综述：用于动物精液质量评估、生殖疾病诊断和精子保存的快速技术：综述

《Reproductive Biology》：Rapid technologies for animal semen quality assessment, reproductive disease diagnosis, and sperm preservation: A review

　　

摘要
准确评估动物精液质量对于提高人工授精效率、保护遗传资源以及实现畜牧业的可持续发展至关重要。尽管传统精液评估方法（如显微镜形态观察、流式细胞术和低渗肿胀试验）已经标准化，但它们通常存在处理时间长、依赖实验室设备以及需要专业操作等缺点，无法满足农场育种指导和实时精液活力监测等快速响应场景的需求。本综述对 2020 年至 2026 年间快速动物精液质量检测技术的最新进展进行了批判性和系统性的综合，特别关注现场验证状态和实际实施可行性。重点比较了计算机辅助精子分析 (CASA) 的两个分支——传统基于图像的处理系统和新兴的深度学习方法——在分析灵敏度、便携性和现场部署能力方面的差异。此外，本文报告了微流控芯片技术和基于智能手机的成像系统作为下一代即时医疗工具的应用，能够实现单精子水平的多参数分析。还回顾了便携式生物传感器（如阻抗传感器和侧向流动试条）在快速检测精液中氧化应激和 DNA 片段化方面的潜力，以及人工智能在自动化精子形态分类和运动轨迹预测中日益增长的作用。基于连接分子靶标与生育结果的统一生物框架，本综述系统地评估了新兴的生育相关生物标志物，包括蛋白质组学特征、细胞外囊泡、非编码 RNA 和表观遗传标记物，并批判性地评估了它们对现场繁殖表现的预测价值。应用了为兽医诊断量身定制的修改版 QUADAS-2 框架，对所有纳入技术的证据强度进行分级，区分高质量的多中心验证方法与概念验证原型，并系统地识别了光谱偏差、操作员盲法缺失和开发者主导的验证研究等偏差来源。定量分析显示，仅 7.1% 的纳入研究符合高质量证据标准，而 82.5% 的新兴技术评估由于开发者主导的试验设计存在性能高估偏差。建立了一个三级技术成熟度分类，以区分已建立的实验室标准、经现场验证的开发工具和概念验证的新兴技术，明确每种方法的实际准备就绪程度。先进的快速检测方法已将总检测时间从 30 至 60 分钟（传统手动显微镜）减少到 5 至 15 分钟；然而，样本预处理标准化和精液异质性造成的干扰方面仍存在挑战。提出了一个结构化的、基于场景的技术选择框架，对资本设备成本、每次检测试剂成本、培训投资以及不同部署规模下的成本效益进行了完全量化的比较，并以传统手动显微镜和实验室金标准方法为基准，明确每种部署场景的增量成本效益比，以协助研究人员和从业者根据特定需求（包括灵敏度、成本、通量和部署场景）选择合适的检测方法。跨 12 个标准化性能标准的多维比较分析表明，基于微流控芯片的深度学习辅助成像在检测速度、准确性和现场部署能力之间实现了最佳平衡，而流式细胞术仍然是实验室精液质量评估的定量金标准。本综述还深入分析了当前主要全球司法管辖区兽医精液诊断设备的标准化差距和监管框架，识别了商业转化的关键障碍，包括缺乏认证参考材料、实验室间能力验证计划不完善以及即时医疗产品监管路径碎片化。最后，提出了一个分阶段的 10 年转化路线图，突出了优先方向，包括多组学整合、多重即时医疗平台开发、跨物种诊断标准化以及实验室原型的商业转化。

引言
动物精液质量是人工授精成功、种畜利用效率和遗传改进进程的核心决定因素，直接影响畜牧业的可持续发展和粮食安全 [1]。世界动物卫生组织 (WOAH, 前身为 OIE) 和国家兽医主管部门已将精液质量检测纳入种畜健康监测和繁殖管理的必要技术规范中 [2]。精液质量差不仅降低受孕率、产仔数和后代活力，造成重大经济损失，还可能通过携带病原体（如病毒、细菌）或异常遗传物质促进生殖道疾病的传播和种群退化 [1,3,4]。随着集约化养殖的扩展和精英种质资源的全球贸易，猪、牛、羊、马及珍稀动物等牲畜的人工授精技术迫切需求高效、稳定且可在现场操作的精液质量评估系统 [5]。因此，开发用于评估精液功能（运动力、形态、DNA 完整性、氧化应激等）的快速、准确且可现场使用的技术，对于提高繁殖效率、确保育种安全和优化兽医临床决策具有重要的战略意义 [[5], [6], [7]]。

