《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Multi-level evidence for Pb–Cd co-exposure nephrotoxicity: An integrated analysis of NHANES, outcome-oriented network toxicology, and cell-based validation
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摘要
背景：铅（Pb）和镉（Cd）仍是普遍存在的环境毒物，肾脏是其主要靶器官之一。然而，依赖单一生物标志物基质或肾脏终点可能无法全面表征Pb–Cd相关的肾脏异常。基于血液和尿液的Pb/Cd生物标志物在不同肾脏结局中是否表现出差异性的关联谱，以及结局导向的网络
摘要
背景：铅（Pb）和镉（Cd）仍是普遍存在的环境毒物，肾脏是其主要靶器官之一。然而，依赖单一生物标志物基质或肾脏终点可能无法全面表征Pb–Cd相关的肾脏异常。基于血液和尿液的Pb/Cd生物标志物在不同肾脏结局中是否表现出差异性的关联谱，以及结局导向的网络是否汇聚于共享的候选通路，目前仍不清楚。
方法：研究人员分析了NHANES 2011–2018年5049名成人的数据。采用调查加权回归评估血液和尿液Pb及Cd生物标志物与估算肾小球滤过率（eGFR）、白蛋白尿[log(UACR)]及CKD相容表型的关联，并使用病例加权分位数g计算和广义加权分位数和回归检验Pb–Cd混合物效应。采用错误发现率校正的正式交互检验评估年龄、性别、BMI、糖尿病和高血压的效应修饰作用。利用CKD、白蛋白尿及广泛肾损伤导向的疾病模块构建结局导向网络毒理学框架。使用HEK293T细胞进行靶向细胞评估，检测Pb、Cd或联合暴露后的细胞毒性、细胞内金属蓄积、氧化还原和炎症反应以及网络分析优先化基因的转录变化。进行探索性分子对接以检验潜在的金属–蛋白质相互作用位点。
结果：单一生物标志物和混合物分析显示，观察到的关联随生物标志物基质和肾脏结局而变化。尿Pb与eGFR呈正相关；尿Cd和血Pb与较高的log(UACR)相关；血Pb和血Cd与CKD相容表型的高几率相关。尿Pb–Cd混合物与eGFR和log(UACR)呈正相关，而血液混合物与较高的log(UACR)和CKD相容表型的高几率相关。正式交互分析识别了所选血液关联中的年龄相关异质性，而血Pb、血Cd和尿Cd与eGFR的负相关在糖尿病患者中更强。结局导向网络分析一致地将IL1B和IL6优先化为共享炎症枢纽，而外周网络架构在不同肾脏模块间存在差异。在HEK293T细胞中，Pb–Cd联合暴露增加了细胞内金属负荷和细胞毒性，降低了抗氧化能力，并改变了IL1B、IL6及选定应激反应基因的表达。
结论：基于血液和尿液的Pb和Cd生物标志物在不同肾脏结局中表现出不同的关联谱，表明单一生物标志物基质或终点可能无法全面表征Pb–Cd相关的肾脏异常。结局导向网络在独特的外周架构内汇聚于IL1B和IL6作为共享炎症枢纽，靶向细胞证据支持优先化靶标的响应性。这些发现为Pb–Cd联合暴露的机制解释和风险评估建立了一个整合的多基质、多结局框架。
铅（Pb）和镉（Cd）联合暴露肾毒性的多水平证据解析：基于NHANES、结局导向网络毒理学及细胞验证的综合研究
铅（Pb）和镉（Cd）是持续存在的环境毒物，人类暴露仍然广泛，其健康负担巨大。世界卫生组织数据显示，2021年全球范围内Pb暴露导致超过150万例死亡和超过3300万残疾调整生命年，表明有毒金属暴露仍是当代公共卫生问题。Cd暴露则通过受污染食物、烟草烟雾和职业来源普遍发生，是主要影响肾脏和骨骼系统的持久性毒物。肾脏作为Pb和Cd的主要靶器官之一，其损伤既对金属暴露具有生物学敏感性，又在人群层面具有高度后果性。慢性肾脏病（CKD）本身已影响全球数亿人，即使毒物相关的肾功能轻微改变也可能产生重要的公共卫生影响。既往研究已将Pb和Cd与肾小球滤过降低、肾小管功能障碍和白蛋白尿相关异常联系起来，提示低至中等水平的环境暴露可能造成有意义的肾损伤负担。
