双酚A通过细胞凋亡、白化和炎症应激重塑棕色脂肪组织

《Journal of Hazardous Materials》：Bisphenol A Remodels Brown Adipose Tissue via Apoptosis, Whitening, and Inflammatory Stress

　　

# 摘要

双酚A（BPA）暴露可能对棕色脂肪组织（BAT）尤其有害，因其具有独特的细胞组成、终身的产热功能，且BPA在其中的富集程度高于白色脂肪组织，然而BPA影响BAT的机制尚不清楚。在本研究中，雄性小鼠暴露于BPA六周后，肩胛间脂肪组织储库发生重塑，表现为BAT质量减少、白色脂肪组织增多，但对整体脂肪储库重量的影响极小。BAT的减少主要归因于细胞凋亡增加和棕色脂肪细胞的白化，其特征包括细胞体积增大、核密度降低、每细胞线粒体DNA含量减少以及脂肪生成标志物表达升高，这些因素共同导致细胞数量减少。此外，BPA诱导了细胞毒性效应，表现为NF-κB介导的炎症、过氧化物酶体β-氧化诱导的氧化应激，以及通过凋亡和自噬导致的细胞死亡，这些均促进了BAT重塑。这些发现揭示了BPA通过白化、肥大和细胞丢失诱导BAT重塑的关键机制，并强调了开展转化研究的必要性，以便更好地理解BPA在人类中的脂肪毒性。

## 1. 引言

脂肪组织是机体的重要组成部分，通过储存密集的脂肪酸来调控能量储存、体温调节、免疫应答、激素平衡和组织修复，从而协调全身能量稳态[63]。在哺乳动物中，脂肪组织主要以两种形式存在：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）[18]。WAT是机体主要的能量储存库，为内部器官提供保温和机械保护作用[13]、[81]。相比之下，BAT通过激活解偶联蛋白1（UCP1）将能量以热的形式散发，尤其在应对寒冷暴露时表现突出。BAT的激活具有重大的代谢意义，可提高胰岛素敏感性并降低体重增加的易感性[3]、[50]。BAT在包括啮齿动物和冬眠物种在内的某些哺乳动物中普遍存在，也可在新出生和成年人类中发现[32]、[47]。其在促进健康代谢方面的作用已得到充分证实[22]、[83]；BAT活性降低与肥胖和2型糖尿病等代谢障碍相关，而BAT激活则与体重减轻相关[12]、[61]，凸显了其在代谢综合征中的治疗潜力[27]。与白色脂肪细胞不同，棕色脂肪细胞含有高密度的线粒体，使其能够高效氧化脂质并产热[72]。尽管BAT在代谢调节中发挥着关键作用[37]、[79]，但其功能障碍和重塑的细胞及分子机制仍知之甚少[42]。值得注意的是，棕色脂肪细胞具有在寒冷暴露和激素刺激下的高增殖能力，以满足增加的代谢需求[64]。然而，这种增殖特性也使它们易受细胞毒性损伤，从而损害产热和能量消耗，促成代谢障碍[17]。

双酚A（BPA）是一种普遍存在的内分泌干扰化学物质，常用于生产聚碳酸酯塑料和包装材料，因其对代谢健康[1]、[9]、男性生殖功能及免疫系统紊乱[40]的潜在不良影响而引起了广泛关注。尽管BPA在体内迅速代谢和排出，但因其脂溶性，部分BPA优先在脂肪组织中蓄积[31]。人类广泛暴露于BPA，主要通过摄入，也可通过皮肤接触和吸入，导致超过95%的个体体内可检测到BPA水平[7]、[16]、[58]，并与癌症、代谢障碍和生殖异常等多种健康问题相关[76]。虽然早期研究主要关注BPA对WAT功能障碍和肥胖的影响[56]，但新兴证据表明BPA也可能扰乱BAT功能。例如，BPA优先蓄积于雌性大鼠的BAT中，其浓度超过血液、大脑或WAT中的水平[54]。此外，作为类雌激素，产前和哺乳期BPA暴露诱导后代发育的性别二态性效应[75]。雌性后代表现为BAT质量增加和UCP1表达升高，而雄性后代则表现为BAT功能障碍，凸显了雄性对BPA诱导的代谢紊乱更大的易感性，并强调了BPA在维持整体健康和体重调节中代谢反应的性别特异性差异。据此，我们聚焦于雄性小鼠，以进一步阐明BPA诱导BAT功能障碍的机制，因为雄性是更易感的性别。

