引言
食品在储存、运输和销售过程中的品质劣化通常与微生物增殖、酶促和化学降解、pH波动、蛋白质和脂质分解以及挥发性代谢物积累相关，这些因素共同缩短了保质期并可能增加安全风险（Huis in't Veld, 1996；Snyder et al., 2024）。传统方法，包括微生物计数、理化分析、挥发性化合物分析和感官评价，仍然是新鲜度评估的重要手段；然而，这些方法通常耗时较长、依赖仪器，不适合在整个食品供应链中进行持续、低成本和现场监测（Cheng et al., 2015；Hassoun & Karoui, 2017）。因此，能够将品质劣化转化为可见颜色变化的新鲜度指示剂引起了越来越多的关注。与实验室检测相比，视觉比色指示剂可以持续响应包装或食品微环境的变化，为生产者、零售商和消费者提供直观的新鲜度信息（Dodero et al., 2021；Luo et al., 2022；Shao et al., 2021）。
基于天然色素的指示剂因其安全性、可生物降解性和易于识别的颜色转变而尤为吸引人（Becerril et al., 2021；Liu et al., 2022；Luo et al., 2022）。花青素、姜黄素、茜素、甜菜碱等天然色素已被广泛应用于薄膜、水凝胶和标签中以进行新鲜度监测，其颜色变化主要受pH依赖性结构转变控制（Chen et al., 2020；Ezati et al., 2019；Kan et al., 2022；Roy et al., 2022）。例如，鱼、肉和虾在腐败过程中产生的挥发性胺可改变指示基质周围的局部pH值，从而诱导可检测的颜色响应。然而，食品腐败并非单一的pH变化事件，而是一个涉及微生物生长、胞外酶分泌、蛋白质降解、有机酸或挥发性碱积累以及局部微环境变化的复杂过程（Bekhit et al., 2021；Huis in't Veld, 1996；Snyder et al., 2024）。在高蛋白或具有缓冲能力的食品中，pH值可能变化缓慢、遵循非线性轨迹或与微生物和感官劣化不匹配；因此，仅基于pH的指示剂可能给出延迟或偏差判断。此外，天然pH指示剂通常存在光热稳定性有限、水溶性强、其响应范围与实际腐败阈值不完全匹配等问题（Balbinot-Alfaro et al., 2019；Huang et al., 2022；Liu et al., 2022）。因此，需要能够响应多种腐败相关因子的天然比色材料，以提高新鲜度指示的可靠性。
甲壳蓝蛋白提供了一种不同于传统天然pH染料的思路。它是一种天然存在的类胡萝卜素-蛋白质复合物，由虾青素和脱辅基蛋白形成，广泛存在于甲壳类动物的外壳中（Cianci et al., 2002；Helliwell, 2010；Higuera-Ciapara et al., 2006）。虾青素本身呈红橙色，采用低能几何构型，主吸收带约在470–480 nm处。在甲壳蓝蛋白中，脱辅基蛋白亚基迫使虾青素采用不同的结合几何构型，并可显著红移其吸收，从而产生甲壳类动物外壳的蓝色、紫色或深色（Cianci et al., 2002；Gamiz-Hernandez et al., 2015；van Wijk et al., 2005）。结构和光谱研究表明，这种颜色并非简单地由色素的酸碱平衡决定。相反，脱辅基蛋白亚基通过限制端环和多烯链，改变氢键和疏水接触，并在结合口袋中产生静电和激子效应来重塑虾青素发色团（Cianci et al., 2002；Gamiz-Hernandez et al., 2015；Helliwell, 2010；van Wijk et al., 2005）。当热、pH、蛋白酶作用或微生物活动扰乱蛋白质-虾青素结合状态时，蛋白质施加的约束减弱，吸收最大值移回虾青素固有区域附近约480 nm处，伴随宏观的由蓝到红或由蓝到橙的颜色转变（Guan et al., 2024；Pan et al., 2018；Pan et al., 2020；Timme et al., 2009）。因此，甲壳蓝蛋白不仅仅是一种pH敏感色素，而是一种构象敏感色蛋白，其颜色转变反映了与食品腐败相关的酸碱扰动、蛋白质去稳定化或蛋白酶解破坏所引起的虾青素结合环境的变化。
尽管甲壳蓝蛋白及相关外壳来源色素结合蛋白的结构基础、热致变红和部分纯化已被报道（Cianci et al., 2002；Guan et al., 2024；Helliwell, 2010；Pan et al., 2018；Pan et al., 2020），但作为腐败响应分子的潜力仍未得到充分理解。一方面，虾壳废弃物富含蛋白质、几丁质和类胡萝卜素，是回收天然色素结合蛋白的重要来源（Deng et al., 2020；Mao et al., 2017；Rossi et al., 2024）。虾壳的物种来源和提取方法会影响回收类胡萝卜素蛋白的组成、产率和功能特性（Pan et al., 2018；Pan et al., 2020；Pattanaik et al., 2020）。对于甲壳蓝蛋白这种构象依赖型色蛋白，提取不应仅以蛋白质产率来评价；还应保留蛋白质-虾青素结合状态及后续的颜色响应能力。这一考虑很重要，因为提取参数如pH、离子强度、温度和沉淀条件会改变蛋白质构象、溶解度和聚集行为（Tanger et al., 2020）。因此，提取优化应在蛋白质产率和色蛋白结合状态的最小损失之间取得平衡，以?E作为保留响应能力的实用约束条件。另一方面，典型的腐败相关因子，包括pH波动、微生物增殖和蛋白酶作用，是否能分别诱导甲壳蓝蛋白产生可识别的颜色、光谱和二级结构变化仍不清楚。豆腐作为高水分、高蛋白、近中性的食品，在储存过程中会发生微生物生长、有机酸形成和挥发性化合物变化（Her et al., 2017；Lee et al., 2014），使其成为检验腐败微环境是否能扰动甲壳蓝蛋白构象的有用模型。
基于上述考虑，本研究聚焦于两个相关问题：如何从虾壳中获得甲壳蓝蛋白而不致其虾青素-蛋白质结合状态过度损失，以及为何该色蛋白能响应腐败相关的扰动。首先，以蛋白质产率和颜色响应为评价指标，比较了盐析提取、等电点沉淀和酶解提取，并对虾壳来源进行了筛选。随后通过单因素实验和响应面法对选定的盐析提取工艺进行了优化，以在产率和保留颜色响应之间取得平衡。最后，结合颜色参数、紫外-可见光谱和圆二色光谱阐明了pH波动、微生物生长和蛋白酶作用对甲壳蓝蛋白颜色和构象响应的影响。旨在阐明甲壳蓝蛋白作为多触发、腐败响应型天然色蛋白的颜色形成基础，并为未来的新鲜度指示材料提供机理支持。
