微量元素混合物与膀胱癌发生之间的关系

《Environmental Epidemiology》：Associations between a mixture of trace elements and bladder cancer occurrence

　　背景：微量元素与膀胱癌风险之间的关联尚未被充分了解。个体通常同时暴露于多种微量元素中，例如通过水污染或饮食。虽然之前的研究探讨了单个元素与膀胱癌之间的关联，但关于这些元素的整体或联合效应的研究仍然有限。

方法：我们利用新英格兰膀胱癌研究（一项基于人群的匹配病例对照研究）来估计12种微量元素混合物与膀胱癌之间的关联。从979例病例和1232例对照组中收集了趾甲样本，并分析了其中的12种微量元素。通过基于分位数的g-计算方法，我们评估了这些微量元素混合物与膀胱癌风险之间的关联。

结果：在调整了匹配因素（如年龄、性别和州）以及其他潜在混杂因素（如吸烟习惯和高风险职业）后，我们估计出微量元素混合物与膀胱癌之间存在负相关（比值比：0.78，95%置信区间：0.66, 0.93）。在进一步调整了吸烟、高风险职业和饮食因素后，结果相对保持不变。我们研究了砷的逆向因果关系的间接证据，发现膀胱癌的诊断可能导致短期内行为的变化，这会影响趾甲样本中砷及其他元素的浓度。

本研究补充的内容：我们的发现表明，微量元素与膀胱癌风险降低之间的关联可能部分可以由逆向因果关系解释。我们提出了一种在匹配病例对照研究中评估这种情况的方法。

引言：自20世纪50年代以来，新英格兰地区的膀胱癌死亡率一直较高。早期研究发现环境和职业暴露可能是导致这种高死亡率的原因。之前关于单个元素的研究主要关注暴露途径，包括职业暴露、饮食、受污染的水、吸烟以及靠近污染场所等因素。在不同的环境暴露中，微量元素因其普遍性和潜在的致癌性而成为研究的重点对象。微量元素包括某些金属和类金属，定义为含量低于百万分之一的元素。其中一些元素被认为是必需的，因为它们对人体生物化学和生理功能至关重要，例如在DNA构建和激素调节过程中。然而，这些元素的外部暴露水平超出推荐范围可能会成为许多疾病（包括癌症）的致病因素。其他元素则被认为是非必需的或具有致癌性的，例如砷（As）。

膀胱癌的流行病学研究主要集中在单个元素与膀胱癌之间的关联上。特别是砷已被证实是膀胱癌的致癌物。在新英格兰地区，井水中含有低至中等水平的砷，观察到了膀胱癌发病风险的增加。其他研究表明，某些元素与膀胱癌之间存在正相关关系。一些研究还探讨了趾甲中的微量元素与膀胱癌风险的关系，在一项队列研究中发现硒与膀胱癌之间存在负相关，但在病例对照研究中结果并不一致。然而，仅关注单个元素的分析可能会低估其更广泛的健康影响，因为它们没有考虑到微量元素作为混合物的共同来源或暴露途径。将微量元素作为共同暴露的混合物来分析更能反映真实的暴露情况，从而为人群层面的干预措施提供更准确的信息。此前关于微量元素混合物与膀胱癌关联的研究较少。李等人使用了新罕布什尔膀胱癌研究（新英格兰膀胱癌研究[NEBCS]的一个子集）来研究趾甲中的砷、锌、钒、锰、镍、镉、硒、铝、铬、铁、铜和铅等元素的混合物与膀胱癌风险之间的关联，但他们发现的总体效应并不显著。

在这项研究中，我们评估了新英格兰膀胱癌研究中趾甲中的微量元素混合物与膀胱癌风险之间的关联。在病例确诊时或招募对照组时收集生物学样本的病例对照研究中，暴露评估与疾病发生的时间顺序是相反的，如果暴露情况不能代表从健康组织发展到癌症之前的早期暴露情况，可能会导致偏见。因此，我们还使用问卷调查和尿液样本的额外数据来探讨逆向因果关系的可能性。