动物精液质量评估的范围已扩展到传统精子运动力和形态评估之外，包括精子 DNA 片段化、线粒体膜电位、顶体状态、氧化应激水平以及精液中潜在病原体的筛查。精子功能缺陷和精液污染破坏了受精和胚胎发育的平衡，从而降低种用动物的繁殖潜力 [8]。此外，病原体通过精液在群体中传播的经济影响深远。例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)、牛病毒腹泻病毒 (BVDV) 或马传染性生殖道炎细菌可通过受污染的精液快速传播，导致大规模繁殖障碍和生产率损失，每年给全球畜牧业造成数十亿美元的损失 [3,[9], [10], [11]]。因此，开发不仅准确而且快速且适合现场部署的检测技术，已成为动物精液质量监测的核心优先事项 [5,12]。

历史上，动物精液质量评估主要依赖于显微镜运动分级、形态学检查和顶体染色，辅以低渗肿胀试验等。由于其方案标准化、成本低廉且可直接可视化细胞结构，这些方法仍然是许多基层育种站和实验室的常规程序 [8,[13], [14], [15], [16]]。然而，传统手动显微镜方法劳动密集且耗时，通常需要 30–60 分钟才能完成单个样本分析。它们还严重依赖操作者经验，存在显著的主观变异性，无法满足大规模样本处理或现场快速筛查的需求 [5,17,18]。相比之下，标准化的台式 CASA 系统将每个样本的分析时间减少到 5–15 分钟，且操作者间变异性远低于手动方法，尽管由于设备和校准要求，它们仍然主要局限于实验室环境中。

传统免疫学方法，如酶联免疫吸附测定 (ELISA)，提供了一种比显微镜更快的替代方案，通过检测精浆或精液相关功能蛋白（如泛素、氧化应激标记物）中的病原体特异性抗原，提供高分析特异性和高通量筛查潜力 [[19], [20], [21], [22], [23]]。然而，在病原体载量通常较低或功能标记物浓度极微小的精液样本中，传统 ELISA 通常需要预浓缩，可能无法达到现场监测所需的灵敏度 [[24], [25], [26]]。此外，大多数牲畜精液相关功能蛋白的商业化抗体缺乏，且此类抗体的生产劳动密集、耗时且成本高昂。检测性能还受精浆基质干扰（高蛋白、高锌离子含量）以及抗体在现场环境中的稳定性差所限制，尤其是在资源有限的环境中 [27,28]。这些缺点推动了针对核酸、蛋白功能标记物和精子物理特性（如计算机辅助精子分析 (CASA)、等温扩增、微流控和生物传感器）的新型快速检测策略的大量研究，这些方法在灵敏度和速度上远超传统的表型或抗原检测方法 [5,17,[29], [30], [31], [32]]。

20 世纪末计算机辅助精液分析 (CASA) 系统的出现，将精子运动力和动力学参数的评估从主观视觉估算转变为半定量化、可重复的数字分析 [[33], [34], [35], [36]]。在随后的几十年里，集成荧光流式细胞术的 CASA 系统成为育种站和繁殖实验室精液质量评估的基石工具，归功于其快速周转、高分析灵敏度和特异性 [[37], [38], [39]]。通过直接追踪精子运动轨迹或标记精子质膜完整性，CASA 实现了对精子运动力、浓度和形态的客观量化，并成功用于预测人工授精后的受孕率 [[40], [41], [42], [43], [44], [45]]。近年来，基于深度学习的高通量 CASA 实现了运动力、形态和浓度的单次分析多参数评估，检测限通常比传统主观显微镜低 10–100 倍，极大地促进了种畜的大规模筛查和生殖疾病诊断 [[46], [47], [48], [49]]。

