/Bcl-2比值升高及cleaved caspase-9与cleaved caspase-3激活。此外，6PPD-Q破坏自噬稳态，表现为LC3-II积累、p62耗竭、SQSTM1 mRNA降低、黄色LC3斑点增加与红色-only斑点减少，提示自噬体积累伴晚期自噬流受损。p53抑制剂Pifithrin-α（PFTα）可减轻6PPD-Q诱导的炎症反应、MAPK1磷酸化、线粒体凋亡与SQSTM1转录抑制，支持p53相关应激信号的功能参与。综上，这些发现表明6PPD-Q通过连接氧化应激、炎症信号、线粒体凋亡与自噬失调的p53相关应激网络诱导心肌细胞损伤，为其潜在心血管相关性提供机制见解。
研究背景方面，非尾气交通排放日益被认为是城市颗粒污染的重要来源，其中轮胎磨损颗粒及其关联化学物因广泛存在、跨介质迁移和人体暴露潜力而受到关注。6PPD是轮胎制造中广泛使用的抗氧化剂，在环境中经臭氧化和光化学氧化转化为6PPD-Q。6PPD-Q在道路粉尘、路边土壤、地表水、空气颗粒物、融雪水以及人尿和血液中均被检出，证实人体内暴露已经发生。已有研究主要集中于鱼类等水生物种，显示其可诱发急性心肺功能障碍、氧化应激和线粒体功能障碍；但6PPD-Q在人相关心肌细胞中的直接心脏毒性证据有限，机制尚未系统阐明。由于新兴污染物多以低剂量、长期、多组分方式作用，效应来自多稳态网络协同扰动而非单一靶点改变，因此亟需人相关模型中的机制研究。研究人员由此开展本研究，论文发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》。
关键技术方法方面，研究人员从Comparative Toxicogenomics Database（CTD，比较毒基因组数据库）与SwissTargetPrediction获取6PPD-Q人源假定靶点，从GeneCards、DisGeNET和CTD获取心脏毒性相关基因并取交集；利用DAVID进行基因本体（Gene Ontology, GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集；用STRING与Cytoscape构建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction, PPI）网络并以CytoNCA识别枢纽基因；用AutoDock Vina对六个枢纽蛋白做分子对接；用GROMACS做100 ns分子动力学模拟与MM-PBSA结合自由能计算；以人AC16心肌细胞为模型，通过细胞活力、ROS、ELISA、免疫荧光、流式凋亡、TUNEL、JC-1、MDC、mRFP-EGFP-LC3B串联荧光、Western blot和qRT-PCR验证；并以p53抑制剂Pifithrin-α（PFTα）做功能抑制验证。
3.1. Identification of overlapping targets potentially mediating 6PPD-Q cardiotoxicity：研究人员从数据库获得1627个6PPD-Q相关靶点与1512个心脏毒性基因，交集得到144个重叠基因，作为潜在介导6PPD-Q心脏毒性的共同靶点。
3.2. Enrichment analysis implicates stress, inflammation, and cell-death programs：对144个重叠靶点做GO与KEGG富集，显著条目指向缺氧响应、氧化应激、凋亡调控和炎症反应，以及Fluid shear stress and atherosclerosis、NOD-like receptor signaling pathway和Apoptosis等通路，提示氧化应激、炎症与程序性死亡可能构成毒性基础。
3.3. PPI network construction and hub gene identification：构建含143节点和1240边的PPI网络，按多中心性指标保留21个核心节点，按度中心性选出TP53、TRAF6、TNF、SQSTM1、MAPK1、IL6六个顶级枢纽基因用于后续对接。
3.4. Molecular docking predicts favorable interactions between 6PPD-Q and hub proteins：AutoDock Vina对接显示6PPD-Q与六个枢纽蛋白结合能均≤?5.0 kcal·mol?1，其中与MAPK1为?6.83、TRAF6为?6.27、IL-6为?5.97、TNF为?5.72、p53为?5.49、SQSTM1为?5.32；p53结合以TRP7、PHE3、CYS14、LEU10等疏水接触为主。
