单细胞转录组学揭示PM2.5暴露诱导的小鼠生殖损伤与胚胎发育缺陷

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Single-cell transcriptomics unveils PM 2.5 exposure-induced mouse reproductive damage linked to embryonic developmental defects

　　

本研究采用C57BL/6雄性小鼠，检测PM_2.5暴露对雄性生殖功能和早期胚胎发育的影响。单细胞转录组分析(single-cell transcriptomic analysis)揭示了PM_2.5暴露小鼠睾丸组织中从未分化精原细胞阶段开始的显著DNA损伤和代谢失调。非靶向代谢组学(untargeted metabolomics)进一步鉴定了精子中的代谢紊乱，包括半乳糖代谢、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢和核苷酸代谢等关键通路的显著改变。PM_2.5暴露显著损害了精子活力，从而降低了其受精能力。尽管PM_2.5暴露组的囊胚形成率与对照组无显著差异，但在围着床期胚胎中观察到明显的发育延迟，并伴有显著的转录组异常。值得注意的是，在2细胞期和囊胚期，差异表达基因的显著失调已很明显，提示PM_2.5暴露可能通过改变植入前胚胎的基因表达模式干扰后续发育过程。

环境空气污染是导致全球死亡和疾病的主要原因，其中PM_2.5（空气动力学直径≤2.5 μm的可吸入细颗粒物）可深入呼吸系统并进入体循环，与心血管疾病、神经毒性、呼吸系统疾病、不良妊娠结局及肾功能损伤等多种健康风险密切相关。流行病学证据显示PM_2.5对男性和女性生殖健康均有不良影响，但父系暴露对胚胎发育潜在后果的研究仍不充分。父系健康和疾病起源（POHaD）理论提出，父亲孕前环境暴露可通过精子表观遗传修饰和代谢重编程诱导后代远期发育缺陷，然而从父系PM_2.5暴露、精原细胞损伤、精子代谢紊乱到胚胎发育失败的完整分子链条尚缺乏系统性阐明。为此，研究人员利用单细胞转录组学、代谢组学及功能实验，系统解析了PM_2.5暴露对雄性小鼠生殖功能及早期胚胎发育的影响。

研究人员使用C57BL/6雄性小鼠，通过上海气象与环境动物暴露系统（Shanghai-METAS）进行12周浓缩环境颗粒物（CAP）暴露，对照组暴露于过滤空气。研究整合单细胞RNA测序、非靶向代谢组学、精子活力分析、体外受精及胚胎3D培养等技术，发现PM_2.5暴露导致未分化精原细胞DNA损伤和代谢失调，精子代谢谱异常，精子活力下降，受精能力降低，并诱发植入前胚胎及围着床期胚胎的转录异常和发育延迟。该研究揭示了PM_2.5影响雄性生殖的分子机制，为环境污染物相关生育力下降提供了理论依据。论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。

技术方法方面，样本来源于20只6周龄雄性C57BL/6小鼠，随机分为对照组（n=10）和PM_2.5暴露组（n=10），暴露于上海-METAS系统，暴露组平均PM_2.5浓度为70.28±35.83 μg/m3，对照组为18.19±8.59 μg/m3。主要关键技术包括：1）利用C4 scRNA-seq试剂盒构建单细胞文库，在BGISEQ-500平台测序，结合Seurat、Harmony、Monocle和CellRank等进行细胞注释、拟时间轨迹和RNA速率分析；2）采用UPLC-QToF/MS进行精子非靶向代谢组学分析，差异代谢物以VIP>1和校正p<0.05筛选；3）使用计算机辅助精子分析（CASA）系统评估精子活力；4）进行体外受精（IVF），并采用实验室优化的3D培养系统（IVC1+Matrigel）将囊胚培养至E5.0期；5）对2细胞、囊胚及E5.0胚胎分离的上胚层（Epi）和胚外外胚层（Exe）进行Smart-seq2测序，用DESeq2鉴定差异表达基因。其中代谢组学分析委托上海应用蛋白技术公司完成。

研究结果分述如下：

3.1 单细胞RNA测序揭示PM_2.5暴露下小鼠睾丸的显著转录组变化。通过scRNA-seq获得52,289个细胞，注释出6种生精细胞（精原细胞、粗线期精母细胞、双线期精母细胞、早期圆形精子细胞、中期圆形精子细胞、晚期圆形精子细胞）和3种体细胞（支持细胞、间质细胞、巨噬细胞）。尽管两组细胞比例无显著差异，但HE染色显示生精小管管腔扩大、生精上皮变薄、精原细胞排列紊乱及局灶空泡化。差异表达基因分析发现精原细胞中DEGs数量最多，未分化精原细胞富集于ncRNA代谢、DNA损伤反应及双链断裂修复通路；免疫荧光检测到γH2AX水平升高，证实DNA双链断裂损伤。

