肠膜明串珠菌肠膜亚种由肌红蛋白生成锌原卟啉 IX：模型体系中的多步机理阐明

《Food Research International》：Zinc protoporphyrin IX formation from myoglobin by Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides: Multi-step mechanism elucidation in a model system

　　

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  建立了卟啉IX（ZnPP）形成的模型体系。
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  该体系以胃蛋白酶水解的肌红蛋白作为唯一血红素底物。
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  酸化和蛋白水解协同促进血红素从肌红蛋白中释放。
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  胞内酶将释放的血红素转化为卟啉IX（ZnPP）和原卟啉IX（PPIX）。
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  还原性微环境保护卟啉并维持卟啉IX的持续生成。

引言

亚硝酸盐长期以来一直是肉类加工中不可或缺的添加剂，因其具有发色、防腐和抗氧化等多重功能（Chen, Gu, et al., 2025; Mwasomola et al., 2026; Zhang et al., 2023）。然而，在酸性条件下，亚硝酸盐可与肉中的胺类反应生成具有致癌潜力的N-亚硝胺，相关健康风险日益受到消费者和监管机构的关注（Casoni et al., 2019; Chen, Jambrak, et al., 2025; Sobhy et al., 2026）。根据中国国家标准GB 2760–2024，肉制品中亚硝酸盐的最大允许添加量为150 mg/kg（Huang et al., 2026），而欧盟在法规（EU）2023/2108下采用了更为严格的120 mg/kg限值（Melios et al., 2024）。两个限值均指加工过程中添加的亚硝酸盐最大量，而非最终产品中的亚硝酸盐残留水平。欧盟更严格的限值反映了其更为保守的风险评估框架，进一步凸显了减少亚硝酸盐使用的监管压力日益增大。因此，寻找天然安全的着色策略以替代亚硝酸盐已成为肉类科学领域的一个重要研究焦点。卟啉IX（ZnPP）是一种天然红色素，被发现可在不添加亚硝酸盐的情况下赋予发酵肉制品稳定的红色，因此被认为是潜在的亚硝酸盐替代品。与亚硝酸盐不同，卟啉IX的形成不涉及N-亚硝胺的生成，且卟啉IX本身是血红素代谢中的一种天然卟啉中间体，在清洁标签肉制品的背景下被认为具有更好的安全性。此外，卟啉IX在发酵和储存过程中稳定，且可通过微生物或非酶过程原位生成，这进一步支持了其作为清洁标签肉制品着色剂的实用性（Yoo et al., 2025）。卟啉IX的形成不仅满足了消费者对清洁标签产品的需求，还为发酵肉的色泽调控提供了新的技术手段。

目前关于卟啉IX生物合成机制的认识主要围绕血红素的代谢转化展开。卟啉IX的形成被认为通过两条可能的途径发生：一是血红素中脱铁生成原卟啉IX（PPIX），随后锌插入；二是Zn²⁺直接置换血红素中心的亚铁离子。这些步骤可能由血红素加氧酶或相关卟啉螯合酶催化，也可能通过自发的金属交换和Zn²⁺–卟啉自组装等非酶过程进行（Yoo et al., 2025）。对于具有完整血红素生物合成途径的细菌（如假单胞菌属），即使培养基中仅含微量锌离子，也足以利用内源性合成的血红素诱导卟啉IX的生成（Khozroughi et al., 2018）。相比之下，乳酸菌（LAB）通常缺乏完整的血红素生物合成途径，无法从头合成血红素（Gruss et al., 2012; Tian et al., 2024），因此必须从环境中获取外源血红素才能启动卟啉IX的生成。因此，现有关于乳酸菌产生卟啉IX的研究主要采用肉制品——本身富含血红素——作为发酵基质（Abrashev et al., 2026; Kauser-Ul-Alam et al., 2021; Yang et al., 2025）。虽然已有报道表明某些乳酸菌菌株（如Weissella viridescens JX11和Lactobacillus pentosus Q）可在发酵过程中产生卟啉IX，但关键酶、底物利用方式以及环境因子的调控作用仍基本未被阐明（Yang et al., 2024）。机制解析面临的主要障碍是肉类基质的固有复杂性：内源血红素的物理化学状态、金属离子的分布以及微生物群落内部的相互作用均可能严重干扰对各个反应步骤的阐明。如果不简化这种复杂性，将化学驱动力与底物结构效应区分开来是极其困难的。为克服这些挑战，本研究构建了一个简化的模型体系，以胃蛋白酶水解的肌红蛋白作为唯一的外源血红素蛋白底物。该体系模拟了肉类发酵过程中内源蛋白水解所导致的血红素–蛋白部分变性状态，同时消除了天然基质固有的干扰变量，从而为解析乳酸菌将外源血红素转化为卟啉IX的多步骤分子机制创建了一个可控平台。

