《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Chronic e-cigarette aerosol exposure alters NRF2 and TGF-β1 signaling and enhances stem-like features in human oral and lung epithelial cells
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电子烟气溶胶在体外、动物模型及使用者中均可引起氧化应激升高，该状态与包括癌症在内的疾病进展相关。本研究探讨长期暴露于电子烟气溶胶如何影响抗氧化防御与干性相关的关键细胞通路。研究人员将人口腔与肺上皮细胞暴露于递送30 ng/mL尼古丁的电子烟气溶胶提取物中两周，
电子烟气溶胶在体外、动物模型及使用者中均可引起氧化应激升高，该状态与包括癌症在内的疾病进展相关。本研究探讨长期暴露于电子烟气溶胶如何影响抗氧化防御与干性相关的关键细胞通路。研究人员将人口腔与肺上皮细胞暴露于递送30 ng/mL尼古丁的电子烟气溶胶提取物中两周，该浓度可模拟使用者血浆水平。基因与蛋白表达分别通过实时逆转录PCR（real-time RT-PCR）与蛋白质印迹（western blotting）评估，并采用球体形成实验评价干性。电子烟暴露显著上调抗氧化调节因子NRF2及其下游靶标（如SOD2、CAT与HMOX1），同时降低其负调控因子KEAP1。出乎意料的是，TGF-β1蛋白及其下游信号ERK1/2蛋白亦升高。细胞系慢性暴露于电子烟气溶胶导致球体形成增加，并上调干细胞标志物（BMI1、OCT4、SNAIL与SLUG）表达，表明干性特征增强。综上，这些发现表明慢性电子烟气溶胶暴露可同时激活NRF2与TGF-β信号，并增强人口腔与肺上皮细胞的干性特征。这些分子与表型改变可能参与口腔与肺致癌相关的早期细胞事件，提示需进一步研究持续使用电子烟的长期健康后果。
《Ecotoxicology and Environmental Safety》刊发的该项研究围绕电子烟气溶胶是否具有促癌变前细胞重编程效应展开。当前，尽管全球可燃烟草使用下降，但电子烟及其他替代性尼古丁递送系统在青少年与年轻成人中迅速流行。电子烟气溶胶虽比可燃烟草烟雾毒性物质少，但仍含丙二醇、植物甘油、尼古丁、醛类、重金属与调味剂等复杂混合物，可产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）并诱发氧化应激、炎症与DNA损伤。已有动物与临床证据提示慢性电子烟使用与系统性氧化应激、呼吸道症状、口腔疾病及少数口腔癌病例相关，但长期使用对人上皮细胞的分子机制仍不清楚。NRF2（nuclear factor erythroid 2–related factor 2，核因子红细胞2相关因子2）是抗氧化防御核心转录因子，TGF-β（transforming growth factor-beta，转化生长因子β）可调控上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）与干性。研究人员因此开展机制研究，检验慢性电子烟气溶胶暴露是否会同时改变NRF2与TGF-β1信号并增强口腔与肺上皮干性特征。研究结论显示，慢性暴露可诱导NRF2与TGF-β1信号共激活及干性表型，这些改变可能是口腔与肺致癌的早期细胞事件，对公共卫生与监管具有重要警示意义。
作者所用关键技术方法包括：使用商用电子烟系统NJoy（N18）与eGo-T（E18）按每分钟两次55 mL抽吸方案生成电子烟气溶胶提取物，并以传统卷烟主流烟雾（mainstream smoke，MS）提取物作阳性对照；细胞模型为人口腔上皮癌细胞UM-SCC-1、UPCI-SCC-90即UM-SCC-90、正常支气管上皮NuLi-1，每两天以递送30 ng/mL尼古丁的提取物处理两周；以实时RT-PCR检测NFE2L2、SOD2、CAT、HMOX1、BMI-1、OCT4等mRNA；以蛋白质印迹检测NRF2、KEAP1、SOD2、CAT、HO-1、TGF-β1、ERK1/2、SNAIL、SLUG等蛋白；以软琼脂球体形成实验评价自我更新与干性；统计采用单因素方差分析与t检验。
