引言
鱼类的表皮缺乏陆生脊椎动物中通常所具有的发达角质层。相反，鱼体表面覆盖着一层主要由黏蛋白组成的黏液层，这是一种适应水生环境的保护结构。该黏液层在与外界环境的界面处发挥物理屏障功能，并通过润滑和物理覆盖促进体表防御（Shephard, 1984）。此外，黏液层还充当一种生物活性水凝胶，含有多种具有生理活性的分子（Quintana-Hayashi et al., 2024），如凝集素（Sakakibara et al., 2024; Suzuki et al., 2003; Tsutsui et al., 2016）、免疫相关分子（Koshio, 2016; Matsui et al., 2020）、多种酶类（Dash et al., 2018; Firth et al., 2000）以及参与组织修复的分子（Brinchmann, 2016）。因此，鱼类皮肤黏液被认为不仅具有保护涂层的功能，还作为一个响应平台，支持损伤和感染相关的局部反应。
鱼类拥有与哺乳动物类似的血液凝固系统，并伴随纤维蛋白的形成（Jiang and Doolittle, 2003）。除了由组织因子（TF）和凝血因子VII介导的外源性凝血启动通路、凝血因子X（Hu et al., 2017）以及纤维蛋白形成所需的凝血酶原（Matsui et al., 2023）和相关辅助因子在鱼类中均得到保守（Mariz and Nery, 2020）。然而，尽管许多鱼类谱系缺乏凝血因子XII（Ponczek et al., 2020），已有研究提出存在一条响应负电荷表面的类似内源性通路（Kawatsu, 1986; Kawatsu et al., 1991; Jagadeeswaran and Sheehan, 1999），但其分子基础及生理意义在很大程度上仍未阐明。虽然鱼类凝血系统具有与陆生脊椎动物相同的框架，但其激活方式和调控机制可能具有独特的特征。
在哺乳动物中，分泌物与止血/凝血之间的关系早已被认识。经典的观察表明唾液可促进血液凝固（Borsay et al., 1949），近年来，基于唾液中含有暴露组织因子的细胞外囊泡（EVs）且能以组织因子依赖的方式启动局部凝血的证据，这一观察得到了重新审视（Berckmans et al., 2011; van der Vorm et al., 2018; Yu et al., 2018）。这些发现表明，黏膜表面的分泌物不仅是物理屏障，还可能通过伤口覆盖和启动局部凝血来促进宿主防御。相应地，在鱼体表面持续覆盖有黏液层且易因与外界环境接触而受损的情况下，皮肤黏液可能参与局部凝血的调控。
相比之下，非哺乳类脊椎动物黏膜组织的凝血相关功能仍知之甚少。这一问题对鱼类尤为重要，因为鱼体表面作为直接暴露于水环境的黏膜界面（Cabillon and Lazado, 2019; Koshio, 2016）。当体表面受损时，血浆成分可与周围水体及黏液层发生相互作用。在此条件下，皮肤黏液加速血浆凝固可能有助于局部凝块的形成。然而，过度或持久存在的凝块样基质可能干扰正常的黏膜功能，如上皮更新、黏液分泌、免疫监视、微生物相互作用和伤口修复（Cabillon and Lazado, 2019; Koshio, 2016; Sveen et al., 2020）。因此，在体外条件下确定基础皮肤黏液是加速还是抑制血浆凝血，是理解鱼体表面黏液相关凝血的重要第一步。
本研究选用日本牙鲆（Paralichthys olivaceus）作为底栖鱼类模型，其黏液覆盖的体表面在自然水域环境中经常与底部基质接触（Miyazaki et al., 1997）。采用改编自临床凝血检测的类凝血酶原时间（PT）和类活化部分凝血活酶时间（aPTT）测定方法，定量评估了粗提皮肤黏液对血浆凝固的影响。此外，利用苯甲酰胺固定化基质进行亲和色谱，以确定黏液对凝血的调控是否与胰蛋白酶样或丝氨酸蛋白酶样组分有关。同时使用不同分子量截留值的超滤膜和尺寸排除色谱按分子量对黏液进行分级，并评估各组分对凝血活性的影响。这些方法提供了初步信息，有助于了解当血浆成分与黏液覆盖的体表面接触时，来自黏液的组分如何影响血浆凝血。
