活性导向的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电洗脱联用数据非依赖采集蛋白质组学揭示成熟花生种子中的超氧化物歧化酶与抗氧化网络

《Protein Expression and Purification》：Activity-guided native-PAGE electroelution coupled with DIA proteomics uncovers the superoxide dismutase and antioxidant network in mature peanut seeds

　　

# 摘要

成熟花生（*Arachis hypogaea* L.）种子中积累了大量超氧化物歧化酶（SOD），但高丰度的贮藏蛋白掩盖了痕量抗氧化酶，阻碍了通过常规蛋白质组学方法对内源SOD同工酶进行精确表征。本研究报道了一套活性导向的工作流程，将原生聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）NBT酶谱染色、低温透析袋电洗脱和基于数据非依赖采集（DIA）的纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）相结合，从种子粗提物中富集天然SOD复合物。将两条SOD活性凝胶条带（B1和B2）切取、嵌入琼脂糖凝胶后电洗脱，回收完整蛋白进行蛋白质组学分析。在粗提对照（CK）和两个富集组分中，共注释了1737个非冗余蛋白，其中775个（44.6%）仅在SOD活性条带中检测到，在CK中未检测到，证明了该隐蔽蛋白质组的高效富集。共鉴定出6个SOD相关蛋白：1个线粒体Mn-SOD、铜伴侣蛋白CCS和4个Cu/Zn-SOD同工酶。定量分析显示，Cu/Zn-SOD的总丰度超过Mn-SOD100倍以上，表明Cu/Zn-SOD是成熟种子中的优势SOD亚型。此外，还检测到18个共同富集的ROS清除酶，整合转录组学分析证实了其中5个SOD蛋白的组织特异性和发育特异性表达。该低成本流程实现了近乎定量的回收，克服了贮藏蛋白干扰，解析了花生种子中隐蔽的抗氧化蛋白质组，为研究作物种子中的同工酶谱系和氧化还原蛋白网络提供了通用策略。

# 引言

花生（*Arachis hypogaea* L.）是一种异源四倍体豆科植物，原产于南美洲，现已在全球范围内广泛种植，是食用油和食品的重要来源，因其营养、药用和农学价值而备受重视[1,2]。成熟花生种子（MPSs）积累了一系列抗氧化代谢物，包括白藜芦醇、黄酮类化合物和儿茶素，这些代谢物对种子的长期保存、自由基清除和抗逆性至关重要；种子提取物还被用作功能食品和作物抗逆产品的原料[1,3]。在花生组织的内源抗氧化酶中，超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）是清除超氧阴离子自由基（O??）并维持细胞活性氧（ROS）稳态的主要酶[4]。生化调查显示，花生叶片中的SOD活性约为870 U/g[5]，而多种花生品种的成熟种子中SOD活性为930–1660 U/g[6]，这使得成熟花生种子成为工业界和育种项目共同关注的天然SOD富集材料。

SOD介导的ROS解毒与花生种子的重要农艺性状密切相关。SOD活性是种子活力[7,8,9]、脱水和高温老化后的贮藏期和发芽能力[10,11]的可靠生化标志物，内源SOD积累可提高对干旱、盐碱和真菌病原菌的耐受性[12,13,14]。将花生Cu/Zn-SOD（NCBI ID: DQ499511）在烟草中异源过表达，显著提高了植物在盐渍与干旱复合胁迫下的存活率[15]；钙处理通过上调SOD基因转录，增强了花生对*Phoma arachidicola*叶斑病的抗性[14]。叶绿体/细胞质Cu/Zn-SOD旁系同源基因AhCSD2在野生二倍体祖先和栽培四倍体花生之间表现出序列分歧[16]，提示SOD同工酶在驯化和胁迫适应过程中发生了功能分化。因此，SOD基因家族处于花生种子质量和抗逆性（包括非生物和生物胁迫）的核心地位。

栽培花生参考基因组的全基因组注释鉴定了25个全长SOD编码基因，分为三个亚族——16个Cu/Zn-SOD、6个Fe-SOD和3个Mn-SOD旁系同源基因——主要通过区段重复产生[4]。启动子分析在SOD启动子中检测到胁迫响应顺式元件（MBS、ABRE和ARE），与所有25个位点的组织特异性和可诱导转录一致[4]。然而，利用NBT活性染色进行原生聚丙烯酰胺凝胶电泳酶谱分析时，在不同花生品种的成熟种子中仅能分辨出4–6条可见SOD活性条带[17]，基因组互补体与实验可观察活性酶之间存在明显差异。同时，结构和计算研究推进了我们对SOD分子层面的理解：结构指导的共识设计结合定点突变提高了Cu/Zn-SOD的催化效率和二聚体稳定性[18]，单个P61G替换增强了动力学特性及对H?O?失活的耐受性[19]，显式溶剂分子动力学模拟被用于探查SOD1变体的构象行为和聚集[20]。然而，这些方法作用于分离或工程改造的酶，无法直接反映植物体内积累的同工酶。在成熟、耐脱水花生种子中，各个SOD同工酶亚型的亚细胞定位、相对化学计量比和协同氧化还原功能在蛋白质组水平上仍未得到表征。因此，目前尚无法确定哪些预测的SOD基因实际上被翻译为催化活性蛋白并在收获期种子中积累，这既限制了目标分子育种，也制约了工业SOD提取。

基于质谱（MS）的鸟枪法蛋白质组学是全局蛋白表征的标准工具，但种子蛋白质组学面临固有障碍：球蛋白和白蛋白贮藏蛋白的浓度极高，其离子信号抑制了痕量功能酶的肽段鉴定，形成了常规工作流程无法触及的"隐蔽蛋白质组"[21,22]。这种掩盖效应严重限制了豆科、禾本科和油料种子中SOD、过氧化物酶和硫氧还蛋白等低丰度氧化还原酶的检测[23]。