3.1. Activation of the NRF2 signaling pathway by chronic exposure to e-cigarette aerosols
研究人员在UM-SCC-1口腔上皮癌细胞中发现，N18与E18暴露后NRF2蛋白显著升高，KEAP1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Kelch样ECH关联蛋白1）降低，下游SOD2、CAT与HO-1即HMOX1编码蛋白升高，表明慢性电子烟暴露激活NRF2抗氧化轴。
3.2. Consistent activation of NRF2 pathway by e-cigarette exposure across distinct cell lines
在NuLi-1肺上皮细胞中重复实验，同样见NRF2、SOD2、CAT、HMOX1上调与KEAP1下调，说明NRF2激活跨细胞类型一致，并与既往该暴露范式下ROS升高和氧化DNA损伤相吻合，属适应性抗氧化反应。
3.3. E-cigarette exposure regulates NRF2 at the transcriptional and post-transcriptional levels
实时RT-PCR显示NFE2L2 mRNA升高，下游基因亦上调；蛋白质层面KEAP1下降，说明暴露通过转录水平上调NFE2L2及转录后水平抑制KEAP1共同增强NRF2信号。
3.4. E-cigarette aerosols induce upregulation of TGF-β and ERK1/2 pathways
蛋白质印迹显示TGF-β1与ERK1/2蛋白在口腔与肺细胞中均升高，提示持续氧化应激下NRF2与TGF-β1可协同活化，推动炎症、纤维化与肿瘤进展相关信号。
3.5. E-cigarette aerosols increase stem-like properties/features
球体形成实验在UM-SCC-1、NuLi-1与UPCI-SCC-90中均显示电子烟提取物增加球体数量，说明电子烟气溶胶与传统卷烟烟雾类似，可扩增癌症与非癌症上皮的干性细胞群。
3.6. SNAIL and SLUG are upregulated by chronic exposure to e-cigarette aerosols
蛋白质印迹见SNAIL与SLUG升高，二者为TGF-β诱导EMT与维持干细胞生存、活性和分化的重要转录因子，与球体增加结果一致。
3.7. Chronic exposure to e-cigarette aerosols increases OCT4 and BMI-1
mRNA分析显示OCT4与BMI-1上调，OCT4为多能性主调控因子，BMI-1为自我更新相关多梳蛋白，证实电子烟气溶胶激活促进干性的关键多能性与自我更新基因。
讨论部分指出，该研究首次证明生理相关尼古丁剂量下慢性电子烟气溶胶可同时激活NRF2与TGF-β1信号，并通过SNAIL、SLUG、OCT4、BMI-1及球体形成增强上皮可塑性与干性。NRF2短期具保护力，但持续激活与肿瘤进展、治疗抵抗相关；TGF-β1与ERK1/2活化可驱动EMT、侵袭与转移；二者形成ROS介导的双向调控环。研究也承认局限：两周提取物体外模型不能代表多年使用、缺尼古丁单独对照与空气对照、未做通路阻断 rescue、癌细胞系已有致癌背景、未评估SMAD2/3直接活化等。
结论部分译为：慢性电子烟气溶胶暴露与持续性NRF2激活、TGF-β1表达增加、ERK1/2蛋白水平升高，以及增强的EMT／干性相关表型相关，包括球体形成增加和干性／EMT相关标志物上调。该激活得到SOD2、过氧化氢酶（catalase）与HO-1等抗氧化酶表达增加的支撑，提示适应性强防御机制被启动，与既往电子烟气溶胶氧化应激反应一致。同时，TGF-β与ERK1/2上调符合炎症、EMT与肿瘤进展信号网络被调动。SLUG、SNAIL、BMI-1与OCT4等EMT和干性标志物表达增加，加之球体形成增强，提示细胞获得了上皮可塑性与干性特征相关的细胞状态。总之，长期电子烟气溶胶暴露促进可能与肿瘤起始和进展相关的分子与表型改变，强调需开展长期机制研究以明确电子烟使用健康风险并服务公共卫生政策与监管。
