《Metabolic Engineering》：Development of a multi-copy integration platform in
Kluyveromyces marxianus enabled by a computational method for genome-wide identification of multi-copy integration loci
编辑推荐：
•开发了一种挖掘基因组多拷贝整合位点的计算方法。•建立了多拷贝整合平台用于Marxianus毕赤酵母。•多样的整合模式使得可根据表达需求选择定制的质粒工具。•应用高拷贝整和质粒实现了最高的番茄红素产量。引言多拷贝整合是代谢工程和合成生物学中的一项核心基础技术，用于开发高效、稳
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开发了一种挖掘基因组多拷贝整合位点的计算方法。
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建立了多拷贝整合平台用于Marxianus毕赤酵母。
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多样的整合模式使得可根据表达需求选择定制的质粒工具。
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应用高拷贝整和质粒实现了最高的番茄红素产量。
引言
多拷贝整合是代谢工程和合成生物学中的一项核心基础技术，用于开发高效、稳定且工业兼容的微生物菌株。通过提高限速酶的基因剂量，该技术能有效缓解代谢途径中的动力学瓶颈，从而将代谢通量高效地导向目标化合物的合成（Lv 等人，2019；Zhu 等人，2022）。为了建立多拷贝整合平台，研究人员广泛开发了模式生物和某些工业菌株中具有内在高转录活性的天然多拷贝基因组位点，主要包括核糖体DNA/RNA簇和逆转录转座子家族，如大肠杆菌的rrn操纵子（Zhang 等人，2026）、酿酒酵母的26S rDNA和δ序列（Bao 等人，2020；Chen 等人，2025b；Jacob 等人，2022；Li 等人，2021a；Park 和 Hahn，2019；Qi 等人，2022；Shi 等人，2016；Sun 等人，2015；Yamada 等人，2010；Yamada 等人，2018；Zhang 等人，2021）以及解脂耶氏酵母的26S rDNA和ζ序列（Bai 等人，2021；Chen 等人，2025a；Liu 等人，2022a；Liu 等人，2026；Nicaud 等人，2002；Novikova 等人，2021；Park 等人，2019；Sui 等人，2025；Wu 等人，2025；Xiang 等人，2025；Yamada 等人，2010；Zhang 等人，2012）。在这些位点整合关键途径基因已持续证明能显著增强目标代谢产物的产量。受物种基因组中逆转录转座子多样性的启发，近年来的研究已转向系统地挖掘和功能表征逆转录转座子家族，旨在扩展可用于高效多拷贝整合的"热点"库（Liu 等人，2024；Maury 等人，2016）。代表性研究包括Liu 等人（Liu 等人，2024）和Maury 等人（Maury 等人，2016）的工作，他们分别对解脂耶氏酵母和酿酒酵母的Ty元件家族（一类逆转录转座子）进行了深入分析，并成功鉴定了4-5组多拷贝整合位点。在这些发现的基础上，相应的多拷贝整合工具包——针对解脂耶氏酵母的YaliCMulti和YaliHMulti，以及针对酿酒酵母的EasyCloneMulti——被开发出来并成功应用于L-麦角硫因、2S-柚皮素和3-羟基丙酸等各种高价值化合物的生物合成途径中，最终实现了产物滴度的显著提高（Liu 等人，2024；Maury 等人，2016）。尽管这些进展大幅扩展了可用的多拷贝整合位点库，但在Ty转座子家族之外发现其他可用位点仍然困难。此外，当前挖掘多拷贝整合基因组位点的主流策略仍然严重依赖高质量的基因组注释。这种依赖性对于工业相关的非模式底盘生物——这些生物遗传背景表征不足但具有相当的应用潜力，如某些非模式细菌、丝状真菌或专用酵母菌株——构成了重大挑战。
此类具有工业前景的非模式底盘的代表性例子是Marxianus毕赤酵母，由于其独特的生理和代谢特性，在生物技术及工业微生物学领域引起了越来越多的关注（Qiu 等人，2023）。作为公认的Generally Recognized as Safe（GRAS）和食品级酵母，K. marxianus在高达52 °C的升高温度下表现出快速生长和高效的发酵能力（Matsumoto 等人，2018）。这些卓越的生长速率和耐热性降低了大规模发酵过程中受到微生物污染的风险（Bilal 等人，2022；Karim 等人，2020）。关键的是，作为典型的Crabtree阴性酵母，它能高效利用包括C5、C6和C12糖类在内的多种碳源，并将主要碳通量导向生物量积累和目标产物合成，从而最小化发酵性乙醇的产生（Qiu 等人，2023；Rodicio 和 Heinisch，2013；Rubio-Texeira，2006；Wagner 和 Alper，2016）。这种代谢特性尤为有利，因为它避免了因乙醇发酵造成的碳源浪费，从而提高了整体生产效率（Chang 等人，2014；Qiu 等人，2023；Wagner 和 Alper，2016）。