常规样品制备策略——粗提物直接酶切[24]、甲醇-氯仿沉淀[25]、FASP超滤[26]和S-Trap单管酶切[27]——对高丰度管家蛋白具有可接受的重现性，但无法有效分离贮藏蛋白与少量功能酶[28]。基于抗体的脱耗和纳米粒子分级部分去除了高丰度背景蛋白，但成本较高，造成中等表达蛋白的非特异性共损失，且残留贮藏蛋白干扰[29,30]。微流控nanoPOTS平台实现了近乎无损的单细胞蛋白质组学，但需要专门的昂贵仪器，大多数植物生物化学实验室不具备[31]。

原生聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）在非变性条件下进行，不使用SDS或还原剂，保留天然三级结构、寡聚复合物和酶活性；结合胶内NBT活性染色，可视觉识别和分离催化活性SOD同工酶，依据天然分子量与净电荷对其进行区分[32]。蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）是一种相关技术，已被广泛用于解析植物膜蛋白复合物[33]，但很少有方案将原生活性酶谱与低成本电洗脱相结合，以回收完整目标酶进行下游定量蛋白质组学。使用透析袋进行低压电洗脱是一种有前景的替代方法：它以>90%的得率从切取的凝胶条中回收天然蛋白，去除核酸和脂质污染物，并提高低丰度肽段的MS离子化效率而不破坏催化活性[34,35,36]。然而，目前尚未有标准化的工作流程将原生PAGE活性染色、透析袋电洗脱和DIA定量蛋白质组学相结合，用于系统表征种子SOD同工酶及其相关抗氧化互作组。

为填补这些科学和技术空白，提出了两个可检验的假说：(1) 成熟花生种子粗提物中含有多种低丰度SOD旁系同源基因和协同性ROS清除酶，由于主要贮藏蛋白的信号抑制，标准鸟枪法蛋白质组学无法识别；(2) 结合原生PAGE NBT酶谱与低温透析袋电洗脱的活性导向流程可以从贮藏蛋白背景中物理分离完整的天然SOD复合物，实现隐蔽种子抗氧化蛋白质组的灵敏定量表征。据此，本研究设定了四个目标：(i) 建立一套低成本、实验室可及的原生PAGE/透析袋电洗脱工作流程，从成熟花生种子凝胶条中近乎完整地回收催化活性完整的SOD同工酶；(ii) 应用基于DIA的nano-LC-MS/MS鉴定、注释和比较富集活性凝胶组分与未处理粗提物中的SOD相关蛋白及共同富集的ROS清除酶；(iii) 整合公共花生转录组数据集，验证已鉴定SOD同工酶的组织特异性和发育阶段特异性表达，将蛋白质组丰度与转录调控关联；(iv) 评估该活性导向分级策略在其他作物种子蛋白质组中挖掘低丰度功能性同工酶的通用适用性。所得方法简便、可重复，克服了种子蛋白质组学中的贮藏蛋白干扰，定义了成熟花生种子中实际表达的SOD同工酶谱系，为未来研究花生SOD为中心的抗氧化网络和抗逆育种靶标提供了基础数据集。

## 材料与方法片段

### 植物材料与试剂

成熟花生种子（MPS，*Arachis hypogaea* L. 品种玉华9326）于2024年9月收获，在15°C和25%相对湿度条件下储存12个月后使用。种子经75%乙醇浸泡1分钟和0.1%次氯酸钠浸泡5分钟的连续表面消毒，随后用无菌ddH?O漂洗五次，去除表面微生物污染。

透析袋（3.5 kDa，77 mm）购自源叶生物技术（上海，中国）。SurePAGE?预制胶（12%和…

### 通过原生PAGE胶内活性染色分离天然SOD同工酶

原生PAGE结合NBT阴性染色允许在非变性条件下视觉区分催化活性SOD同工酶，保留天然寡聚组装体以及Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD亚族特征性的差异抑制剂敏感性[32,38]。在三个独立生物学重复的酶谱图中始终观察到两条不同的活性条带——迁移较慢的B1和迁移较快的B2（图1A），确认了…

## 结论

本研究建立了一套经济高效的活性导向流程，整合原生PAGE NBT酶谱染色、低温透析袋电洗脱和DIA定量蛋白质组学，解锁了成熟花生种子（MPSs）的隐蔽抗氧化蛋白质组。鉴于单个凝胶条带的蛋白产量有限以及质谱的高成本，将三个一致性生物学重复（经图1中相同的SOD条带模式验证）的等体积样品合并进行电泳、洗脱和…

## CRediT作者贡献声明

魏子浩：初稿撰写、可视化、软件、调查研究、数据管理。黄峰：初稿撰写、方法学、调查研究。王宇：软件、方法学、调查研究。孙宇强：初稿撰写、监督指导、形式分析。李王峰：监督指导、资源、项目管理、资金获取。郭万里：审阅与编辑、监督指导、方法学、形式分析、概念设计。

## 专利信息

本研究开发的核心技术已提交中国专利申请（专利号：CN202510921196.6）。专利申请所涵盖的专有技术细节未在本手稿中完全披露，将在已公布的专利文件中描述。

## 利益冲突声明

作者声明研究是在不存在任何可能被理解为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

## 致谢

感谢北京华大基因科技有限公司（LC-Bio Technology Co., Ltd.）在质谱检测与生物信息学分析方面的协助。

魏子浩 | 黄峰 | 王宇 | 孙宇强 | 李王峰 | 郭万里

浙江科技大学生命科学与医学部生物技术学院分子生物工程实验室，杭州，浙江，中国，邮编310018