新英格兰膀胱癌研究：NEBCS是一项在美国缅因州、新罕布什尔州和佛蒙特州进行的基于人群的匹配病例对照研究。病例均为30-79岁的个体，他们在2001年9月1日至2004年10月31日（缅因州和佛蒙特州）或2002年1月1日至2004年7月31日（新罕布什尔州）期间被诊断为组织学确诊的膀胱癌患者，并且居住在这些州。病例来自医院病理科和医院及州的癌症登记系统。共有665例病例由于拒绝参与（50%）、死亡（22%）、病情过重（12%）、不会说流利英语（5.5%）、医生拒绝参与（5%）或无法找到（5%）而未能纳入研究。对照组个体年龄在30-64岁之间，是从新罕布什尔州、佛蒙特州和缅因州的车辆管理局（DMV）随机选取的。65-79岁的对照组个体则从医疗保险和医疗补助服务中心（CMS）的受益人记录中选取。在联系到的DMV和CMS参与者中，有65%的人参与了研究；病例组也有65%的人参与了研究。对照组根据诊断时的状态、性别和参考年龄在5年内与病例进行了频率匹配。对照组在2002年至2005年间接受了访谈，如果他们拒绝参与（DMV组70%、CMS组65%）、无法找到（DMV组24%、CMS组11%）、不会说流利英语（DMV组3%、CMS组10%）、病情过重无法参与（DMV组1%、CMS组7%）或已经死亡（DMV组1%、CMS组7%），则被排除在外。所有接受访谈的参与者都被要求提供趾甲样本（响应率：病例组96.2%、对照组97.2%）。所有参与者都提供了书面的知情同意书。该研究得到了美国国家癌症研究所、美国地质调查局、达特茅斯大学盖塞尔医学院以及缅因州、新罕布什尔州和佛蒙特州卫生部门的批准。

共有2631名参与者完成了计算机辅助的个人访谈并符合最终的研究资格标准（病例组1213人（65%；总共1878例）；对照组1418人（65%；总共2190例）。在排除20例因无膀胱癌证据而被排除的参与者后，最终得到1193例病例。我们还排除了321名参与者，因为他们报告了趾甲采集问题、在癌症诊断或登记前采集了趾甲样本、属于非尿路上皮癌病例，或在参考日期（病例诊断日期和对照组选择日期）前30天内服用了细胞毒性药物。另外还有46名参与者因趾甲微量元素测量数据缺失而被排除。最后，有33名参与者因吸烟状况或吸烟持续时间未知、高风险职业状况未知（根据Colt等人的定义，具有性别特定的比值比（OR）>1.5且根据1980年标准职业分类和1987年标准工业分类方案有10人以上雇员）或体重指数（BMI）缺失而被排除。最终得到979例病例和1232名对照组参与者（共2211人）。分析样本的描述性统计数据显示在表1中。趾甲样本是在面对面访谈时提供的。病例组从诊断/登记到趾甲采集的中位时间为179天，对照组为198天（见图S1；https://links.lww.com/EE/A465）。

