动脉粥样硬化斑块成纤维细胞来源于外膜和中膜Pdgfra谱系阳性细胞并主要维持成纤维细胞身份

《Cardiovascular Research》：Atherosclerotic plaque fibroblasts derive from adventitial and medial Pdgfra-lineage-positive cells and predominantly maintain fibroblast identity

　　

目的：成纤维细胞是健康血管外膜中的间充质细胞。在动脉粥样硬化中，单细胞测序数据集提示成纤维细胞在斑块中丰富，但其身份、起源和斑块进展中的命运仍不清楚，本研究旨在阐明。方法与结果：为稳健定义成纤维细胞身份、起源和命运，研究人员采用54个单细胞RNA测序（scRNA-seq）文库的荟萃分析，包括小鼠平滑肌细胞（Myh11）和内皮细胞（EC；Cdh5）谱系报告小鼠合并或单独动脉粥样硬化模型、人对照与动脉粥样硬化动脉、以及低密度脂蛋白受体敲除（Ldlr?/?）小鼠外膜与斑块分别处理样本。荟萃分析显示，小鼠和人斑块成纤维细胞身份由Pdgfra、Pi16、Cygb和Serpinf1 mRNA稳健定义。95%斑块成纤维细胞不来源于Myh11谱系，成纤维细胞簇中无Cdh5谱系阳性细胞。研究人员在动脉粥样硬化小鼠主动脉鉴定出5个动脉成纤维细胞亚群：祖成纤维细胞、基质成纤维细胞、炎症成纤维细胞、在外膜和斑块均存在的EC样成纤维细胞，以及仅存于外膜的Col5a3+成纤维细胞。伪时间和Pdgfra-CreERT2/tdTomato谱系报告小鼠（Pdgfra Lin+）分析显示，健康小鼠Pdgfra Lin+主要表达于外膜；饮食时间延长，斑块Pdgfra Lin+面积增加；Pdgfra Lin+细胞在斑块中主要维持成纤维身份，少于10%共表达SMC标志物（MYH11、SM22α）或贡献于ACTA2+帽细胞。获得间充质标志物的EC与获得EC标志物的Cdh5谱系阴性成纤维细胞转录上不同；斑块EC样成纤维细胞呈间充质向内皮转化（Mesenchymal-to-Endothelial Transition）转录组，体外人原代成纤维细胞饥饿可诱导该状态，IL1B、TGFB1、TGFB3和氧化LDL可减弱或逆转。跨物种整合显示小鼠斑块成纤维细胞在人动脉粥样硬化中保守，并有人特异亚群；EC样成纤维细胞与人斑块不稳定性相关。结论：约95%斑块成纤维细胞为Myh11 Lin?，具双起源，主要来自外膜Pdgfra Lin+祖成纤维细胞，少量来自中膜Pdgfra Lin+ Myh11+ SMC。多数斑块成纤维细胞维持成纤维身份。小鼠亚群在人病变中保守。EC样成纤维细胞关联人斑块不稳定。干预祖细胞向特异成纤维细胞转化可为促进斑块稳定提供新思路。

《Cardiovascular Research》刊发的该研究围绕动脉粥样硬化斑块成纤维细胞的身份、起源与命运这一长期模糊的科学问题展开。健康动脉中成纤维细胞主要位于外膜；已有单细胞RNA测序（scRNA-seq；single-cell RNA sequencing）研究提示斑块内成纤维样细胞丰富，但传统标志物如αSMA（ACTA2）并不成纤维细胞特异，外膜常未分离，导致“成纤维样细胞”术语泛滥、跨研究不可比。平滑肌细胞（SMC；smooth muscle cell）谱系与内皮细胞（EC；endothelial cell）谱系是否真正贡献为斑块成纤维细胞、外膜Pdgfra阳性细胞如何参与、斑块成纤维细胞是否转分化为其他细胞，均缺乏谱系示踪证据。因此，研究人员开展多队列scRNA-seq荟萃分析与可诱导谱系示踪，以明确斑块成纤维细胞身份、来源和命运。

研究人员整合54个scRNA-seq文库，包括小鼠Myh11与Cdh5谱系报告鼠动脉粥样硬化模型、人对照与动脉粥样硬化冠状动脉、Ldlr^?/?小鼠外膜与斑块分选样本；使用Pdgfra-Cre^ERT2/tdTomato小鼠进行体内谱系示踪；进行小鼠外膜与斑块配对scRNA-seq；将人对照与病变动脉数据整合；用SATURN跨物种整合小鼠与人成纤维细胞；利用AtheroMaas颈动脉内膜剥脱队列的转录组与斑块表型做相关性分析；并以人主动脉外膜成纤维细胞体外刺激验证EC样状态的可塑性。