然而，单一暴露基质或单一肾脏终点难以充分捕捉Pb–Cd肾毒性。血液和尿液金属生物标志物反映内部暴露和毒代动力学的互补但不可互换的方面。血液浓度主要指示循环负荷和相对近期或持续的暴露，而尿液浓度反映肾脏排泄并受尿液稀释、肾小球滤过和肾小管处理的影响。同样，估算肾小球滤过率（eGFR）和尿白蛋白肌酐比（UACR）代表肾脏健康相关但不等同的维度，而CKD相容表型是由这些指标衍生的复合分类。尽管存在这种复杂性，既往多数研究单独检验Pb或Cd、依赖单一暴露基质或聚焦于单一肾脏结局，可能掩盖了混合金属肾毒性中具有生物学意义的异质性，也有助于解释流行病学研究间经常观察到的不一致性。
因此，本研究预设Pb–Cd为生物学上连贯的二元混合物。两者均为公认的肾毒物，在环境和职业环境中常共存，且在本研究所含NHANES周期中均在血液和尿液中得到一致测量。机制解释还受到网络毒理学常用应用方式的限制。多数研究依赖单一的宽泛疾病术语，可能掩盖与相关肾脏结局相关网络的组成和组织差异。在细胞水平上，氧化应激、炎症激活和应激反应信号已被牵涉于金属诱导的肾损伤。本研究使用HEK293T细胞作为标准化人细胞平台，确定网络优先化基因及相关细胞读数在相同且受控的Pb、Cd和联合暴露条件下是否响应。该靶向细胞评估并非旨在重建近端小管金属毒代动力学或慢性环境暴露，而是为评估靶标响应性提供实验层面。
本研究整合了基于NHANES的流行病学分析、结局导向网络毒理学、探索性分子对接和靶向细胞评估，以研究Pb–Cd联合暴露相关的肾脏异常。具体而言，研究人员检验了血液和尿液Pb/Cd生物标志物及混合物是否与eGFR、log(UACR)和CKD相容表型表现出差异关联，包括关键人口学和临床特征的潜在效应修饰；肾脏结局导向网络是否在保留外周组织差异的同时汇聚于共享炎症枢纽；以及Pb、Cd和联合暴露是否在HEK293T细胞中引发与网络优先化靶标一致的细胞毒性、氧化还原、炎症和转录反应。该整合设计超越了单一基质、单一终点分析，为Pb–Cd联合暴露的机制解释和肾脏风险表征提供了多基质、多结局框架。
在流行病学层面，研究人员使用NHANES 2011–2018年四个周期公开数据，纳入5049名成人的共同完整病例样本。血液和尿液Pb/Cd生物标志物经自然对数转换后建模。肾脏结局包括使用2021年CKD-EPI无种族肌酐方程计算的eGFR、自然对数转换的UACR以及定义为eGFR < 60 mL/min/1.73 m2或UACR ≥ 30 mg/g的CKD相容表型。协变量包括年龄、性别、种族/民族、贫困收入比、体质指数（BMI）、吸烟状况、饮酒、糖尿病和高血压。采用设计为基础的调查加权回归评估单一生物标志物关联，使用分位数g计算（qgcomp）和广义加权分位数和回归（gWQS）检验混合物效应，并通过正式交互检验评估效应修饰。
网络毒理学方面，研究人员从比较毒物基因组学数据库（CTD）分别检索Pb和Cd相关靶标，从GeneCards构建CKD导向、白蛋白尿导向和广泛肾损伤导向三个疾病模块，将共享Pb–Cd靶标集与三个疾病模块相交产生Shared_CKD（138个基因）、Shared_ALB（186个基因）和Shared_RENAL（217个基因）共享靶标集。通过STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并在Cytoscape中可视化，使用cytoHubba的Degree和MCC算法优先化枢纽基因，使用MCODE识别核心子网络。
