利用多样苹果属种质开发低覆盖度全基因组测序筛选无融合生殖的方法

《PLOS Genetics》：Development of a low-coverage whole genome sequencing screen for apomixis using a diverse set of Malus germplasm

　　

摘要

在过去十年中，植物生物学家在无融合生殖（通过种子进行克隆繁殖）的遗传基础方面取得了多项重大发现，这些发现显示出在保持高价值杂交水稻和高粱基因型方面的应用前景。这一进展得益于在模式物种和天然无融合生殖物种中的基础基因发现工作，但多效性障碍仍然限制其在农业上的广泛应用，尤其是在双子叶植物中。因此，对新型无融合生殖植物的研究理应推动植物育种新分子工具的开发。鉴定克隆种子生产的两种最常见方法是流式细胞术种子筛选和基因组测序（用于比较母本与后代的DNA序列），后者传统上使用低通量分子标记。虽然流式细胞术在二十多年来一直是最主要的方法，但它仅能提供关于所得胚胎遗传信息的间接数据，且在某些物种中可能无效。在本研究中，研究人员开发了一种使用中等低覆盖度（平均3X和6X）短读长全基因组测序的方法，用于筛选美国农业部（USDA）种质资源库中保存的多样苹果属（Malus）基因型的克隆种子生产情况。研究人员共对55个基因型及其1,216个胚胎进行了测序，并鉴定出17个此前未被描述的无融合生殖基因型。流式细胞术种子筛选还检测到另外若干基因型，这有助于解析低覆盖度数据集中的某些繁殖类型和噪声来源。这种低覆盖度测序筛选方法是一种相对低成本、快速检测不同植物种质中无融合生殖基因型的方法，在与流式细胞术合理结合使用时，为可视化植物有性生殖和无性生殖的遗传结果提供了一种新途径。

作者总结

确定植物是否产生克隆种子最成熟的方法是流式细胞术种子筛选。然而，该方法不适用于某些物种和特定情况，且不能直接检测克隆性。因此，研究人员探索了在不同覆盖度水平下利用高通量、低覆盖度全基因组测序筛选方法直接检测苹果属胚胎是否为母本基因型克隆的实用性。研究人员提出了一种利用低覆盖度测序数据可视化植物繁殖结果的简便方法，考虑了流式细胞术与测序相互补充的方式，并讨论了先进技术如何使测序成为研究植物生殖生物学的更常规方法。

利用多样苹果属种质资源开发低覆盖度全基因组测序筛选无融合生殖的方法

一、研究背景与科学问题

无融合生殖（apomixis）是指通过种子进行克隆繁殖的复杂生殖过程，在被子植物中已多次独立演化。在配子体无融合生殖（gametophytic apomixis）中，其典型特征包括缺乏配子减数分裂、重组和分离（无减数分裂受精生殖，apomeiosis），以及无需受精即自发发育胚胎（孤雌生殖，parthenogenesis）。无融合生殖已在数百个属中被记录，包括具有直接经济价值的属（如悬钩子属Rubus、苹果属Malus、黄瓜属Cucumis）和作物野生近缘种（如玉米的三角草属Tripsacum）。数十年来，鉴定控制无融合生殖的基因一直是植物生物学家的高度追求目标，因为这些基因有潜力彻底改变植物育种。过去十年中，该领域取得了若干重大突破，包括在疣粒黍（Cenchrus squamulatus，原为Pennisetum squamulatum）中鉴定了BABYBOOM（BBM）基因，以及在药用蒲公英（Taraxacum officinale）中鉴定了PARTHENOGENESIS（PAR）基因，两者均足以在配子体无融合生殖植物中诱导孤雌生殖。然而，迄今为止，尚未有来自天然无融合生殖植物的基因被正式鉴定为调控无融合生殖中的无减数分裂受精生殖（apomeiosis），尽管同时敲除多个减数分裂调控基因已被证明可以创建称为MiMe（Mitosis instead of Meiosis，有丝分裂替代减数分裂）的合成版本。利用先进CRISPR技术将天然无融合生殖植物中发现的孤雌生殖基因与MiMe系统相结合，合成无融合生殖已在水稻中实现高效应用，该作物的农业应用已近在眼前。更近期，研究人员还在两个高粱杂交种中成功构建了高外显率的合成无融合生殖系统。然而，MiMe在其他系统中的适用性仍不明确，尤其是在双子叶物种中。多项研究已证明，在其他植物中需要SPO11、REC8和OSD1的替代基因来废除减数分裂并最小化多效性效应，这可能是由于这些同源基因在进化过程中的基因扩增、收缩和功能分化所致。然而，无融合生殖在开花植物中的普遍存在意味着发现植物育种新工具的巨大机会仍然充足。