表1. 新英格兰膀胱癌研究参与者的基线特征，N = 2211

| 变量 | 对照组 | 病例组 |
|----------|------------|------------|
| 锌（Zn） | 117.45 (53.62) | 115.55 (59.46) |
| 硅（Se） | 0.94 (0.32) | 0.93 (0.42) |
| 镉（Cd） | 0.03 (0.07) | 0.03 (0.05) |
| 铅（Pb） | 0.71 (3.50) | 0.66 (3.49) |
| 维生素B12（mg/kcal） | 2.52 (0.96) | 2.47 (0.96) |
| 金枪鱼（g/kcal） | 2.88 (3.60) | 2.93 (3.94) |
| 生菜/绿叶蔬菜（g/kcal） | 6.34 (6.78) | 5.62 (6.79) |
| 菠菜/绿叶蔬菜（g/kcal） | 0.55 (2.17) | 0.38 (1.19) |
| 红肉（g/kcal） | 33.29 (17.31) | 34.68 (17.15) |
| 白肉（g/kcal） | 29.20 (21.72) | 26.81 (22.01) |
| 加工肉类（g/kcal） | 11.32 (9.38) | 11.71 (8.67) |
| 加工红肉（g/kcal） | 8.35 (7.29) | 8.84 (6.76) |
| 加工白肉（g/kcal） | 3.04 (5.44) | 2.93 (4.32) |
| 其他鱼类（非金枪鱼，g/kcal） | 5.14 (6.05) | 4.74 (6.15) |
| 水果（g/kcal） | 137.93 (102.54) | 129.78 (109.16) |
| 蔬菜（g/kcal） | 126.37 (62.65) | 126.92 (74.13) |
| 总水摄入量（L/天，按年龄调整）| 1.76 (1.06) | 1.96 (1.23) |

图表1. 用于创建最终分析样本的排除标准流程图。

实验室分析和趾甲制备的详细信息已在先前的研究中描述。趾甲样本中测量了铝、砷、镉、铅、钒、铬、铜、铁、锰、镍、硒和锌等微量元素。使用电感耦合等离子体质谱法测量了趾甲样本中微量元素的浓度；趾甲样本处理的详细信息也已在其他地方描述。

首先，我们使用多变量逻辑回归分析了单个微量元素与膀胱癌之间的关联，调整了下文提到的协变量，但没有调整其他微量元素。为了处理数据偏斜和限制异常值的影响，首先对微量元素进行了自然对数转换，然后根据每个对照组的四分位数范围（IQR）进行了标准化。对于浓度值为0（未检测到）的情况，我们用非缺失值的第一四分位数进行插值，并除以√(2)以便进行自然对数转换。最后，我们根据四分位数对每种元素进行分类，并将其作为独立的指标进行分析。各元素的摘要统计数据显示在表2中，四分位数切割点显示在表S2中（见链接：https://links.lww.com/EE/A465）。

表2. 新英格兰膀胱癌研究中趾甲中测量的单个微量元素的百分位数（第25、50、75百分位）、平均浓度（μg/g）和零值百分比（按病例/对照组状态划分）

通过有向无环图（见链接：https://links.lww.com/EE/A465），我们确定了最低限度的混杂因素，包括吸烟状况/持续时间（分类变量：非吸烟者[参考值]、当前吸烟者≤42年、当前吸烟者>42年、 former smoker ≤ 23年、former smoker > 23年）、高风险职业状况（是/否[参考值]）和BMI（连续变量，使用四分位数处的限制性三次样条函数建模）。非吸烟者定义为一生中吸烟量少于100支烟的个体，而偶尔吸烟者虽然总共吸烟超过100支，但不规律吸烟（至少每天吸烟一次，持续至少6个月）。高风险职业包括机械师、精密金属工人、军事人员、车辆维修技师以及从事金属加工工作的人员等。BMI（kg/m2）是根据入组时的身高和体重计算得出的。我们调整了频率匹配的因素：州份（缅因州[参考组]、新罕布什尔州和佛蒙特州）、性别（女性、男性[参考组]）以及参考年龄组（<55岁[参考组]、55-64岁、65-74岁和75岁以上）。总体关联方面，所有12种微量元素都属于一个标准检测组，由于它们主要通过饮食、地下水和吸烟进入人体，因此被认为是该混合物的组成部分。混合物中的多种元素也表现出高度相关性，这可能导致点估计不稳定、方差增大以及评估个体和综合调整效应时的统计功效降低。基于这些原因，我们使用基于分位数的g计算方法估计了所有12种必需和非必需微量元素同时增加一个分位数的联合效应。我们采用了带有logit链接的广义线性模型来模拟成为病例的概率，并同时调整了匹配因素和混杂变量。该方法的更多细节在补充材料中。我们还尝试使用带有probit链接的贝叶斯核机器回归来估计总体效应，但由于数值算法的问题而未能成功。为了评估个别微量元素的潜在非线性，我们将它们量化为四个分位数，并为每种微量元素的每个分位数估计了对数比值比（log OR），其中第一个分位数作为参考组。然后，我们将这些结果与基于分位数的g计算模型的线性系数估计进行了比较（图S3；https://links.lww.com/EE/A465）。