细胞验证方面，HEK293T人胚胎肾细胞在高糖DMEM培养基中维持，使用醋酸铅三水合物和氯化镉进行Pb、Cd及联合暴露。主要技术方法包括：CCK-8法检测细胞活力；电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量细胞内金属蓄积；ABTS法测定总抗氧化能力（T-AOC）；ELISA检测培养上清中IL-1β和IL-6水平；逆转录实时定量PCR（RT-qPCR）检测MAPK1、MAPK9、MAPK14、DUSP1、IL1B和IL6基因表达；分子对接使用AutoDockTools v1.5.7探索Cd2?/Pb2?与优先化靶标的潜在相互作用位点。
研究结果部分呈现以下主要发现：
3.1 NHANES流行病学发现
3.1.1 研究人群特征：共同完整病例分析样本包含5049名成人，其中792人符合CKD相容表型定义，4257人不符合。符合定义的参与者年龄更大。
3.1.2 单一Pb/Cd生物标志物与肾脏结局的关联：在完全调整的Model 3中，尿Pb与eGFR正相关（β = 0.683 mL/min/1.73 m2；95% CI: 0.106, 1.260；P = 0.021），由于尿液生物标志物浓度可能受肾滤过和排泄影响，该横断面关联未被解释为肾脏保护作用的证据。血Pb（β = 0.069；95% CI: 0.008, 0.131；P = 0.028）和尿Cd（β = 0.063；95% CI: 0.026, 0.099；P = 0.001）与较高的log(UACR)相关。血Pb（OR = 1.430；95% CI: 1.146, 1.786；P = 0.002）和血Cd（OR = 1.352；95% CI: 1.125, 1.626；P = 0.002）与CKD相容表型高几率相关。
3.1.3 血液和尿液Pb-Cd混合物与肾脏结局的关联：qgcomp分析显示，血液生物标志物同时增加一个四分位数与较高的log(UACR)（β = 0.060；95% CI: 0.023, 0.098；P = 0.002）和较高的CKD相容表型几率（OR = 1.474；95% CI: 1.285, 1.691；P < 0.001）相关，但与eGFR无关。尿液生物标志物同时增加一个四分位数与较高的eGFR（β = 0.560；95% CI: 0.115, 1.006；P = 0.014）和较高的log(UACR)（β = 0.062；95% CI: 0.034, 0.090；P < 0.001）相关，但与CKD相容表型的关联未达到统计学支持。gWQS探索性分析中，血液混合物与CKD相容表型的正相关在两种方向规格中均经Holm校正后保持显著。
3.1.4 敏感性和次要分析：使用2009年CKD-EPI方程、额外调整尿肌酐及肌酐标准化尿金属浓度后，尿Pb–eGFR和尿Cd–log(UACR)关联仍被观察到。排除97名eGFR < 30 mL/min/1.73 m2或UACR ≥ 300 mg/g的参与者后主要关联谱未发生实质性改变。
3.1.5 人口学和临床特征效应修饰：糖尿病状态修饰了血Pb、血Cd和尿Cd与eGFR的关联（FDR校正P = 0.009、0.009和0.003）。在糖尿病患者中，较高的血Pb、血Cd和尿Cd与较低的eGFR相关，而相应关联在非糖尿病患者中未达到统计学支持。
3.2 结局导向网络毒理学的机制发现
3.2.1 结局导向疾病模块定义不同大小的共享网络：CKD导向疾病集包含494个基因，ALB导向包含582个基因，RENAL导向包含698个基因。白蛋白尿导向和广泛肾损伤导向模块保留了更多Pb–Cd相关共享靶标，提示不同肾脏结局可能反映Pb–Cd肾毒性的不同结构维度。