传统上，基因发现需要构建分离群体，而无融合生殖的部分定义恰恰是缺乏减数分裂和重组。虽然大多数天然无融合生殖植物是兼性的，并以取决于基因型和环境条件的比例进行有性生殖，但精细定位这些基因仍受到世代时间长、多倍体化、分离畸变以及大型半合子非重组区域的阻碍。幸运的是，不断进步的基因组技术开始提供补充传统方法的替代途径。Wang等人（2022）利用不同基因型的重测序数据在柑橘属（Citrus）和金柑属（Fortunella）中精细定位了RWP-RK基因，Yadav等人（2023）在芒果属（Mangifera）中鉴定了直系同源基因。值得注意的是，这两个例子都是在表现出孢子体无融合生殖（sporophytic apomixis）的二倍体中定位基因，这种生殖方式通常作为单一显性性状正常分离。基因组方法在多年生物种中将尤为 impactful，这些物种的基因座嵌入在更大的非重组基因组区域中（例如，无孢子生殖配子体无融合生殖植物），可利用祖先重组来缩小候选基因范围。

筛选无融合生殖的方法已有多种，包括观察大孢子发生和胚胎学的显微镜技术、用于自主无融合生殖的花粉排除和雌蕊去顶法、流式细胞术种子筛选（FCSS）以及多种遗传标记的比较。最流行的区分无融合生殖、有性生殖和中间类型生殖的方法是FCSS，因为它具有中等通量且不依赖倍性。该方法通过检查种子内胚胎和胚乳的倍性间接推断生殖信息，由于双受精过程，开花植物中这两种组织的倍性不同。有性生殖个体的这两个组织倍性比约为2:3，而具有无融合生殖能力的个体则显著偏离此比值。然而，FCSS并未直接确认胚胎是克隆的，这导致在解释结果时存在一定的不确定性（例如，如果发生重组则无法捕获）。某些植物可能通过减数分裂恢复过程产生并非真正克隆的未减数配子。此外，FCSS在特定物种中也可能无信息或技术上具有挑战性，例如具有单核母本胚乳贡献的假配合无融合生殖植物或胚乳发育不良的物种。因此，开发补充现有方法的高通量、低成本无融合生殖筛选方法十分必要。

基于测序的传统后代筛选或群体无融合生殖推断方法通常利用少量多态性标记。但使用极少量标记可能因群体结构而导致错误结论，因此可能需要额外的非连锁遗传标记或其他补充数据（如FCSS）来解析生殖类型。虽然通过测序筛选无融合生殖是最直接的方法，但由于这些方法相关的成本和劳动（包括种子播种、DNA提取、文库制备和测序本身），尚未成为常规手段。低覆盖度全基因组测序（low-pass whole-genome sequencing, WGS）可能是检测克隆性的有前景的方法，尤其是在FCSS无法区分生殖类型或需要更直接的克隆性检测手段时。

研究人员选择苹果属（Malus，蔷薇科Rosaceae）作为测试低覆盖度WGS筛选的系统，原因包括：USDA保存的成年种质资源的可用性、其适合作为FCSS补充方法，以及有关多种生殖类型的充分记录。野生苹果属物种，尤其是原产于东亚和北美的物种，此前已通过细胞学和流式细胞术分析被记录表现出无孢子生殖无融合生殖（aposporic apomixis）。蔷薇科无融合生殖植物被认为是假配合无融合生殖（pseudogamous apomixis），需要授粉来受精中央核以形成胚乳。

