《Food Control》：Development of an indirect competitive ELISA combining optimized extraction and heat-stable epitope targeting for crustacean allergen detection
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摘要肌浆钙结合蛋白（Sarcoplasmic calcium-binding protein, SCP）已被提出作为解决甲壳类过敏原免疫检测中因交叉反应导致的假阳性问题的靶标。然而，食品加工热处理导致的检测信号下降仍是一个挑战。为克服这一问题，本研究优化了过敏原提取缓冲液，并
摘要
肌浆钙结合蛋白（Sarcoplasmic calcium-binding protein, SCP）已被提出作为解决甲壳类过敏原免疫检测中因交叉反应导致的假阳性问题的靶标。然而，食品加工热处理导致的检测信号下降仍是一个挑战。为克服这一问题，本研究优化了过敏原提取缓冲液，并选择SCP的稳定表位（P7，AQFISNPDEKCNAVYL）作为检测靶标，建立了间接竞争酶联免疫吸附测定（icELISA）。50 mM碳酸缓冲生理盐水添加1%吐温20被确定为最佳溶液，因为SCP提取效率提高了35%–122%，且对SCP icELISA没有明显的干扰。P7-KLH抗血清在高压灭菌处理前后对SCP均表现出稳定的识别能力，且通过SCP亲和纯化消除了其与KLH及软体动物的交叉反应。基于P7特异性抗体，本研究开发并评估了P7 icELISA。尽管灵敏度有限（分析定量限为1.06 μg/mL SCP），该方法的线性范围为0.1–100 μg/mL，SCP加标回收率为84.6%–109.5%，精密度CV为3.7%–12.1%。在所测试的非甲壳类物种之间未观察到交叉反应，且在所选加工食品中的检测值比SCP icELISA获得的值高11.5–50.0倍。这些结果表明，靶向热稳定表位对于减少SCP免疫检测中由加工引起的信号损失具有潜力。
引言
甲壳类食物过敏是一个严重的公共卫生问题，全球患病率介于0至10.3%之间（Moonesinghe等，2016）。对甲壳类过敏原的专一、准确检测有助于实现恰当的过敏原标注。这既能保护过敏消费者，也能支持食品企业，并改善食物过敏管理（Yue等，2023）。由于甲壳类过敏的患病率较高，大多数地区的过敏原标注法规要求明确区分甲壳类、软体动物和昆虫过敏原（Chang等，2023）。肌浆钙结合蛋白（SCP）已被确认为甲壳类中的重要过敏原（Ayuso等，2010），具有高稳定性和种特异性（Zhu等，2023）。基于SCP的胶体金免疫层析试纸条（LFIA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）已被建立。LFIA可实现快速检测，而ELISA支持定量分析。然而，两种检测方法均存在因食品加工导致的检测信号降低问题（Huang等，2024a；Zhu等，2024）。
信号抑制主要由两个因素引起（Zhao等，2022b）。一方面，加工后过敏原的溶解度下降。例如，在鱼丸制备过程中，肌原纤维蛋白形成凝胶网络，其中肌浆蛋白被包埋或参与凝胶化，从而降低过敏原溶解度（Song等，2025）。类似地，在饼干烘焙过程中，蛋白质与碳水化合物之间发生的糖基化诱导共价交联可能导致过敏原不溶（Yu等，2025）。加工还可能改变过敏原结构并与食品基质相互作用。这两种变化均会遮蔽表位并降低抗体结合亲和力（Liu等，2026b）。
为提高蛋白质提取效率，Zhao等人比较了六种从加工虾中提取蛋白质的溶液，并评估了原肌球蛋白（TM）夹心ELISA（sELISA）的结果。Coca's溶液被确定为最佳，并观察到二硫苏糖醇（DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）和吐温20在提取和检测方面具有协同作用（Zhao等，2022b）。然而，由于TM和SCP的二级结构存在显著差异（Zhao等，2023；Zhao等，2022c），提取溶液的效果可能不同。Huang等人（Huang等，2024a）评估了三种常见缓冲体系（PBS、Tris-HCl、CBS），但其分析仅限于对总蛋白质提取效率和LFIA背景干扰的影响。目前，提取缓冲液对SCP提取效率和可检测性的影响尚未得到表征。
关于抗体结合能力的变化，我们此前阐明了中国东方三刺蟹（Portunus trituberculatus）SCP（Por t 4）表位加工诱导的结构变化，并确定了P7（AA170-AA185，AQFISNPDEKCNAVYL）为稳定表位（Zhu等，2025a）。Huang等人利用白蛋白表位抗体开发了间接竞争ELISA（icELISA）以实现多物种鱼类识别（Huang等，2024b），支持了基于表位靶向的ELISA的可行性。因此，靶向P7可能有助于减少SCP免疫检测中因加工引起的变异（图S1）。
本研究旨在通过两种策略提高食品加工后SCP的可检测性：优化过敏原提取方案以及靶向检测热稳定P7表位。比较了不同提取溶液体系对SCP提取率和检测效果的影响，为后续检测方法的改进提供指导。核心创新在于将热稳定表位作为靶标，以提高热处理前后抗体-抗原识别的稳定性。另一个亮点是制备P7特异性抗体，并将其用于建立icELISA检测方法。
章节摘要
材料
P. trituberculatus购自团岛市场（中国青岛），肌肉组织在液氮速冻后采集。重组Por t 4通过大肠杆菌表达，并按照已建立的方法使用Ni NTA进行纯化（Zhu等，2023）。P7肽通过Fmoc固相合成法制备（纯度≥90%），其通过与3-马来酰亚胺苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）共价偶联至钥孔紫海胆血红蛋白（KLH），并制备了兔抗P7-KLH
提取体系对SCP含量的影响
如图1A所示，生蟹肉提取物的蛋白质浓度受提取体系影响显著（0.95–3.27 mg/mL）。加工蟹提取物获得相似的蛋白质浓度，且所有样品中均观察到一致的趋势。蛋白质提取率按降序排列为：Coca's溶液、CBS、TBS和PBS。这可能与盐浓度和pH值增加有关，可增强蛋白质表面电荷和亲水性，
结论
本研究解决了加工食品中甲壳类过敏原检测面临的挑战，包括提取效率不足、检测信号降低以及与软体动物和昆虫的交叉反应。确定含吐温20的CBS缓冲液为最佳体系，且不干扰SCP icELISA。建立了靶向SCP热稳定P7表位的特异性icELISA。创新性地，使用SCP亲和纯化的P7特异性抗体消除了交叉反应
CRediT作者贡献声明
谭培平：资源提供。李震星：写作–审校与编辑、监督、资金获取、概念构思。邓军明：资源提供。许敏：概念构思。林红：监督。张紫叶：资源提供。刘志宇：概念构思。付琪：验证、资源提供。王浩：资源提供。朱文叶：写作–初稿撰写、可视化、方法学、调查研究、形式分析
未引用参考文献
Lasekan和Nayak，2016；Liu和Sathe，2018；Thekke Veettil和Jayaraman，2026；Trier和Houen，2023；Venien和Levieux，2005。
伦理声明
本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：动物实验伦理审查指南（GB/T 35892-2018）。本研究经中国海洋大学伦理委员会批准。（批准号：SPXY2024052901）
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32372439）、国家重点研发计划（2023YFD2401504）和中国博士后科学基金（2026M793263）的资助。
朱文叶|付琪|王浩|张紫叶|刘志宇|许敏|林红|邓军明|谭培平|李震星
中国海洋大学食品科学与工程学院，海洋食品加工与安全控制国家重点实验室，中国山东省青岛市三沙路1299号，黄岛校区，266000，中华人民共和国