然而，尽管被广泛使用，基于 CASA 和流式细胞术的分析通常依赖于昂贵的光学系统、专用试剂和经过培训的人员，这限制了大多数应用局限于中心实验室 [5,[50], [51], [52]]。这种集中化引入了后勤瓶颈，因为精液样本必须从农场运输到实验室并排队处理，重新引入了可能抵消检测本身快速性的延迟 [53,54]。此外，精液样本通常含有 PCR 或等温扩增的抑制剂（如锌离子、柠檬酸、高蛋白浓度），这会干扰酶活性或堵塞微流控通道，需要进行复杂的纯化步骤以防止假阴性 [[55], [56], [57], [58]]。为了克服这些问题，最近的研究集中在等温扩增技术上，特别是环介导等温扩增 (LAMP) 和重组酶聚合酶扩增 (RPA)，它们在恒温条件下无需热循环即可扩增精液中的精子来源 DNA 或病原体核酸，从而实现更简单、低功耗的设备，更适合即时医疗和现场测试 [32,[59], [60], [61], [62]]。

最近，成簇规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 技术与核酸扩增的集成已成为一项颠覆性创新 [63,64]。通过利用 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白的 RNA 引导、序列特异性切割活性以及扩增反应的指数信号生成，这些混合平台显著提高了即时医疗环境中的分析灵敏度和特异性 [63,65,66]。采用 Cas12 或 Cas13 效应器的 CRISPR-Cas 系统利用其可编程性和多轮转换切割活性，实现接近单分子的检测限，同时区分单核苷酸变异，从而解决了传统检测中通常由非特异性扩增引起的假阳性信号问题 [[65], [66], [67]]。与此同时，微流控技术的进步使得这些复杂的生化工作流程得以微缩到实验室芯片 (LOC) 设备上，促进了自动化、样本到答案平台的开发 [68]。值得注意的是，截至 2026 年，CRISPR-Cas 系统在动物精液质量测试中的直接应用仍处于概念验证阶段，尚无经过验证的可现场部署的检测方法。

大量高质量的系统性综述推动了全球对动物精液质量检测技术的理解，每篇综述都在该领域做出了独特的专业贡献。一系列聚焦综述讨论了 CASA、流式细胞术和精子 DNA 片段化测试等个别核心技术，提供了关于每种方法技术演进和应用的详细、针对性见解，从而为该领域的专项研究建立了坚实的基础参考。同时，几篇最近的综合性综述提供了对精液质量检测技术的更广泛概述：Andone 等人回顾了不孕症诊断技术的最新进展，重点比较了传统方法与基于纳米技术的生物传感器及分子方法在快速精液测试中的应用 [69]；Hackerova 等人对使用计算机辅助精子分析 (CASA) 评估公猪精子运动力的主流检测技术进行了广泛、全面的概述，并深入分析了样本制备、成像条件和分析参数等关键实际问题 [70]。

基于现有文献的这些坚实的基础贡献，本综述解决了当前综述中的四个关键未满足差距：(1) 使用兽医适应的 QUADAS-2 框架对所有纳入技术的证据质量进行系统性批判性评估，分级评估现场验证状态，明确量化优化实验室条件下的分析性能与真实现场样本诊断性能之间的差距，并深入分析限制广泛商业采用的偏差来源和转化障碍；(2) 整合生殖生物学框架，将分子检测靶标与精子生理功能及现场生育结果联系起来，超越以技术为中心的叙述；(3) 一个结构化的、多标准的技术选择框架，包含资本成本、每次检测试剂成本、培训要求以及规模相关成本效益的完全量化指标，以及分阶段的未来发展路线图；(4) 扩展的、特定司法辖区的分析，涵盖兽医精液诊断设备的标准化差距和监管框架，包括主要全球畜牧业生产区的认证参考材料、实验室间能力验证和市场批准路径。

本综述的其余部分组织如下。第 2 节首先建立精液质量评估的统一生物框架，然后总结核酸扩增策略的最新进展，包括聚合酶链反应 (PCR)、定量 PCR (qPCR)、数字 PCR (dPCR) 和主流等温扩增技术。

第3节概述了功能探针及新兴生育力生物标志物的应用进展，包括基于CRISPR的动物精液质量检测诊断系统，并专门对CRISPR-Cas12a和Cas13a平台进行了比较整合。第4节综述了为自动化、现场可部署检测而开发的光电传感器和微流控芯片平台。第5节讨论了基于下一代测序（NGS）的检测方法，以及人工智能/机器学习（AI/ML）辅助动物精液数据分析的进展。第6节提供了关键性的跨技术比较、生物标志物对现场生育力的预测价值评估、标准化多维度性能基准、系统性跨技术比较，提出了与特定应用场景相匹配的标准化技术选择框架（表4），并通过分阶段10年转化路线图识别了当前技术局限性和未来发展机会。最后，第7节以本综述的核心发现和观点作为结论（图1）。