二、研究内容与主要结论

研究人员对55个苹果属基因型（以下称为"母本基因型"）进行了至少15X的全基因组测序，并对其1,216个胚胎进行了3X或6X的全基因组靶向覆盖度测序。这些基因型代表了Phipps等人（1990）承认的55个物种中的22个物种的个体以及若干栽培杂交种，倍性从二倍体到四倍体不等。研究人员开发了一个简单的分析流程，用于比较信息性双等位基因SNP并检测克隆产生的胚胎。对部分测序基因型（n=26）进行了FCSS分析，以交叉验证这些数据类型并理解它们如何相互补充。

研究首先对来自16个母本基因型（n=355）的苹果属胚胎DNA以平均6X的覆盖度进行测序。研究人员考察了6X胚胎测序数据中的覆盖度变异，以确定胚胎测序覆盖度与可用于与母本比较的高质量双等位基因位点数量之间的关系。鉴于捕获位点与测序覆盖度之间的关联，研究人员推断平均3X覆盖度测序的胚胎仍能提供数百到数千个信息位点来区分克隆性与其他生殖模式。值得注意的是，即使更低的覆盖度（如1.5X）也被估计能提供超过1000个位点用于母本基因型与胚胎之间的比较。然而，研究人员最终采用每胚胎3X WGS覆盖度，以最小化样本丢失（定义为样本测序深度不足以提供至少50个杂合等位和50个纯合等位位点进行比较）。

在建立的克隆阈值方面，研究人员使用分位数回归（quantile regression）估计杂合等位和纯合等位百分比截断值的第5百分位数（tau=0.05）。四倍体M. platycarpa胚胎的边界与其他所有基因型分开建模。生物对照（来自M. hupehensis 633818和M. sargentii 589400的真实无融合生殖胚胎；n=33）和技术对照（母本掺入样本；n=77）在验证两组错误率对覆盖度变化响应相似后才合并。覆盖度和实验类型（生物或掺入）显著影响杂合等位位点第5百分位数阈值（p<0.05）。原始测序覆盖度每增加约1X，第5百分位数阈值增加0.26%。掺入样本的表现比生物对照好1.04%，这符合预期，因为生物对照包含额外噪声来源如体细胞突变。覆盖度和实验类型对纯合等位位点的第5百分位数阈值无显著影响（p>0.05）。因此，与随测序覆盖度变化的杂合等位边界不同，大多数胚胎采用单一的纯合等位匹配阈值（=95.8%）。四个四倍体M. platycarpa基因型明显表现出区别于所有其他基因型的复杂错误分布，强调需要建立独特的克隆阈值。四倍体M. platycarpa胚胎的杂合等位和纯合等位边界使用其掺入对照和分位数回归建立，杂合等位阈值采用基于覆盖度的模型，纯合等位阈值采用仅截距模型（=82.1%）。由于四倍体M. platycarpa基因型的掺入样本显示比生物对照更高的错误率，研究人员对这些样本的杂合等位边界应用了额外的生物惩罚，该惩罚基于为所有其他基因型构建的模型。

通过建立克隆胚胎的边界，测序胚胎根据其生殖类型被有效分为四个象限。Q1代表配子减数分裂、分离、重组和自花授粉（自交）。也存在孤雌单倍体产生的胚胎出现在Q1的可能性。Q2代表无融合生殖，即通过无减数分裂受精生殖和孤雌生殖产生的真正克隆种子。研究还考虑了自花授粉的BIII胚胎（自花授粉的无减数分裂胚囊）可能聚集在Q2中的可能性。Q3代表异花授粉的有性生殖，包括配子减数分裂、重组、分离和异花授粉。Q4被预测代表两种情形：1）Q3所列的所有现象，但更具体地涉及含有固定单倍型块（haploblock）的配子在某些交配伙伴之间的融合；或2）无减数分裂卵细胞接受异花授粉（BIII异交）。如果一个基因型至少有一个胚胎落在Q2中，则被确定为兼性无融合生殖。