尽管对BPA在WAT中代谢功能障碍的影响已有广泛研究，但我们对BPA诱导棕色脂肪细胞损伤的分子和细胞机制的理解仍存在相当大的空白。此外，BPA是否引发棕色脂肪细胞死亡尚未经过研究。为填补这一空白，我们使用最低观察有害作用水平（LOAEL）50 mg/kg体重/天，在雄性小鼠中暴露六周，研究了BPA对BAT的影响。本研究专门评估了BPA对BAT的影响，考察了脂肪组织的表型改变，并评估了参与脂质代谢和脂肪细胞分化的基因表达。我们的研究重点关注了BPA在BAT中诱导的炎症、氧化应激、凋亡和自噬，以及细胞存活通路中关键信号分子的变化。这些发现为BPA对BAT的细胞毒性效应提供了机制洞察，并强调了BPA对代谢功能障碍的潜在贡献。

## 2. 材料与方法

### 2.1. 伦理声明、化学品和试剂

所有实验均按照韩国首尔中央大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南进行（IACUC编号：201800105），批准证书可按需提供。除另有说明外，实验中使用的所有化学品和试剂均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。BPA（图1A）用玉米油稀释至所需浓度进行给药。

**图1. 双酚A（BPA）暴露后体重和白色脂肪组织（WAT）表型的变化。** A. BPA的化学结构。B. BPA暴露的实验方案：4–5周龄雄性ICR小鼠经胃管给予BPA或玉米油（对照组[Con]），持续6周。C. BPA暴露后的体重（bw）变化（n = 12）。D, E. 腹股沟（iWAT）和附睾（eWAT）白色脂肪组织的重量和归一化重量（组织/体重）变化，分别对应（n = 12）。F. 用苏木精-伊红染色显示iWAT和eWAT脂肪细胞的代表性显微图像（比例尺 = 100 μm）（n = 6）。G. 三个脂肪组织切片中定义区域内的细胞面积（CSA）的图形呈现。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。组间显著差异用星号表示（??? P < 0.001，???? P < 0.0001）。

### 2.2. 实验动物

雄性CD-1小鼠（ICR）购自韩国忠清北道大韩生物链接公司（Daehan BioLink），4–5周龄时对应青春期开始阶段，饲养在控温动物设施中，温度为20–25°C，相对湿度50–60%，12小时光照-黑暗循环。小鼠自由饮用高压灭菌水并饲喂标准饲料（PicoLab Rodent Diet 20, 5L79；LabDiet，美国密苏里州圣路易斯），其中蛋白质、脂肪和碳水化合物分别占总热量的21.2%、14.8%和64.0%（补充图1）。经1周适应期后，动物被随机分配到对照组或BPA处理组（每组n = 20）。BPA组接受美国环境保护署定义的LOAEL剂量50 mg/kg体重/天，用玉米油口服给药，每周5天（周一至周五），持续6周[24]、[55]、[74]。对照组接受等体积玉米油。BPA剂量根据体重测量每日调整。6周治疗后，小鼠在相同饲养条件下稳定1周后采集组织。图1B展示了实验设计。

### 2.3. 脂肪组织采集

小鼠称重后，通过腹腔注射2,2,2-三溴乙醇（avertin）处死，如先前所述[59]。从肩胛间区域采集BAT（iBAT）[44]、[51]，从附睾（eWAT）和腹股沟（iWAT）区域采集WAT[53]。采集后对所有组织称重。为评估肩胛间脂肪储库白化程度，将整个储库解剖分离，根据解剖位置和宏观组织色泽进行iBAT和周围WAT的肉眼识别和分离。iBAT呈深棕色，而WAT为白色。经目视分离后，BAT和WAT组分分别称重。后续分析仅使用分离的BAT。动物和样本的选择或排除不以表型或分子反应的幅度或方向为依据。样本的预先分配仅为了在有限的BAT组织量中适当分配于不同的分析程序之间，并确保每项检测有足够的组织数量和品质。组织迅速冷冻于液氮中并储存于-80°C用于分子分析，或固定在4%多聚甲醛（P2031；Biosesang，韩国城南）中，然后转移至70%乙醇中进行组织学检查。