3.2.2 分层分析反复优先化IL1B和IL6作为共享炎症枢纽：IL1B和IL6在Shared_CKD、Shared_ALB和Shared_RENAL网络中均被保留并高度优先化，而其余节点的模块支持存在显著差异。这表明Pb–Cd相关肾损伤并非由每种结局完全独立的机制驱动，而是围绕共享炎症核心组织，在不同结局间具有独特的外周架构。
3.2.3 枢纽和模块分析显示外周网络组织差异：Shared_CKD网络以IL1B和IL6为中心的紧凑炎症核心为特征，伴有TNF、IL10、IFNG、CCL2、CXCL8和TLR4等免疫炎症节点。Shared_ALB网络保留炎症核心但显示更显著的趋化因子丰富和转录调控扩展，包括TNF、CCL2、CCL5、CXCL8、CXCL10、NFKB1、RELA、STAT3、TP53、AKT1和JUN。Shared_RENAL网络保留IL1B/IL6炎症核心，同时展示涉及STAT3、AKT1、TP53、NFKB1、EGFR、CASP3和CTNNB1的应激/损伤调控层以及包含TNF、CCL2、CXCL8、IFNG、IL10、IL1A、IL4和CSF2的细胞因子/趋化因子扩增层。
3.2.4 整合网络优先化识别共享枢纽和模块相关外周差异：三个独立构建的肾脏结局导向网络一致优先化IL1B和IL6作为共享炎症枢纽，而周围调控节点的组成在CKD、白蛋白尿和广泛肾损伤导向模块间不同。IL1B、IL6及选定应激反应靶标随后在受控Pb、Cd和联合暴露条件下于HEK293T细胞中评估。
3.3 网络优先化靶标的靶向细胞评估
3.3.1 Pb-Cd联合暴露增加细胞毒性和细胞内金属负荷：CCK-8检测显示Cd或Pb单独暴露以剂量依赖方式降低细胞活力，Cd的细胞毒性效力高于Pb。Pb–Cd联合暴露在相应剂量因子下产生比任一单一金属暴露更大的活力丧失。ICP-MS证实联合暴露下Cd和Pb的细胞内同时蓄积。
3.3.2 Pb-Cd联合暴露改变氧化还原稳态和IL-1β/IL-6反应：Pb–Cd联合暴露在多个剂量水平上比Pb或Cd单独暴露更大程度地降低总抗氧化能力。培养上清中IL-1β和IL-6浓度呈剂量相关变化，联合暴露在选定剂量水平产生进一步增加。
3.3.3 Pb-Cd联合暴露改变应激反应基因表达：RT-qPCR显示Pb、Cd和联合暴露后MAPK1、MAPK9、MAPK14和DUSP1表达发生暴露相关变化，IL1B和IL6表达也增加。在相同计算设置下，Cd2?在检测蛋白质中比Pb2?产生更负的预测对接分数，但这些分数仅代表方案内探索性比较。
讨论部分指出，本研究的主要贡献在于：第一，在同一NHANES人群和协变量框架内，血液和尿液Pb/Cd生物标志物及混合物在eGFR、log(UACR)和CKD相容表型上捕捉到不同但互补的关联模式。第二，三个独立构建的肾脏结局导向网络反复优先化IL1B和IL6作为共享炎症枢纽，同时保留结局相关的外周网络组织差异。第三，在受控细胞条件下，Pb–Cd联合暴露增加细胞内金属负荷和细胞毒性，并改变氧化还原、炎症和应激反应读数。尿Pb与eGFR的正相关不应被视为Pb肾脏保护作用的证据，因为尿Pb是依赖排泄的指标，肾功能较好者可能排出更多Pb至尿液，从而同时表现出较高的尿Pb浓度和较高的eGFR。
研究结论为：基于血液和尿液的Pb和Cd生物标志物及混合物在不同肾脏结局中捕捉到互补的关联模式，证明了在同一人群中评估多种生物标志物基质和肾脏终点的附加价值。结局导向网络汇聚于IL1B和IL6作为共享炎症枢纽，同时保留外周组织差异，靶向细胞实验支持所选炎症和应激反应靶标的暴露响应性。通过连接基质解析的流行病学关联、跨结局网络架构和受控细胞反应，本研究为Pb–Cd联合暴露相关肾脏异常的更全面表征和机制解释提供了整合框架。这些发现也为未来纵向研究、生理相关肾脏模型中的验证以及易感人群和金属联合暴露风险的精细化评估奠定了基础。