### 文献搜索与纳入排除标准

在Web of Science、PubMed、Scopus和中国知网（CNKI）数据库中进行了系统的文献检索，检索时间范围为2020年1月至2026年12月。主要检索词包括（"animal semen"或"boar semen"或"bull semen"或"stallion semen"或"livestock"或"veterinary andrology"）且（"semen quality"或"sperm quality"或"sperm motility"或"sperm morphology"或"sperm DNA fragmentation"或"oxidative stress"或"mitochondrial membrane potential"）且（"rapid detection"或"point-of-care"或"field test"或"CASA"或"computer-assisted sperm analysis"或"deep learning"或"microfluidic"或"biosensor"或"lateral flow"或"LAMP"或"RPA"或"CRISPR"或"smartphone"）。针对特定主题还进行了二次检索，包括精液储存监测、物联网（IoT）辅助检测和手持式精子计数器。

**纳入标准**要求研究满足以下条件：（1）描述了应用于动物（猪、牛、马、羊等）或伴侣动物精液质量检测的方法；（2）报告了检测性能（灵敏度、特异性、检出限或检测周转时间）的原始数据；（3）发表在同行评审期刊上。当综述文章提供了与特定技术类别相关的系统性总结时，也被纳入。

**排除标准**排除了以下研究：仅聚焦于人类精液诊断且缺乏动物模型验证的研究、非同行评审的会议摘要、以及2020年之前发表但未构成核心方法学基础的研究。基础性参考文献（2020年之前）在必要情况下予以保留，用于描述已确立技术的核心原理和机制（如CASA、流式细胞术、LAMP原理）。

### 检索与筛选流程

初步检索共获得1850条记录。去除重复条目后，对标题和摘要进行相关性筛选，随后通过全文审阅对580篇文章进行合资格评估。最终纳入168篇参考文献，在剔除偏侧向的人类专用研究和冗余引用后，优先选择报告了现场验证、多中心数据、新型平台整合或头对头比较性能数据的研究。同时，对纳入文章的参考文献列表及相关综述进行了手动检索，以识别数据库查询可能遗漏的额外研究。

本系统性综述严格按照系统综述与荟萃分析报告优先项目（PRISMA）指南进行，以确保方法学的严谨性和透明度。两名独立评审人员进行了标题/摘要筛选和全文合资格评估，分歧通过与第三名评审人员达成共识的方式解决。按照诊断准确性研究的QUADAS-2框架对每篇纳入研究的风险偏倚进行了评估，具有高风险偏倚或性能报告不足的研究被排除在比较分析之外。

### 证据质量评估

为系统评估纳入证据的质量，每篇研究均使用针对兽医诊断检测的改良QUADAS-2框架进行评分，涵盖四个领域：患者谱（现场条件的样本代表性）、参考标准适当性、索引测试盲法以及流程与时间。证据强度采用四级评分标准：高（多中心现场验证、样本量>500、盲法设计、标准化参考）、中等（单中心现场验证、样本量100–500、明确定义的参考标准）、低（使用加标或纯化样本的实验室对照研究）、极低（仅使用缓冲液或有限临床样本的概念验证原型）。该评分体系贯穿本综述的批判性评估，以区分分析性能声明与实际诊断可靠性。

在168篇纳入的主要研究中，仅有12篇（7.1%）被评为高质量证据，全部涉及具有标准化操作规程的台式CASA和流式细胞术系统。37篇研究（22.0%）被评为中等质量证据，主要涵盖在单中心现场条件下测试的便携式CASA设备和等温扩增检测。纳入研究中的大多数（103篇，61.3%）被归类为低质量证据，代表基于实验室分析验证，使用处理或加标的精液样本。其余16篇研究（9.5%）被评为极低质量的概念验证原型，主要为基于缓冲液系统测试的CRISPR诊断和新型电化学光传感器。总体而言，70.8%的新兴技术研究存在高或不明确的患者谱偏倚风险，因为样本来源于受控研究环境而非商业化农场条件；82.5%的开发团队主导研究缺乏独立操作人员盲法，引入了可测量的性能高估。

按技术类别分层，台式CASA和流式细胞术的高质量证据比例最高（分别为42%和38%），其次是等温扩增检测（12%中等质量，0%高质量）。微流控芯片、电化学光传感器和基于CRISPR的诊断技术几乎全部由低质量或极低质量证据主导（分别为92%、97%和100%），几乎所有性能数据均来自受控实验室环境而非农场现场条件。