其他研究也发现饮食会影响体内微量元素的浓度，这表明饮食因素可能与膀胱癌的发生存在混淆作用。为了评估饮食的混淆作用，我们在研究入组时使用了自我 administered 的饮食历史问卷，同时收集了脚趾甲样本。与其它协变量相比，饮食测量数据的缺失率较高（约30%的分析样本），因此我们通过一系列敏感性分析（见补充材料；https://links.lww.com/EE/A465） empirically 评估了调整长期饮食作为混杂变量的利弊。

在利用生物标志物指标进行病例对照研究时，暴露与结果测量之间的时间顺序是一个值得关注的问题。临床前疾病过程或诊断后的行为变化可能会影响通过生物标志物测量的暴露矩阵或水平。我们假设膀胱癌的诊断可能会促使病例改变饮食和行为，从而影响诊断后生物样本（如脚趾甲）中的微量元素浓度，可能导致微量元素水平与膀胱癌风险之间出现意想不到的关联（图S4–S5；https://links.lww.com/EE/A465）。我们利用在同一时间点收集的随机尿样和24小时饮食/行为回忆数据来评估已知膀胱致癌物砷的潜在反向因果关系。我们专注于砷，因为入组时可以获取其具体种类水平，而且砷的饮食和行为来源已经得到了充分研究，同时摄入砷已被证实是膀胱致癌物，因此预期关联关系是已知的（不存在反向因果关系）。

在NEBCS研究中，最初有2316名参与者接受了随机尿样检测。应用资格标准后（图1），我们排除了255名在随机尿样收集过程中存在问题的参与者，以及另外8名任何砷值缺失的参与者，最终有1948名参与者参与了随机尿样分析（845例病例和1103名对照组）。随机尿样样本的处理使用了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法来确定砷的种类，相关方法之前已有描述。所有砷种类的检测限为0.1 μg/L，包括砷甜菜碱、无机亚砷酸盐（AsIII）、单甲基砷酸（MMA）、二甲砷酸（DMA）和无机砷酸盐（AsV）。质量控制使用了日本国立环境研究所提供的认证参考物质#18“人尿”。

作为脚趾甲中砷的预测因子，我们考虑了（1）DMA和（2）MMA，这两种物质的检测值均高于检测限；（3）DMA和MMA的总和（sumAS）。尽管检测到了两种无机砷（AsIII和AsV），但由于它们的检测比例较低（AsIII：29%；AsV：9%），且相对于其他砷化合物而言浓度较低，因此我们没有将无机砷纳入sumAs的计算中，因为其影响可以忽略不计。砷甜菜碱被排除在分析之外，因为先前的研究发现它与脚趾甲中砷的浓度呈负相关。

在主要分析中，考虑了长期饮食和行为对膀胱癌的影响。对于诊断后的饮食和行为，我们使用了在随机尿样收集时进行的24小时饮食回忆问卷，重点关注与无机砷（大米制品、自来水、葡萄酒）和有机砷（海鲜和贝类）的摄入相关的食物，以及吸烟等行为（表S1；https://links.lww.com/EE/A465）。我们使用多变量逻辑回归来评估病例和对照组在24小时饮食回忆中是否存在吸烟、食用鱼类、大米、葡萄酒、自来水或维生素C补充剂的差异。我们调整了匹配因素（州份、性别和参考年龄组）、吸烟状态/持续时间、高风险职业状态，以及诊断/入组日期与随机尿样收集日期之间的时间差（使用四个分位点的受限三次样条函数建模）。