### 2.4. BAT组织学检查及脂肪细胞大小和核计数测量

每组五只动物的BAT用4%多聚甲醛固定并石蜡包埋。切片（5 μm厚）用苏木精-伊红染色，并使用Nikon成像软件NIS-Elements软件（Eclipse TS100；Nikon，日本东京）检查。脂肪细胞大小通过随机选取区域，使用ImageJ软件（版本1.8.0；美国国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）计算总面积除以脂肪细胞数量来测量。每组至少评估200个细胞。从同一切片上随机采集的显微图像用于量化核密度（核/mm2），然后比较对照组和处理组之间的差异。每个BAT储库中的总细胞数通过计算分析的组织学区域（590 × 590 × 5 μm）的核密度（每单位体积的核数）和组织密度（约1.05 mg/mm3）来估算，然后外推至每组的平均BAT组织质量。需要注意的是，这些估计值是近似值，不同切片间核大小的变异可能导致绝对细胞数量的高估。

### 2.5. 原代细胞分离、培养及BPA处理

从4–5日龄雄性ICR小鼠的iBAT中分离原代棕色前脂肪细胞。简要而言，将iBAT和周围WAT分离后，切成小块，在37°C下与1 mg/mL II型胶原酶（LS004176；Worthington Biochemical Corporation，美国新泽西州Lakewood）平行消化30分钟，每5分钟间歇涡旋。加入10%胎牛血清（FBS）（35-015-CV；Corning，美国纽约州Corning）终止酶消化，消化后的组织悬液通过70 μm细胞筛过滤。细胞悬液以600 × g离心6分钟，然后用氯化铵-氯化钾裂解缓冲液（A1049201；Gibco，美国纽约州Grand Island）孵育3分钟去除红细胞。所得细胞用PBS洗涤并通过离心收集。分离的原代iBAT来源细胞在DMEM/F12（LM002-04；Welgene，韩国庆尚）中培养，补充10% FBS、1× GlutaMAX?补充剂（35050061；Gibco）和1×抗生素-抗真菌剂（15240062；Gibco）；而WAT来源的细胞在DMEM（LM001-09；Welgene）中培养，补充10% FBS和1×抗生素-抗真菌剂。细胞在传代次数2代以内使用，约90%汇合度时传代，每2天更换一次培养液。

对于细胞活力、qRT-PCR和Western blot分析，细胞以每孔2 × 10?个细胞的密度接种于六孔板中，培养24小时。然后用含3% FBS的培养基进行6–12小时血清饥饿，再暴露于二甲基亚砜（DMSO；溶媒对照）（D2650）或指定浓度的BPA。对于原代细胞处理，将BPA溶于DMSO配制成1 M储备液，随后稀释配制为200、100、50、25、12.5和10 mM的工作液。TGF-β激活激酶1（TAK1）抑制剂5Z-7-氧代zeaenol（O9890）溶于DMSO配制，用于药理学抑制TAK1（NF-κB信号的上游调节因子）。为评估TAK1抑制对BPA诱导反应的影响，在BPA暴露前用5 nM 5Z-7-氧合泽烯醇预处理细胞2小时，并在整个BPA处理期间维持抑制剂存在于培养液中。对于qRT-PCR分析，BPA暴露时间为2小时，而用于细胞活力和蛋白分析的细胞暴露时间为24小时。

对于棕色脂肪细胞分化，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX；I5879）、地塞米松（D4902）、胰岛素（I5500）、罗格列酮（R2408）、吲哚美辛（I7378）和3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3；T2877）均配制为DMSO溶解的工作储备液。