为了评估模型在较少比较位点（主要是低测序覆盖度的结果）时的表现，研究人员从代表20个母本基因型的3个胚胎中进行了位点亚采样，这些胚胎在其完整数据集中均具有≥5000个比较位点。对于150和500个位点的比较，60个胚胎中有50个被分配到与其完整数据集相同的生殖象限。对于1000和2000个位点的比较，分别有53/60和56/60被分配到相同象限。总体而言，这些结果表明即使在比较很少位点的情况下，所有测序象限的准确率为83.3-93.3%，在简单区分克隆产生与有性产生的胚胎时准确率更高（93.3-100%）。

低覆盖度筛选-测序结果显示，大多数基因型（n=34）根据分位数回归模型仅通过推定有性过程产生胚胎（Q1、Q3和Q4）。与苹果属主要通过专性异交繁殖一致，这些基因型的大多数胚胎落在Q3中。在二倍体中检测到少量自交事件（Q1）（M. baccata 588907、M. 'Robinson' 589455、M. 'Ralph Shay' 589734），但大多数自交案例发生在多倍体中，更具体地说是四倍体中。所有专性异交个体均为二倍体，除了M. × domestica 'Goldgelb 55544' 589458和M. × domestica 'McClintock Grimes' 589124，两者均为三倍体。这些发现与其他观察一致，即栽培苹果无论倍性如何，均通过有性过程繁殖。

低覆盖度测序数据鉴定出17个先前未知的兼性无融合生殖类型。这里筛选的大多数兼性无融合生殖类型是多倍体（三倍体或四倍体），这是配子体无融合生殖的共同特征。一个例外是M. hybrid (M. rockii) 589421，GRIN-Global数据库中记录为二倍体。总体而言，这里确认的大多数无融合生殖材料属于原产于东亚和北美的物种，其种群中此前已有无融合生殖记录，包括M. hupehensis、M. sargentii、M. baccata、M. sikkimensis、M. toringo、M. transitoria、M. platycarpa和M. coronaria。然而，物种分类并不完全对应生殖模式，这突显了在个体水平上确定无融合生殖的必要性。根据低覆盖度测序筛选，三倍体无融合生殖类型M. sargentii 589400和M. hupehensis 633818、M. transitoria 633806、M. halliana 589013、M. micromalus 594092、M. sikkimensis 589750、M. platycarpa 589198、M. coronaria 590000、M. coronaria 589988、M. toringo 633814、M. toringo 613945和M. toringo 613932频繁产生Q4胚胎。与三倍体无融合生殖类型相比，四倍体无融合生殖类型（M. sikkimensis 589599、M. sikkimensis 613912、M. coronaria 589344、M. coronaria 589977、M. sargentii 589372和四倍体M. platycarpa个体）更常产生自交胚胎（Q1），这可能是三倍体苹果严重花粉不育的间接后果。

低覆盖度测序和FCSS在鉴定通过有性或无融合生殖过程产生的后代时总体上相互一致，但存在一些值得注意的差异。有若干基因型中FCSS捕获了至少一个无融合生殖种子，而测序筛选预测所有胚胎均为有性来源。例如，四倍体M. toringoides 588930的25个FCSS分析种子中有5个推测为无融合生殖产物。该基因型的两个Q4胚胎未通过纯合等位95.8%相似性阈值，差异≤1个百分点——结合FCSS数据，这引起它们是假阴性的怀疑。所有四个四倍体M. platycarpa基因型（588752、588847、589356和589415）根据FCSS均为兼性无融合生殖类型，以不同比例产生无融合生殖种子。然而，测序筛选仅捕获了M. platycarpa 589415的无融合生殖胚胎，该基因型根据FCSS数据也有最高的无融合生殖率。将这些基因型的杂合等位边界降低1.7个百分点足以将588752、588847、589356的一个Q1胚胎重新分配到Q2。相反地，FCSS数据偶尔在二倍体基因型中捕获推定的无融合生殖种子，而测序数据表明这些个体不产生克隆胚胎（M. asiatica 594099、M. 'Profusion' 589449、M. brevipes 589170和M. × adstringens 588898）。这些观察被认为是FCSS数据中的假阳性，因为这些基因型的所有测序胚胎都明显远离Q2边界。最后，一个三倍体基因型（M. platycarpa 589198）根据2023年测序的胚胎仅产生Q4胚胎，而2024年种子的FCSS结果表明假配合无融合生殖和基因组增加（未减数卵细胞受精）是其主要的生殖模式。