3.2 PM_2.5暴露雄性小鼠生精细胞功能差异的单细胞拟时间轨迹分析。利用Monocle2构建拟时间轨迹，将基因表达动态分为三个簇：簇1两组趋势相似；簇2中PM_2.5组相关基因在后期持续激活；簇3中PM_2.5组基因在中期即提前激活。KEGG富集显示簇2主要涉及核糖体、神经退行性疾病通路和氧化磷酸化，簇3主要涉及甘油磷脂代谢、泛素介导蛋白水解、内质网蛋白加工及代谢通路，表明PM_2.5干扰了生精过程的时序调控。

3.3 PM_2.5暴露干扰雄性小鼠精子代谢谱。非靶向代谢组学显示两组在正、负离子模式下代谢谱明显分离。正离子模式鉴定出22个显著差异代谢物，其中19个上调、3个下调；负离子模式鉴定出7个差异代谢物，全部上调。KEGG通路富集显示差异代谢物涉及半乳糖代谢、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、核苷酸代谢等关键通路，这些通路的改变与PM_2.5生殖毒性密切相关。

3.4 PM_2.5暴露对雄性小鼠精子功能和早期胚胎发育的不良影响。CASA检测显示PM_2.5组精子前向运动力降低约20%，静态精子比例显著增加，受精率下降20%，但囊胚形成率与对照组无显著差异。对2细胞期和囊胚期胚胎进行转录组测序，发现2细胞期有833个基因上调、218个下调，囊胚期有439个上调、123个下调。GO富集显示2细胞期DEGs主要涉及脂质代谢、脂肪酸代谢和DNA修复；囊胚期DEGs主要涉及细胞分化、凋亡正向调节和焦亡相关炎症反应，表明精子介导的父系效应导致了胚胎多层面生物学功能障碍。

3.5 PM_2.5暴露诱导围着床期胚胎转录失调并导致发育延迟。利用3D培养系统将囊胚培养至E5.0期，PM_2.5组围着床期胚胎出现显著发育迟缓。分离Epi和Exe进行Smart-seq2测序，Epi谱系有2796个基因上调、459个下调，主要富集于神经发育和胚胎发生；Exe谱系有1647个上调、316个下调，主要富集于胎盘形成和胚外发育。进一步交集分析显示，Epi谱系中109个重叠基因与胚层分化相关，涉及心脏瓣膜形态发生、脑发育和神经嵴分化等；Exe谱系中55个重叠基因主要涉及干细胞分化和胚胎上皮管形成。这些结果表明PM_2.5暴露主要损害上胚层谱系分化，并且该异常在囊胚期已开始出现。

讨论部分指出，PM_2.5主要靶向未分化精原细胞，诱导DNA损伤反应和代谢失调，符合环境毒素导致种系基因组不稳定的观点。拟时间轨迹分析显示转录和信号异常在精原细胞分化过程中持续存在并累及成熟精子，提示早期生殖细胞缺陷的重要性。精子代谢组改变中，半乳糖和核苷酸途径的扰动可能影响能量供给和表观遗传修饰，如甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的供应，可能与植入前胚胎转录失调相关。尽管PM_2.5暴露导致精子活力下降和受精率降低，但小鼠仍保持亚生育状态而非完全不育，这与人群流行病学中亚生育状态而非绝对不育的观察一致。虽然囊胚形成率未显著下降，但2细胞期已出现大量转录异常，提示精子携带的代谢或表观遗传异常影响早期胚胎。围着床期Epi谱系发育停滞和Exe谱系紊乱可能分别导致胎儿发育异常和胎盘功能障碍，为空气污染与不良妊娠结局的流行病学关联提供了机制线索。研究局限性包括仅评估F1代而无跨代追踪、缺乏直接表观遗传证据、未分析PM_2.5化学成分且scRNA-seq生物学重复仅两个。

研究结论：本研究表明，PM_2.5暴露导致雄性生殖系统发生显著改变，从生精功能障碍延伸至对胚胎发育的跨代效应。通过整合单细胞转录组学、代谢组学和功能分析，研究人员证明PM_2.5暴露通过未分化精原细胞的DNA损伤和代谢失调破坏睾丸稳态，最终损害精子质量和早期胚胎发生。scRNA-seq分析揭示PM_2.5暴露主要靶向未分化精原细胞，诱导DNA损伤反应和代谢失调，这与环境毒素导致种系基因组不稳定性的既往研究一致。拟时间轨迹分析发现，DNA修复通路的持续激活和代谢过程的提前诱导表明PM_2.5扰乱了生殖细胞发育的时间调控。这些发现不仅确认了PM_2.5诱导的睾丸组织病理学改变，还鉴定出精原细胞是主要细胞靶点。研究还提示，精子代谢改变与早期胚胎转录异常相关，可能通过代谢-表观遗传调控途径影响胚胎发育，但直接证据仍需进一步验证。总之，PM_2.5暴露相关的生殖损伤呈现从精原细胞到成熟精子、再到植入前和围着床期胚胎的逐步累积特征，为理解环境污染物对男性生殖健康的长期影响提供了新视角。