除了代谢优势之外，K. marxianus还表现出优异的稳健性，能在广泛的pH范围内（2.5-9.0）生长，并对多种毒性抑制剂表现出耐受性，如重金属、乙酸、苯酚、糠醛和5-羟甲基糠醛（Vilg 等人，2014；Yazgan 等人，1993）。这种固有的耐受性使其能够承受大规模工业过程中固有的复杂、多变且可能具有抑制性的条件。这些优势已证明其在可持续生物制造领域具有巨大潜力，并使其成为极具前景的下一代通用微生物细胞工厂。事实上，经工程改造的K. marxianus菌株已成功证明能够生产各种重要化合物，包括琥珀酸（Gu 等人，2025；Zeng 等人，2025）、乳酸（Smets 等人，2025）、乙酸乙酯（L?bs 等人，2017）、乙醇（Zhang 等人，2015）、2-苯乙醇（González-Lozano 等人，2025；Li 等人，2021b；Rajkumar 和 Morrissey，2020）、麦角固醇（Liu 等人，2022b）、虾青素（Lin 等人，2017；Yang 等人，2022）以及某些功能性蛋白（Gombert 等人，2016）。然而，这些菌株的开发主要依赖于CRISPR-Cas9介导的单拷贝基因整合或游离质粒介导的多拷贝基因表达。为K. marxianus建立稳健的基因组多拷贝整合平台仍然是一项重大挑战，这在很大程度上是由于缺乏系统挖掘适合高效多拷贝整合的天然基因组位点的方法学。
为了克服这些局限性，我们开发了一种计算机辅助方法，用于在目标物种的全基因组范围内系统地鉴定潜在的多拷贝整合位点。该方法的核心优势在于它只需要目标物种的基因组序列作为输入，完全消除了对高质量基因组注释的依赖，从而理论上可广泛应用于任何具有测序基因组的物种。作为概念验证，我们将该方法应用于酿酒酵母和解脂耶氏酵母，成功鉴定了多个新的高拷贝整合位点，有效地丰富了现有的位点库。更重要的是，我们将该方法应用于K. marxianus，系统扫描其基因组并鉴定了四组多拷贝整合位点（KmCS1-4靶向位点），拷贝数范围为10至16。随后，我们结合5组多拷贝整合位点（新鉴定的KmCS1-4和传统的26S rDNA靶向位点）以及14种不同选择强度的标记，构建了一套包含70个多拷贝整合质粒的工具包。系统的表征实验证实，该工具包中的质粒表现出广泛的整合强度范围。这种梯度化强度谱有效地作为一本"说明手册"，指导用户根据目标代谢途径中限速酶的具体需求选择具有适当整合强度的质粒。为了进一步评估该工具包及配套说明手册的实用性和有效性，我们选择了具有低、中、高拷贝整合模式的三个代表性质粒，并将其应用于番茄红素生物合成途径。使用这三种质粒工具分别将2、6和9拷贝的番茄红素合成途径整合入基因组，分别产生了3.5、6.8和40.5 mg/L的番茄红素。这种基因剂量效应的明确展示突显了所开发的工具包及其说明手册在K. marxianus代谢工程中的高效性和实用性。我们的研究不仅提供了一种新颖的、不依赖注释的多拷贝基因组位点挖掘方法，还为K. marxianus建立了一个完善的多拷贝整合平台。
章节摘要
材料、菌株和培养基
聚合酶链式反应（PCR）使用高保真PrimeSTAR? Max DNA聚合酶（Takara Bio，北京，中国）或2× Rapid Taq Master Mix（Vazyme，南京，中国）进行。DNA片段按照制造商的说明使用Golden Gate Assembly Kit（BsaI-HFv2）（New England Biolabs，北京，中国）进行组装。酵母基因组DNA提取试剂盒购自广州百迈客生物科技有限公司（广州，中国）。合成基因和寡核苷酸
全基因组范围多拷贝整合位点鉴定计算方法的开发
多拷贝整合技术是代谢工程和合成生物学中的一项核心策略，用于增强基因剂量、提高酶表达，从而增强代谢通量向目标化合物的流动（Lv 等人，2019；Zhu 等人，2022）。尽管表现出高转录活性的基因组位点，如核糖体DNA（rDNA）簇和逆转录转座子元件，常被用作整合位点（Liu 等人，2024；Maury 等人，2016），但
讨论
在代谢工程和合成生物学领域，缓解限速步骤的动力学限制对于将代谢通量高效导向目标化合物的生产至关重要。多拷贝整合技术通过增强限速酶基因的剂量为这一核心挑战提供了强大的解决方案，使其成为合成生物学中不可或缺的策略（Lv 等人，2019；Zhu 等人，2022）。与传统的游离型
结论
在本研究中，我们建立了一种用于系统鉴定多拷贝整合位点的计算方法，该方法在理论上适用于任何具有测序基因组的物种。将此方法应用于非传统酵母K. marxianus，我们鉴定了四组具有10-16个基因组拷贝的多拷贝整合位点（KmCS1-4）。通过将五组位点（KmCS1-4和传统的26S rDNA位点）与14种不同强度的选择标记相结合，我们构建了
CRediT作者贡献声明
赵思博：调查研究。高松峰：撰写——初稿，调查研究。徐培：资金获取，概念化设计。李新瑞：调查研究。刘建中：撰写——审阅与编辑，监督指导，项目管理，资金获取，概念化设计
数据可用性
本研究过程中产生或分析的所有数据均包含在已发表的文章及其补充信息文件中。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在已知可能影响本文所报告工作的竞争经济利益或个人关系。
致谢
本研究受国家重点研发计划（2024YFA0918000）、广东省科技计划（项目编号：2024B1111130003、2024B1111160007和2024B1111150001）资助。
高松峰|赵思博|李新瑞|徐培|刘建中