简要而言，汇流的原代棕色前脂肪细胞先用地塞米松（1 μM）、IBMX（0.5 mM）、胰岛素（1 μg/mL）、罗格列酮（1 μM）、吲哚美辛（50 μM）和 T3（1 nM）处理2天，随后用胰岛素（1 μg/mL）和 T3（1 nM）再处理4天。在整个分化期间加入 DMSO（载体对照）或 BPA。为评估 5Z-7-氧代海菰醇在分化过程中的抑制作用，在 BPA 暴露前2小时用 5Z-7-氧代海菰醇（5 nM）预处理细胞，并在 BPA 处理全程维持抑制剂的培养基存在。2.6. 细胞活力测定细胞活力测定中，将原代棕色前脂肪细胞以每孔 2 × 10? 个细胞接种于96孔板，培养24小时。在抑制实验中，细胞在 BPA 处理前2小时用 5Z-7-氧代海菰醇（5 nM）预处理，并在 BPA 暴露期间维持抑制剂。BPA 处理24小时后，每孔加入 10 μL WST-8 溶液（QM1000；Biofact，大田，韩国），再孵育2小时。使用多模式酶标仪（Synergy H1；Agilent BioTek，威诺斯基，佛蒙特州，美国）在450 nm处测量吸光度。细胞活力按以下方式计算：BPA 处理组细胞测得吸光度 ÷ DMSO 处理组细胞测得吸光度 × 100。2.7. 定量 PCR冷冻的 iWAT 和 BAT 样本（每组 n = 10）在低 pH TRIzol 试剂（10296010；Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）中匀浆。对于原代棕色前脂肪细胞实验，细胞在 BPA 处理2小时后收集，用 TRIzol 试剂处理，LPS（10 μg/mL）作为阳性对照。按照制造商的说明使用 HiGene 总 RNA 提取试剂盒（RP101；Biofact）提取总 RNA，并使用 NanoDrop 分光光度计（ND-ONE；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）进行定量。使用 BioFACT RT-KIT（BR122；Biofact）由 2000 ng 总 RNA 合成互补 DNA。使用 SYBR Green PCR Master Mix（DQ38J-40h；Biofact）在 CFX Opus 96 实时 PCR 系统（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）上进行 qRT-PCR，以测量目标基因的 mRNA 表达水平。引物序列列于补充表1，循环条件已如前所述 [36]。所有循环阈值（CT）值相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）和 β-肌动蛋白（Actb）进行归一化，使用 2???CT 方法计算相对基因表达水平。2.8. 免疫印迹分析每组随机选取5只小鼠的 BAT，在液氮中使用研钵和杵匀浆，然后在加入蛋白酶抑制剂混合物（1862209；Thermo Fisher Scientific）[36] 的放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液（89901；Pierce，Rockford，IL，美国）中裂解。对于原代棕色前脂肪细胞实验，细胞通过 600 × g 离心6分钟收集，沉淀在 Totex 裂解缓冲液中裂解。裂解物随后在 4 °C 下以 16,000 × g 离心30分钟，收集上清液。组织裂解液使用 Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒（23225；Pierce），原代细胞裂解液使用 Bradford 蛋白质测定法（5000006；Bio-Rad）测量蛋白质浓度。等量蛋白质在 4–15% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转至甲醇激活的聚偏二氟乙烯膜（IPVH00010；Millipore，Darmstadt，德国）。膜用含 0.1% Tween 20 的磷酸盐缓冲液中的 5% 脱脂奶粉在室温（22–25 °C）下封闭1小时，然后在 4 °C 下与一抗孵育。所使用的抗体列表见补充表2。蛋白质条带使用化学发光检测系统（BWF0100；Biomax，京畿道，韩国）显影，条带强度使用 Touch Imager（e-BLOT Life Science，上海，中国）扫描。使用 ImageJ 软件进行定量分析。蛋白质表达水平相对于 α-微管蛋白进行归一化。图形使用 GraphPad Prism 软件（版本 8.0.1；GraphPad，La Jolla，CA，美国）生成。2.9. 线粒体 DNA 含量评估使用 PureLink 基因组 DNA Mini 试剂盒（K182001；Thermo Fisher Scientific）从 BAT 中提取基因组 DNA。