利用24小时饮食回忆数据，我们研究了在随机尿样收集“前1天内”吸烟是否会在随机尿样中的砷浓度中被检测到。三个砷变量分别进行了自然对数转换并以对照组的IQR进行了标准化。肌酐也进行了自然对数转换并以对照组的肌酐IQR进行了标准化。我们调整了匹配因素（州份、性别和参考年龄组）、高风险职业状态、吸烟状态/持续时间、家庭水源、诊断/入组日期与随机尿样收集日期之间的时间差（连续型，样条函数），以及随机尿样中测量的（自然对数转换后的）肌酐（mmol/L）以解释尿液稀释的影响。该分析仅在对照组中进行，使用了线性回归模型。先前的研究表明吸烟与人类体内甲基化砷的能力降低有关。尿液中甲基化能力受损的一个指标是MMA与DMA的比值，在甲基化受损的情况下，MMA增加而DMA减少。因此，我们考虑了第四个指标，即MMA与DMA的比例，并按当前吸烟者与非当前吸烟者进行了分层。

在24小时饮食回忆数据的基础上，我们还探讨了在随机尿样收集“前1天内”饮用自来水（包括任何用自来水制成的饮料）是否与随机尿样中检测到的砷有关。我们使用了与上述相同的三种转换和标准化的砷化合物（sumAs、DMA和MMA）以及调整因子。

所有分析均使用R统计软件（版本4.5.1，R Core Team，R Foundation for Statistical Computing，维也纳，奥地利）中的qgcomp、rms、ggcorrplot、tableone和tidyverse包进行。

**结果**
**暴露因素**
个别微量元素的分析显示，Spearman相关性范围从0.8（钒和铁）到-0.04（镍和铁、锰）（图2）。平均浓度最高的是锌（病例：115.55 μg/g；对照组：117.45 μg/g），其次是铁（病例：27.08 μg/g；对照组：30.51 μg/g），最低的是钒（病例：0.02 μg/g；对照组：0.03 μg/g），其次是镉（病例：0.03 μg/g；对照组：0.03 μg/g）（表2）。
在未考虑其他微量元素的情况下，除了镍、硒和锌之外，所有元素均显示出负相关（表3，图S6；https://links.lww.com/EE/A465）。

**各分位数暴露与参考组第一分位数的比值比（95%置信区间）**
| 元素 | Q1 | Q2 | Q3 | Q4 |
|--------------|---------|---------|---------|---------|
| 铝（Al） | 0.91 (0.71, 1.18) | 0.80 (0.62, 1.03) | 0.60 (0.46, 0.77) |
| 砷（As） | 0.91 (0.71, 1.18) | 0.81 (0.63, 1.05) | 0.70 (0.54, 0.91) |
| 镉（Cd） | 0.81 (0.63, 1.04) | 0.74 (0.57, 0.95) | 0.75 (0.58, 0.97) |
| 铬（Cr） | 1.12 (0.87, 1.45) | 0.80 (0.62, 1.04) | 0.73 (0.57, 0.95) |
| 铜（Cu） | 0.92 (0.71, 1.19) | 0.89 (0.68, 1.16) | 0.73 (0.56, 0.95) |
| 铁（Fe） | 1.14 (0.88, 1.47) | 0.74 (0.57, 0.96) | 0.70 (0.54, 0.91) |
| 锰（Mn） | 0.74 (0.57, 0.96) | 0.69 (0.54, 0.90) | 0.61 (0.47, 0.80) |
| 镍（Ni） | 0.99 (0.77, 1.28) | 0.97 (0.75, 1.25) | 1.11 (0.86, 1.44) |
| 铅（Pb） | 0.86 (0.67, 1.11) | 0.72 (0.56, 0.93) | 0.74 (0.57, 0.95) |
| 硒（Se） | 0.91 (0.70, 1.17) | 0.83 (0.64, 1.08) | 1.00 (0.77, 1.31) |
| 钒（V） | 0.94 (0.73, 1.21) | 0.77 (0.60, 0.99) | 0.60 (0.47, 0.78) |
| 锌（Zn） | 1.00 (0.77, 1.29) | 1.01 (0.78, 1.31) | 1.00 (0.77, 1.29) |