在我们的前期工作中，从真空包装火腿中分离并鉴定出具有显著卟啉IX生成能力的Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides菌株，并研究了其在含高铁肌红蛋白的液体培养基和发酵香肠中对肉类色泽的改善作用（Kong et al., 2023; Wu et al., 2023）。这些研究主要从几种代表性酶样活性和色素形成角度探讨了可能的机制。然而，实验体系仍不够完善，部分条件难以精确控制。此外，非酶因素如酸化和蛋白水解未得到充分考虑。因此，卟啉IX形成的机制仍未完全阐明。为进一步探究本研究所用菌株的卟啉IX合成的分子基础，我们进行了初步基因组分析，发现存在血红素加氧酶编码基因（未发表数据）。这一发现表明该菌株具备将锌插入卟啉环的酶学机制。然而，鉴于血红素利用的复杂性，整体卟啉IX形成活性可能受多种因素而非仅血红素加氧酶的调控。综合这些发现，该菌株作为肉制品天然着色发酵剂的潜力值得肯定，但其卟啉IX合成机制仍有待全面阐明。

据此，在本研究中，以胃蛋白酶水解的肌红蛋白（Mb）为核心底物，构建了包含Luria-Bertani（LB）培养基、葡萄糖、2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液和锌离子的简化模型体系，旨在系统研究Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides在确定条件下产生卟啉IX的规律和机制。与以往依赖复杂肉基质的研究不同，该模型体系能够更清晰地解析关键因素的独立贡献。在优化酶解时间和Zn²⁺浓度后，从化学驱动力和底物结构变化两个维度，系统分析了pH值、金属离子、底物微结构和二级结构、肽的物理化学状态以及氧化还原微环境对卟啉IX形成的影响。通过这一系统研究，阐明了该菌株产生卟啉IX的多步骤机制。研究结果不仅为理解乳酸菌卟啉IX的形成提供了机制基础，还为未来在实际发酵肉体系中的验证奠定了基础，最终可能有助于优化无亚硝酸盐或低亚硝酸盐发酵肉制品中靶向卟啉IX生成的发酵工艺。

章节摘要

试剂与材料

肌红蛋白（来源于马骨骼肌）、卟啉IX标准品和原卟啉IX标准品购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。脱脂奶粉购自北京索莱宝科技有限公司（北京，中国）。de Man, Rogosa and Sharpe（MRS）培养基和LB培养基购自青岛海博生物科技股份有限公司（青岛，中国）。胃蛋白酶购自上海阿拉丁生化科技有限公司（上海，中国）。其他所有试剂均为分析纯。

模拟体系条件的优化

在模型体系中，肌红蛋白和锌离子是卟啉IX合成的直接底物；因此，肌红蛋白的酶解时间和添加的Zn²⁺量直接影响LM菌株的卟啉IX产量。如图1a所示，在未经过胃蛋白酶消化时，LM组的卟啉IX含量与未接种对照组基本一致，表明完整的肌红蛋白是较差的底物。这可能是由于紧密的球状蛋白结构所致，

结论

在本研究中，成功建立了一个由胃蛋白酶预处理的肌红蛋白、LB培养基、葡萄糖、MES缓冲液和锌离子组成的模型体系，用于研究LM菌株的卟啉IX形成。在该体系中，该菌株通过代谢活动酸化环境、分泌胞外蛋白酶并产生还原性微环境。这些活动共同破坏了底物蛋白聚集体并动员血红素，随后血红素被转化为卟啉IX。

CRediT作者贡献声明

楚继扬：论文撰写–初稿、方法学、调查研究、形式分析、概念设计。魏良民：论文撰写–审阅与编辑、验证、调查研究。褚贝贝：论文撰写–审阅与编辑、验证、调查研究。陈星光：方法学、资金获取、形式分析。徐飞然：方法学、资金获取、形式分析。徐宝才：监督指导、资源提供、项目管理、资金获取。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究受到中国博士后科学基金（2026T190793）、安徽省自然科学基金（2408085QC097）、国家自然科学基金委（U25A20737）、中央高校基本科研业务费专项资金（JZ2024YQTD0600）以及云南省重大科技专项（202502AE090041）的资助。

Jiyang Chu|Liangmin Wei|Beibei Chu|Xingguang Chen|Feiran Xu|Baocai Xu