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蛋白激酶是一类调控细胞信号通路的重要酶类，其失调与癌症及神经退行性疾病等病理过程相关。尽管已有高性能的激酶活性荧光生物传感器，但光在组织中的穿透能力有限，导致在不透明组织中研究激酶功能与调控通路仍具挑战。为解决该限制，研究人员报道了一种激酶活性超声报告基因（U
蛋白激酶是一类调控细胞信号通路的重要酶类，其失调与癌症及神经退行性疾病等病理过程相关。尽管已有高性能的激酶活性荧光生物传感器，但光在组织中的穿透能力有限，导致在不透明组织中研究激酶功能与调控通路仍具挑战。为解决该限制，研究人员报道了一种激酶活性超声报告基因（Ultrasonic Reporter of Kinase Activity, UReKA），其通过改变气体囊泡（Gas Vesicle, GV，一类充满气体的蛋白纳米结构）的超声散射来检测蛋白激酶A（Protein Kinase A, PKA）活性。研究人员对GV壳层蛋白进行工程化改造以响应PKA，在纯化蛋白形式及哺乳动物细胞表达体系中证明了UReKA的功能，并展示其可在药物刺激或基因突变条件下监测PKA信号。该方法可在不透明介质中可视化细胞功能活动，在癌症生物学、细胞发育及药物发现中具广泛应用前景。
研究背景方面，蛋白激酶（Protein Kinase）通过磷酸化调控几乎所有细胞类型的广泛生物学过程，其信号异常与癌症、慢性炎症、糖尿病及神经系统疾病密切相关，因此是药物干预的重要靶点。传统蛋白激酶检测如磷蛋白质组学与放射性32P技术需裂解细胞，无法实时观察动态磷酸化事件；基于荧光、发光、F?rster共振能量转移及荧光寿命成像的遗传编码传感器虽提升活细胞时空分辨率，但光散射使光学手段在不透明样本中受限；磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）激酶报告基因虽穿透更深，但未在细胞内表达，也未证明胞内酶活性传感。超声可穿透厘米级不透明组织并维持约100 μm空间与约1 ms时间分辨率，气体囊泡（Gas Vesicle, GV）源自浮游微生物的充气蛋白纳米结构，可作为声学报告基因（Acoustic Reporter Gene, ARG）及蛋白酶、钙生物传感器，其声学特性由GV壳表面蛋白GvpC调控。因此，研究人员开展激酶活性超声报告基因UReKA研究，以PKA为模型靶标，实现不透明介质中胞内激酶活性的动态非侵入监测。
主要关键技术方法包括：以三重复GvpC（3R-GvpC）为骨架，将A激酶活性报告因子（A Kinase Activity Reporter, AKAR）底物序列插入不同位点构建突变库；采用加压吸光度光谱测定GV崩解压力；用Phos-tag SDS-PAGE与液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）验证磷酸化位点；通过浮力纯化（Buoyancy Purification, BP）分离GV结合与游离GvpC以解析机制；在HEK293T细胞中用双质粒系统表达GV结构操纵子与UReKA修饰gvpC，并以内部核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site, IRES）调控GvpA与GvpC计量比；使用交叉振幅调制（cross-Amplitude Modulation, xAM）非线性超声成像读取声学信号；药理学上以福斯高林（Forskolin, FSK）/IBMX激活、H89抑制内源PKA，遗传学上共表达PRKACA构成型活性催化亚基。
研究结果如下。UReKA设计与鉴定：研究人员将AKAR底物序列LRRATLVD插入3R-GvpC第二重复区56至81位，筛选发现第60位与81位苏氨酸突变体（UReKA1、UReKA2）在PKA处理后非线性超声信号增强最大；UReKA1在350 kPa下PKA处理信号增4.5倍，λ蛋白磷酸酶（Lambda Protein Phosphatase, LPP）可逆转，UReKA2在489 kPa下增12.9倍；苏氨酸突变为丙氨酸敲除（Knockout, KO）消除响应；加压吸光度显示磷酸化使崩解压力下降，LPP恢复；体外面板中PKG、PKCβ、PKCδ、CaMKII等激酶的激活远弱于PKA，说明对PKA优先响应。
纯化GV中UReKA表征：Phos-tag凝胶与LC-MS/MS确认UReKA1仅Thr60被PKA磷酸化；ATP滴定显示信号随磷酸化分数单调上升，EC??为156 μM，低于生理ATP约3 mM；磷酸化程度与声学信号近似线性，证明UReKA对比度随磷酸化状态连续可调。
分子机制与动力学表征：时间曲线显示磷酸化在2至3小时已完成，但非线性信号8至12小时才达峰，说明限速步为磷酸化后GvpC与GV壳解离/重连而非酶促磷酸化本身；BP实验表明磷酸化GvpC从GV表面脱离是主导机制；提出两步模型，即PKA磷酸化引入负电荷削弱静电作用促脱离呈声学“开”，LPP去磷酸化使GvpC重回壳面呈声学“关”。
细胞内UReKA响应：HEK293T中筛选IRESv10使GvpA/GvpC计量最优；FSK/IBMX激活内源PKA或共表达PKA-CαL206R均使xAM信号比对照高5至10 dB，H89抑制回基线；PMA可致响应但可能被H89阻断，提示间接激活PKA通路；CCK-8显示72小时表达与刺激不显著损活力；当前细胞实验为长时间刺激后终点读取，反映积累磷酸化状态而非瞬时激酶活性。
结论部分翻译如下：本研究中，研究人员提出UReKA作为激酶活性的声学生物传感器。利用纯化重组GV，研究人员证明UReKA可特异性响应靶激酶在工程位点的磷酸化，且该修饰可逆改变GV的非线性声学对比度。研究人员还确认所观察到的非线性信号激活由GvpC从GV表面的脱离驱动，类似于超声钙报告基因（Ultrasonic Reporter of Calcium, URoC）系统。此外，研究人员表明在哺乳动物细胞表达的UReKA可有效检测胞内PKA活性，并随药理刺激或遗传改造下的激酶激活或抑制出现信号升高或降低。这些结果奠定了定量、可逆激酶超声报告系统的基础。
在细胞中的上述应用提示UReKA未来可用于药物筛选尤其是激酶抑制剂，以及活体动物癌症与神经研究中的激酶活性成像；相较荧光与正电子发射断层扫描（Positron Emission Tomography, PET）报告基因，UReKA声学读出未来可实现深层组织成像与实时分子监测。当前UReKA更适合作为终点或时间积分报告基因，因磷酸化快于声学响应建立，细胞解离、浓度匹配与琼脂糖包埋耗时约1至2小时，故适于持续扰动与药物反应分析，而不适于秒至分钟级瞬态信号。未来需加速磷酸化与GV机械耦合、拓展PKC、Akt、受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase, RTK）等靶标、在类器官与活体模型验证，并将细胞声学输出通过归一化与正交生化测量校准为绝对激酶活性。