在分析个别微量元素时（未考虑其他微量元素的影响），除镍、硒和锌外，所有元素均显示出负相关（表3，图S6；https://links.lww.com/EE/A465）。

**总体关联**
与个别微量元素的分析类似，我们发现12种微量元素的混合物与膀胱癌之间存在负相关（每增加一个分位数的比值比为0.78，95%置信区间[CI]：0.66, 0.93）（表4）。所有元素的加权系数均为负值，除了镍和锌（图S7；https://links.lww.com/EE/A465）。当将样本范围限制在饮食信息完整的情况下，效应估计没有显著变化（比值比：0.80，95%置信区间：0.65, 0.98）（图S8；https://links.lww.com/EE/A465）。在调整了常规饮食后，效应估计也没有变化（比值比：0.80，95%置信区间：0.65, 0.98；图S9；https://links.lww.com/EE/A465）。

**全元素与膀胱癌的关联（分位数g计算）**
模型结果显示，所有元素的比值比为0.78（95%置信区间：0.66, 0.93）。a表示分析样本中所有元素的影响（N = 2,211；979例病例，1,232例对照组）。调整因素包括匹配因素（州份、性别和参考年龄组）和混杂变量（吸烟状态/持续时间、高风险职业状态和BMI）。b表示在饮食信息完整的子样本中的影响（N = 1,586；697例病例，889例对照组）。c表示在进一步调整饮食变量后的影响（N = 1,586；697例病例，889例对照组）。所有饮食变量包括金枪鱼（克/天）、生菠菜/绿叶蔬菜（克/天）、煮熟的菠菜/绿叶蔬菜（克/天）、红肉（克/天）、白肉（克/天）、加工红肉（克/天）、加工白肉（克/天）、其他鱼类（克/天）、水果（克/天）和总饮水量（升/天，按年龄调整）；所有饮食变量均使用营养密度模型进行了调整。

**潜在的反向因果关系**
24小时饮食回忆的描述性统计数据显示，病例组和对照组之间的随机尿样中砷的（未转换的）中位浓度相似（表S3；https://links.lww.com/EE/A465）。砷是唯一在脚趾甲和尿液样本中都可检测到的微量元素。随机尿样中的MMA和DMA与脚趾甲中砷的皮尔逊相关性与先前的研究结果一致（MMA：0.26；DMA：0.21）。关于sumAs（排除无机砷比较）的相关性在文献中未找到（表S3；https://links.lww.com/EE/A465）。图S10–S12展示了按病例/对照组状态划分的24小时饮食回忆中（自然对数转换后的）sumAs、DMA和DMA的平均值和标准差。

**诊断后与砷相关食物和行为与膀胱癌的关联**
与对照组相比，病例组在过去24小时内报告吸烟的可能性低58%（比值比：0.42，95%置信区间：0.25, 0.69）（表5）。这与长期吸烟和当前吸烟在总体关联分析中的结果相反，后者与膀胱癌呈正相关。在报告24小时饮食/行为回忆中吸烟的参与者中，98.2%的人表示自己是当前吸烟者。仅在当前吸烟者中，与对照组相比，他们报告在过去的24小时内吸烟的可能性较低（OR：0.38，95% CI：0.22，0.63）。此外，报告饮用过自来水的人比例高出45%（OR：1.45，95% CI：1.02，2.07）。我们在鱼类、大米、葡萄酒或维生素C补充剂摄入量方面未发现案例组和对照组之间存在显著差异（表5）。

