基于主动学习的UvsX活性与热稳定性的平衡调控

《International Journal of Biological Macromolecules》：Balanced regulation of UvsX activity and thermostability based on active learning

　　

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  结合 FoldX 和 EVOLVEpro 的混合工程优化了 UvsX 的功能。
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  三重突变体 TIG 表现出增强的 ATP 酶活性和催化效率。
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  动力学分析显示 Km 值降低且周转率增加。
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  分子动力学（MD）和主成分分析（PCA）表明灵活性增加且构象多样性提高。
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  PSN 分析显示 ATP–DNA 通讯通路的重塑。

引言

重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种等温核酸扩增方法 [1]。该技术具有反应温度低、扩增动力学快、设备要求少等特点，非常适合现场检测和快速诊断 [1]，[2]。典型的 RPA 系统包含三个关键组分：重组酶、单链 DNA 结合蛋白和置换链 DNA 聚合酶 [3]。重组酶与引物结合形成核蛋白复合物，该复合物搜索同源序列并促进链侵入双链 DNA 模板 [1]。因此，重组酶是扩增反应启动效率的关键决定因素 [4]，[5]。因此，重组酶的构象状态、核酸结合亲和力以及 ATP 酶动力学共同控制着 RPA 系统的扩增效率和热耐受范围 [6]，[7]。

UvsX 属于 RecA/Rad51 家族的重组酶，源自 T4 噬菌体 [5]。与辅助蛋白 UvsY 和单链 DNA (ssDNA) 一起，它介导核蛋白丝组装、同源配对和链交换 [8]。因此，UvsX 已被广泛应用于体外重组研究 [9]。然而，天然 UvsX 在体外扩增系统中的性能受到几个因素的限制，包括热稳定性有限、最佳温度范围窄、ATP 利用次优以及与辅助因子的协同作用效率低 [10]，[11]。总之，这些局限性损害了低温和低模板条件下的扩增效率，从而限制了其在实际诊断应用中的实用性。

为了克服这些局限性，最近的报告改善了 UvsX 的活性和稳定性，如在基于 RPA 的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）检测中所展示的那样 [6]。在另一项研究中，Tarrant 等人通过宏基因组分析在极端环境中发现了两个 UvsX 同源物，UvsXt 和 UvsXp，作为 Virus-X 项目的一部分 [11]。这些同源物表现出增强的热稳定性和在较高温度下的卓越性能，从而提高了环介导等温扩增（LAMP）反应中的效率。尽管取得了这些进展，但仍需进一步提高扩增性能，以充分实现工程化 UvsX 变体在实际应用中的潜力。

人工智能（AI）的最新进展可能通过定向进化方法为酶工程带来新的机遇 [12]，[13]。例如，蛋白质语言模型 EVOLVEpro [10] 利用大规模序列数据来预测特定突变的功能效应，并已被应用于酶工程 [14]，[15]。然而，单独优化活性往往会损害热稳定性，反映了酶活性和稳定性之间固有的权衡 [16]。因此，需要一种平衡的工程策略，在提高酶活性的同时，在可接受的温度范围内保持热稳定性。

在本研究中，我们采用了一种平衡热稳定性和活性的工程策略，通过将半理性设计与蛋白质语言模型（PLM）相结合，获得了一种高活性突变体 TIG（S233T/A311I/A341G）。然后，我们从 RPA 扩增性能、ATP 酶活性和分子动力学（MD）行为方面比较了突变体和野生型蛋白，随后优化了 TIG 生产的发酵条件。最后，通过结合实验和计算分析，我们阐明了工程化 UvsX 性能增强背后的机制，从而为其在 RPA 系统中的应用奠定了基础。

章节摘要

重组质粒的构建

大肠杆菌（E. coli）表达菌株 BL21(DE3) 购自北京全仕津生物科技有限公司。编码 T4 噬菌体来源的 UvsX、UvsY-FVS [17]（GenBank: KJ477686.1）、gp32-M1（GenBank:NP_049651.1）[18] 和 Bsu-A578G 聚合酶（GenBank: SPY14812.1，带有 G578 突变）由金唯智生物科技有限公司化学合成。随后利用 NdeI 和 XhoI 限制性位点将这些基因克隆到 pET-28a(+) 载体中。利用基于 PCR 的...生成了 UvsX 突变体

基于能量筛选和蛋白质语言模型的 UvsX 定向工程策略

T4 UvsX 重组酶使用两阶段优化策略进行了工程化改造（图 1）。为了为后续的活性增强建立稳健的框架，首先进行了基于能量的虚拟饱和诱变，产生了一个热稳定化变体文库。利用该稳定化文库，随后使用 EVOLVEpro 蛋白质语言模型进行了迭代的功能优化。

以 T4 UvsX 野生型（WT）结构为模板，我们进行了虚拟

结论

在本研究中，我们描述了一种使用结合基于能量的筛选和蛋白质语言模型的混合策略对 T4 UvsX 进行工程化改造的方法。这种方法协同结合了 FoldX 驱动的热稳定性优化和 EVOLVEpro 引导的定向进化，生成了卓越的三重突变体 TIG（S233T/A311I/A341G）。在低模板条件下，TIG 的相对 RPA 活性增加到 WT 的 1.89 倍。酶学表征显示 TIG 的 V_max 为

CRediT 作者贡献声明

李灵松：写作 – 初稿。张林：写作 – 初稿，软件，方法论，形式分析，数据整理，概念化。李东晓：验证，方法论，调查。张嘉兴：写作 – 审阅与编辑，软件，方法论，概念化。尤生平：项目管理，资金获取。苏荣新：资源。齐伟：监督。

登录号

本研究使用的 UvsX 结构的 PDB 登录号为 3IO5，对应于 UniProt 登录号 P04529。

利益冲突声明

作者声明他们在本工作中没有利益冲突。

我们声明我们没有任何商业或关联利益，这些利益与提交的工作相关的利益冲突有关。

致谢

本工作得到了 国家自然科学基金（编号：22278314）和企业横向委托 2023GKF-0146 的支持。

李灵松|张林|李东晓|张嘉兴|尤生平|苏荣新|齐伟