### 荟萃分析决策说明

未进行诊断性能指标的正式荟萃分析，此决定具有方法学上的合理性。所涵盖的技术跨越了根本不同的分析模态——基于图像的CASA、流式细胞术、电化学光传感器、核酸扩增检测和下一代测序——每种技术依赖于不同的参考标准（手动显微镜检查、流式细胞术、微生物培养、qPCR），且报告的非重叠性能指标不同。跨此类高度异质的检测类型汇集灵敏度或特异性估计值将产生统计上不可靠且具有临床误导性的结果。取而代之的是，本综述使用12项标准化性能标准对所有技术进行统一的半定量比较分析，在保持方法学有效性的同时实现客观的跨技术比较（见表1、表2、表3、表4、表5和图4）。

### 章节摘要片段

**精液质量评估的生物学框架：从分子靶点到生育力结局**

精液质量是一种多因素生物学性状，直接由精子生理状态和精浆微环境决定，其功能完整性最终在现场生育力结局中得到反映。精液质量评估的核心生物学过程包括以下维度，每个维度对应特定的检测靶点和技术要求：

**（1）精子结构与运动功能：** 精子运动、形态和膜完整性是……

**基于功能探针和特异性标记的精子质量检测技术：诊断特异性的新前沿**

尽管等温扩增、微流控芯片等方法在快速精液质量检测方面取得了显著进展，但在区分精子功能完整性细微差异（如区分单链与双链DNA断裂、判定真实顶体反应状态、检测线粒体膜电位微弱变化）方面仍存在特异性不足的问题。特定功能探针和靶向……

**光传感器与微流控：迈向自动化检测平台**

尽管上述核酸扩增和特异性探针技术提供了高灵敏度和特异性，但其在农场和育种站等现场环境中的广泛应用仍然依赖于集成化、自动化且易于操作的检测平台。微流控芯片系统、光传感器和便携式光学读取设备是将这些实验室级检测方法转化为现场可部署工具的关键[17,94]。通过微型化液体处理……

**下一代测序与人工智能**

上述靶向分子检测和光传感器方法擅长高灵敏度检测已知的精液质量相关标志物，但它们需要预先了解目标分子或基因。相比之下，下一代测序（NGS）能够对精液样本中的精子基因组、表观遗传特征和微生物组进行全面、无培养的谱分析，支持对已知和新型遗传变异、DNA甲基化模式的同时检测……

**技术成熟度分类**

基于第1.5节确立的四级证据强度评分，所有综述技术被分为三个成熟度层级，每个层级具有明确的证据要求和转化准备度指标：

为明确现有支持数据的权重，我们进一步定义了精液诊断检测的三级现场验证层次：（1）实验室概念验证：在严格控制条件下使用纯化、加标或缓冲液稀释的精液测量性能……

### 结论

本综述系统综合了2020年至2026年间标题所定义的三个核心领域的进展：动物精液质量评估、繁殖疾病诊断和精子保存监测。涵盖范围包括传统实验室方法、基于功能探针的检测、等温扩增和CRISPR诊断、微流控和光传感器平台、下一代测序以及人工智能辅助分析。基于12项标准化……

### CRediT作者贡献声明

Z.Z：调查研究、撰写手稿、撰写综述和编辑、数据整理。L.S.H, M.B.H：文献数据提取、图表准备。G.M.L：审阅和编辑。所有作者均已阅读并批准了本手稿。

### 出版同意声明

不适用。

### 伦理批准和参与同意

不适用。

### 声明：生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的使用

在本工作准备过程中，作者仅使用DeepL（https://www.deepl.com/）对原稿进行语言润色和语法改进。未使用任何人工智能工具生成科学内容、进行文献检索、选择或总结参考文献，或创建任何图表。

### 资金

新疆生产建设兵团自然科学技术发展项目（项目编号：2022ZD106）。

### 利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

本工作得到了新疆生产建设兵团自然科学技术发展项目（项目编号：2022ZD106）的支持。

所有作者均对手稿有所贡献并批准了最终提交版本。

### 致谢

特别感谢塔里木大学李连瑞教授在写作和实际操作方面提供的帮助。

张震|马百何|郭美亮|刘书华|李连瑞