膀胱癌与短期饮食/行为之间的关联：
(A) 膀胱癌 -> 饮食/行为
24小时饮食回忆
OR（95% CI）
吸烟 0.42（0.25，0.69）
仅限当前吸烟者（N = 430） 0.38（0.22，0.63）
任何鱼类摄入 0.93（0.75，1.13）
任何大米摄入 1.08（0.83，1.40）
任何葡萄酒摄入 0.87（0.64，1.17）
任何自来水摄入 1.45（1.02，2.07）
任何维生素C补充剂摄入 0.98（0.75，1.27）

所有逻辑回归模型还调整了匹配因素（州、性别和参考年龄组）、吸烟状态/持续时间、高风险职业状态以及参考日期（诊断或选择）与当场尿液收集日期之间的时间差异（使用四分位点的限制立方样条函数进行建模）。

鉴于病例在诊断后的短期行为变化，我们评估了吸烟是否会在尿液中的砷含量上体现出来。我们发现，在24小时饮食回忆中吸烟的人，其尿液中总砷（sumAs）和二甲基砷（DMA）的水平较低（几何平均比率分别为0.72 [95% CI: 0.57, 0.91] 和 0.70 [95% CI: 0.55, 0.89]），而与未吸烟者相比。在报告自己是当前吸烟者的患者中，过去24小时内吸烟与较高的二甲基砷：DMA比率（GM比率：1.73，95% CI: 1.20, 2.49）相关；而在报告是前吸烟者或从未吸烟者的人群中，这种关联不显著（GM比率：1.12，95% CI: 0.49, 2.58）。吸烟与其他因素的关联详见表6。

由于我们在病例组观察到短期行为变化，我们进一步探讨了短期吸烟行为与尿液中砷含量的关系。在对照组（N = 1,103）中，24小时饮食回忆中吸烟与尿液中砷浓度（包括总砷（sumAs）、二甲基砷（DMA）和甲基砷（MMA）的浓度之间存在关联。在仅限当前吸烟者的对照组（N = 160）中，24小时饮食回忆中吸烟与尿液中砷浓度的关系也呈负相关。

**讨论：**
我们研究了新英格兰地区一项匹配的病例对照研究中，趾甲中测量的微量元素混合物（包括重金属和类金属）与膀胱癌风险之间的关联。我们发现，即使在调整了入组前的典型饮食措施后，这些微量元素混合物及其大部分单个元素（包括砷）与膀胱癌风险呈负相关。我们计算出砷的E值为2.21，其大小与第一级家族史（2.72）作为风险因素相当。这进一步支持了这些关联并非由未测量的混杂因素造成的观点，因为如果存在其他未测量的混杂因素，它们也应该在其他微量元素上也有所体现。此外，这样的混杂因素需要与最近的暴露事件密切相关，而与累积环境暴露无关。根据文献，我们预计至少会发现某些微量元素（特别是砷）与膀胱癌风险之间存在正相关。然而，个体元素和混合物分析中持续的负相关结果有些反直觉，尽管与一些先前的研究结果一致。我们怀疑逆向因果关系可能解释了这些结果，因为趾甲样本是在病例确认后收集的。我们利用额外的尿液砷生物标志物数据间接评估了逆向因果关系的可能性。

我们发现，诊断后的短期行为变化与砷生物标志物水平相关，这支持了逆向因果关系可能影响主要研究结果的观点。首先，即使在当前吸烟者中，病例组也更可能报告在过去24小时内没有吸烟，这表明他们更有可能停止或减少了吸烟。其次，过去24小时内吸烟与尿液中砷浓度的显著变化相关，表明近期吸烟直接影响了短期内的砷生物标志物水平。吸烟行为的变化可能通过两种方式影响趾甲中的砷水平：要么作为砷暴露的来源，要么通过当前吸烟对甲基化能力的影响来改变角蛋白中的沉积。在当前吸烟者中，病例组的吸烟减少（以及随之而来的甲基化改善）与趾甲中较低的砷水平一致，尽管尚不清楚吸烟相关的甲基化差异是否可以解释其他元素的结果。除了吸烟外，病例组的自来水摄入量也较高，并且与尿液中砷浓度呈正相关，但我们无法确定饮食历史问卷中的饮水问题与24小时回忆数据中的问题是否具有可比性。在事后敏感性分析中，意识到饮用水中砷健康风险的对照组更有可能报告使用私人井水作为主要水源（OR：1.03，95% CI：1.71）。相比之下，在病例组中，对砷的意识与使用私人井水作为主要水源呈弱负相关。