3.1 研究人员通过对Myh11谱系报告鼠70 590个细胞荟萃分析，以Pdgfra、Dpep1高表达且低表达SMC/EC/免疫标志物定义成纤维细胞，发现94.1%斑块成纤维细胞为Myh11 Lin^?，仅5.9%来自SMC谱系；Acta2在Myh11 Lin^?成纤维细胞中仅33%表达，而在Myh11 Lin⁺成纤维细胞为87%，说明Acta2不能单独区分肌成纤维细胞与SMC来源纤维肌细胞。Cdh5谱系数据中未见成纤维细胞簇，提示EC不是动脉斑块成纤维细胞主要来源。

3.2 对Myh11 Lin^?成纤维细胞亚聚类得到四个亚群：祖成纤维细胞高表达Ly6a与Cd34，类似健康小鼠跨器官Ly6c1⁺Pi16⁺外膜成纤维细胞；基质成纤维细胞富集基质与胶原代谢；炎症成纤维细胞参与炎症与白细胞分化；EC样成纤维细胞表达Pecam1并响应缺氧与血管生成。CytoTRACE 2显示祖成纤维细胞发育潜能最高，PHATE与RNA速率支持其向基质、炎症及EC样成纤维细胞分化。

后续外膜与斑块配对scRNA-seq中，研究人员在小鼠胸主动脉分离外膜、中膜和斑块，鉴定出第五个亚群Col5a3⁺成纤维细胞仅存于外膜；祖、基质、炎症、EC样亚群同时分布于外膜与斑块。Pdgfra Lin⁺示踪显示健康鼠tdTomato主要位于外膜，中膜/内膜少数细胞共表达MYH11或PECAM1；高脂/PCSK9诱导后，斑块Pdgfra Lin⁺面积随病程增加，绝大多数斑块内Pdgfra Lin⁺细胞仍表达Pdgfra、Pi16、Cygb、Serpinf1，少于10%获得SMC标志物或成为ACTA2⁺纤维帽细胞。

人动脉数据中，研究人员将冠状与颈动脉样本整合，定义人斑块成纤维细胞同样以PDGFRA、PI16、CYGB、SERPINF1为标识，并发现部分小鼠亚群在人中被保留，另有人特异亚群。跨物种SATURN整合确认小鼠斑块成纤维细胞在人动脉粥样硬化中总体保守。AtheroMaas队列中，EC样成纤维细胞差异基因与斑块内出血（IPH；intraplaque haemorrhage）、坏死、胶原、钙化及微血管密度等相关，EC样成纤维细胞亚群与人斑块不稳定性正相关。

体外实验中，人主动脉外膜成纤维细胞在0% FBS饥饿下上调EC样转录程序；IL1B、TGFB1、TGFB3与氧化LDL处理可减弱或逆转该间充质向内皮转化样状态，说明局部炎症与脂质环境可双向调节斑块成纤维细胞可塑性。

讨论部分指出，既往研究因外膜污染和标志物非特异，高估SMC/EC对成纤维细胞的贡献；本研究以Pdgfra谱系示踪和分层组织scRNA-seq证明斑块成纤维细胞主要源自外膜Pdgfra Lin⁺祖成纤维细胞，中膜Myh11⁺ SMC仅次要贡献。EC样成纤维细胞并非典型EndoMT产物，而是斑块驻留成纤维细胞获得内皮样转录特征，并与人斑块不稳定相关。干预祖成纤维细胞向基质、炎症或EC样亚群的分化，可能比笼统靶向“肌成纤维细胞”更利于斑块稳定。

结论翻译：结果表明，95%的斑块驻留成纤维细胞为Myh11 Lin^?。斑块成纤维细胞具有双起源，主要为外膜Pdgfra Lin⁺祖成纤维细胞，并有少量来自中膜Pdgfra Lin⁺ Myh11⁺ SMC。大多数斑块成纤维细胞维持成纤维细胞身份。小鼠斑块成纤维细胞亚群在人动脉粥样硬化中保守。EC样成纤维细胞与人斑块不稳定性相关。干预祖细胞向特异成纤维细胞亚群的转化，可作为促进动脉粥样硬化斑块稳定的新途径。