三、主要技术方法

研究人员使用了以下关键方法：1）低覆盖度全基因组测序（low-pass WGS）：对55个苹果属母本基因型进行至少15X深度测序，对其1,216个胚胎以平均3X或6X靶向覆盖度进行测序；2）基于分位数回归的克隆阈值建模：利用生物对照（已知高外显率兼性无融合生殖类型的克隆胚胎）和技术对照（母本DNA掺入样本）建立杂合等位和纯合等位位点的第5百分位数阈值，以统计区分克隆胚胎与其他生殖模式；3）生物信息学变异检测流程：使用fastp进行读段修剪和去重复、bwa-mem比对到苹果'蜜脆'（Honeycrisp）v1.1.a1参考基因组haplome A、bcftools和freebayes双重变异检测并通过GATK取交集、bcftools gtcheck计算母本与胚胎间的错配位点；4）流式细胞术种子筛选（FCSS）：对部分基因型的种子进行细胞核分离和DAPI染色，通过流式细胞仪检测胚胎和胚乳的倍性比例，推断生殖模式。

植物材料来源于美国农业部（USDA）国家植物种质系统（NPGS）苹果属种质资源库，位于纽约州日内瓦的ARS植物遗传资源单位。根据文献中无融合生殖记录、杂交种谱系中潜在无融合生殖物种、三倍体栽培苹果或野生二倍体无已知无融合生殖等标准选择筛选材料。

四、研究结论与意义

该研究是首次建立低覆盖度全基因组测序作为可扩展的无融合生殖筛选策略。研究利用USDA保存的丰富遗传资源，开发了一种低覆盖度全基因组测序方法用于检测苹果属基因型中的无融合生殖（克隆种子生产）。研究对代表超过20个已确认物种、杂交种和栽培苹果的55个个体进行了筛选，以多种WGS覆盖度对胚胎进行测序，并使用开源生物信息工具比较母本和后代序列数据。部分个体（n=26）也通过FCSS进行分析以验证和补充低覆盖度方法，两种数据类型在很大程度上相互一致，但也存在一些例外，部分说明了每种方法的优势和劣势。

虽然以往研究使用分子方法检测群体中的克隆繁殖，但本研究是首次在无需预先设计分子标记的情况下实现这一目标，并表明低覆盖度WGS是筛选克隆性及其他生殖形式的可靠选择。苹果属基因组较小（650 Mb），因此文库制备（使用半体积反应）和每个胚胎3X覆盖度测序的合计成本为每样本10.50美元。分析位点数量与测序覆盖度之间的关系表明，即使在四倍体中，1.5X覆盖度下仍能捕获数百到数千个双等位基因位点进行比较，可以得出可靠结论。亚采样实验也表明，在相对较少位点（以及由此推论的较低覆盖度）下具有较高准确性。

测序提供了鉴定克隆和有性后代的最直接方法，在FCSS不可行时可能是筛选繁殖的唯一合适选择。FCSS是目前捕获下一代倍性变化的最佳技术，只要母本基因型的倍性已知。基于序列数据预测倍性正在积极研究中。基于序列的筛选还解决了FCSS的某些有争议的解释。除了直接检测后代的遗传学之外，低成本测序方法研究繁殖的另一个优势是它容易区分自花授粉（自交）和异花授粉（异交）事件，为特定个体和群体的繁殖动态提供信息。在兼性无融合生殖类型中，单倍体孤雌生殖和BIII胚胎（推测来自无减数分裂卵细胞的授粉）总是与某种水平的纯无融合生殖共同发生，暗示无融合生殖组分可能通常共同遗传。研究产生的序列数据代表了迄今为止无融合生殖个体最多样化的WGS资源之一，可用于未来的比较组学研究以定位无融合生殖基因并描述其在苹果中的进化轨迹。这些基因在植物育种中具有巨大潜力，在多样化的被子植物谱系中表征它们可能缓解作物物种中工程化无融合生殖的现有障碍。