由于病例组的自来水摄入量高于对照组，我们探讨了尿液中砷含量是否与过去24小时内报告的自来水摄入量相关。我们发现，在对照组中，所有三种砷都与任何形式的自来水摄入呈正相关，GM比率分别为MMA（1.17 [95% CI: 1.02, 1.34] 和 sumAs（1.21 [95% CI: 1.05, 1.39]）。

尽管我们的数据主要来源于诊断后的趾甲样本，这可能导致测量误差，并且由于饮食/行为的变化可能受到膀胱癌诊断的影响，但我们仍能够分析这些关联。由于趾甲样本仅在一个时间点收集，我们无法纵向评估微量元素浓度。由于没有随访数据，我们也无法排除手术干预的可能影响，但考虑到趾甲作为生物样本的长期性质（3-18个月），以及大多数病例在入组后6个月内采集了趾甲样本，我们认为这些影响很小。虽然我们发现病例组报告在过去24小时内吸烟的可能性较低，同时更可能报告饮用过自来水，但我们没有发现其他特定饮食差异的证据。在敏感性分析中，意识到饮用水中砷健康风险的对照组更有可能报告使用私人井水作为主要水源。然而，病例组对砷的意识与使用私人井水作为主要水源呈弱负相关。

我们的研究的局限性在于，我们主要使用的微量元素测量来源是诊断后的趾甲样本。因此，这些样本不仅容易受到测量误差的影响，还可能受到膀胱癌诊断后饮食/行为变化的影响。由于趾甲样本是在一个时间点收集的，我们无法纵向评估微量元素浓度。由于没有随访数据，我们也无法排除手术干预的影响。尽管如此，我们发现病例组的吸烟减少（以及由此带来的甲基化改善）与趾甲中较低的砷水平一致。关于这种影响的预期方向，我们的数据存在矛盾的结果。在充分考虑了其他解释后，我们的发现支持逆向因果关系的可能性，但并未完全解释趾甲中微量元素与膀胱癌之间的负相关现象。未来的研究可以通过收集与趾甲水平相关的饮食和行为数据来进一步验证这些发现。

我们的研究有几个优点。首先，尽管我们的效应方向与Li等人的研究相同，但样本量更大，并且调整了一整套混杂因素。其次，我们利用了丰富的NEBCS数据，通过24小时饮食和行为访谈以及诊断后收集的尿液砷浓度来探讨逆向因果关系的可能性。第三，我们验证了先前关于曾经吸烟者与膀胱癌之间存在负相关性的研究结果，而从未吸烟者则没有这种相关性（表S11；https://links.lww.com/EE/A465）。72 我们发现，在诊断后，这些病例在饮食和行为上发生了变化，他们接触到的微量元素减少了，这与我们意外得出的主要发现——即微量元素与膀胱癌之间存在负相关性——是一致的。我们的研究估计了多种微量元素与膀胱癌风险之间的负相关性。我们有合理的证据表明，这种相关性至少部分可能是由于反向因果关系造成的。尽管混合物分析可以回答有关砷及多种微量元素的关键问题，但混合物测量数据通常仅基于有限时间范围内的生物标志物数据得出，而且由于其多因素性质，系统地评估所有成分可能存在的偏差颇具挑战性。我们的分析支持在病例对照研究中，仔细考虑生物标志物暴露时间与健康结果之间的因果关系。

致谢
我们感谢Anne Taylor（Information Management Services, Inc.）提供的数据支持。

利益冲突
作者声明与本报告的内容无关任何利益冲突。