3.5. Molecular dynamics simulation supports the stability of the predicted p53–6PPD-Q complex：100 ns MD显示p53–6PPD-Q复合物RMSD约0.5 nm后稳定，半径 of gyration约1.05 nm，结合区波动低，氢键0–1条，MM-PBSA结合自由能为?67.94±7.17 kJ·mol?1，TRP7和PHE3为主要能量贡献残基，支持复合物动态稳定。
3.6. 6PPD-Q reduces AC16 cell viability in a concentration-dependent manner：CCK-8显示6PPD-Q在AC16中浓度依赖性降低活力，IC50为13.92 μM；选12.5 μM作机制研究浓度，可诱导损伤且保留足够活细胞。
3.7. 6PPD-Q induces oxidative stress and activates inflammatory signaling pathways：DCFH-DA显示ROS约增3.0倍；Western blot和qRT-PCR显示TRAF6上调、MAPK1磷酸化增强、TRAF6/MAPK1/IL6/TNF mRNA升高，ELISA显示IL-6与TNF-α分泌增加；PFTα预处理降低p-MAPK1和炎症因子分泌，说明p53相关应激信号参与炎症激活。
3.8. 6PPD-Q promotes p53 phosphorylation and nuclear accumulation：免疫荧光与Western blot显示p-p53（Ser15）升高并核聚集，总p53蛋白与TP53 mRNA反而下降，p-p53/p53比值上升，表明6PPD-Q通过氧化/基因毒应激样的翻译后修饰激活p53，而非转录上调。
3.9. 6PPD-Q induces mitochondrial apoptosis via caspase cascade activation：Annexin V/PI与TUNEL显示凋亡增加，JC-1红/绿比下降提示线粒体膜电位丧失；Bax升高、Bcl-2降低、Bax/Bcl-2比增至4.0倍，cleaved caspase-9和cleaved caspase-3升高；PFTα减轻凋亡、膜电位丧失及 caspase 激活，证明线粒体内源性凋亡部分依赖p53相关信号。
3.10. 6PPD-Q disrupts autophagy homeostasis with SQSTM1/p62 depletion：MDC荧光增强，LC3-II上升，p62下降，SQSTM1 mRNA显著下调；mRFP-EGFP-LC3B显示黄色自噬体斑点增多、红色-only自溶酶体斑点减少，提示自噬体积累而晚期自噬流受损；PFTα部分恢复SQSTM1 mRNA，表明p53相关应激信号参与p62转录抑制与自噬稳态破坏。
讨论部分总结：研究人员指出，6PPD-Q不再只是生态毒理问题，而是可能通过p53相关应激网络在人心肌细胞中引起氧化应激、TRAF6/MAPK1炎症信号、线粒体凋亡与SQSTM1/p62自噬失调的协同损伤。p53以Ser15磷酸化这种翻译后方式被激活，而非TP53转录上调，这使其更像是应激感应机器被环境化学物撬动。TRAF6与MAPK1把p53应激信号连接到IL-6和TNF-α释放；同时凋亡占优、自噬清除受阻，p62耗竭还削弱Keap1–Nrf2抗氧化适应，形成恶性循环。研究强调新兴污染物常通过网络水平扰动致毒，而非单靶点线性通路。研究人员也承认AC16缺乏心脏组织多细胞背景，PFTα不能完全界定因果层级，24 h高浓度不等于环境相关低剂量长期暴露，6PPD-Q–p53结合仍需生化验证。
结论部分翻译：本研究证明，6PPD-Q这一广泛存在的轮胎衍生污染物，通过涉及氧化应激、炎症信号、线粒体凋亡和自噬失调的p53相关应激网络，在AC16心肌细胞模型中诱导心肌细胞损伤。研究人员通过把网络毒理学与实验验证相整合，确定p53相关应激信号是把6PPD-Q暴露与细胞损伤联系起来的关键组分，TRAF6/MAPK1相关炎症信号与SQSTM1/p62失调作为重要下游效应者。这些发现为6PPD-Q潜在心血管相关性提供机制见解，并把对其毒性的认识从生态系统扩展到哺乳动物心肌细胞。更广泛地说，本研究印证了新兴环境污染物常通过网络水平扰动而非线性通路起作用这一观点，这对毒理测试与风险评估有重要含义。本研究的机制证据与在人体内基质检出6PPD-Q的生物监测数据、其全球环境分布和食物链转移潜力相汇合，强化了持续监管评估的依据。随着更安全轮胎抗氧化剂的开发，源头削减可成为未来风险管控中日益可行的组成部分。最终，本研究凸显了One Health方法的价值。