以稀释的总 DNA 为模板，通过 qRT-PCR 确定相对线粒体 DNA 含量。分别扩增 COXII 和 RIP140 作为线粒体和核基因组标志物 [45]。PCR 扩增和数据分析按照 2.7 节描述的程序进行。2.10. 免疫组织化学和 TUNEL 检测为检测 iWAT 和 BAT 中的凋亡细胞，进行了 TUNEL 染色。各组组织切片进行脱蜡、复水和使用 20 μg/mL 蛋白酶 K 溶液（GD183-550；Biofact）通透化。然后按照制造商的说明使用 BrdU-Red 试剂盒（ab66110；Abcam，Cambridge，MA，美国）进行 TUNEL 染色。载玻片用 DAPI 复染，并使用配备 NIS-Elements 成像软件的 TE2000-U 荧光显微镜观察。通过计数随机选择视野中的标记细胞来定量 TUNEL 阳性核，结果表示为 TUNEL 阳性核占这些视野中总核数的百分比。2.11. 统计分析和可重复性统计分析使用 GraphPad Prism 软件进行。在应用参数检验之前，使用 Shapiro–Wilk 检验验证数据的正态性分布。两组间比较使用非配对 Student's t 检验。三组或更多组间比较进行单因素方差分析（ANOVA），随后根据需要使用 Dunnett 多重比较检验与控制组比较，或使用 Tukey 多重比较检验进行组间比较。生物学重复次数在相应图注中注明。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。组间差异在 P < 0.05 时被认为具有显著性。通常不注明非显著性差异。3. 结果3.1. BPA 诱导的脂肪组织表型改变及 BAT 在形态和分子水平上的变白控制组和 BPA 暴露组之间的体重没有显著差异（图 1C）。同样，与对照组相比，BPA 暴露未改变腹股沟（iWAT）和附睾（eWAT）白色脂肪组织的重量或归一化重量（图 1D，E）。组织学检查显示，BPA 暴露小鼠的 iWAT 和 eWAT 中的脂肪细胞相对于对照脂肪细胞略微增大（图 1F，G），表明脂质积累略有增加。总体而言，这些结果表明 BPA 暴露不会明显影响总体重或脂肪量，但可能诱导白色脂肪组织中出现细微的脂肪细胞肥大和细胞数减少。虽然 BPA 暴露对白色脂肪组织影响甚微，但大体形态学检查显示 BAT 出现明显改变，包括 BAT 颜色变浅（图 2A–C），表明 BPA 诱导的变白。尽管各组之间的总肩胛间脂肪重量没有显著差异（图 2D），但 BPA 暴露组表现出 BAT 重量减少（图 2E），同时周围白色脂肪组织重量增加（图 2F）。组织学分析和脂肪细胞大小测量显示棕色脂肪细胞明显肥大（图 2G，H）。此外，单位面积核数的定量分析显示约减少50%，表明 BPA 暴露后细胞数减少（图 2I）。为估计 BAT 库的总体细胞数，我们根据核密度和每组平均 BAT 组织质量（对照组：189 mg；BPA组：157 mg）进一步计算总细胞数。该分析估计对照组每个 BAT 库约有 2.74 × 10? 个细胞，BPA 组为 1.10 × 10? 个细胞，表明 BPA 暴露后细胞数总体减少约60%。总之，这些发现表明 BPA 诱导 BAT 变白，其特征为脂肪细胞肥大和细胞数减少，反映了脂质积累和潜在的脂肪细胞丢失。鉴于脂肪细胞变白与增强的脂肪生成相关，以及此前研究表明 BPA 促进脂肪生成通路 [20]，我们检测了脂肪生成相关基因的表达。正如假设的那样，与对照组相比，BPA 暴露组中 Ppara、Pparg 和 Cebpa 的表达水平显著增加（图 2J）。为探究潜在机制，我们分析了 BPA 对丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的影响，MAPKs 是脂肪生成的关键调节因子 [43]（图 2K，L）。虽然 ERK1/2、JNK 和 p38 的总水平没有变化，但 BPA 暴露导致这三种 MAPKs 的磷酸化形式均明显增加，其中磷酸化 ERK1/2 的升高最为显著（图 2K）。与增强的脂肪生成一致，qRT-PCR 分析显示脂肪酸转运蛋白（Cd36、Slc27a1 和 Slc27a4）显著上调（图 2M），表明摄取循环中的游离脂肪酸用于脂质储存增加。此外，参与甘油三酯合成的关键脂肪生成酶，包括 Gpat3、Agpat2、Lpin1 和 Dgat1 的表达水平也升高（图 2N）。总之，这些发现表明 BPA 促进脂质积累和 BAT 变白，证据为参与脂肪生成、脂肪酸转运和甘油三酯合成基因的表达上调。3.2. BPA 诱导的 BAT 中线粒体 DNA 减少BAT 在能量稳态和产热反应中发挥关键作用 [32]。为评估 BPA 暴露对 BAT 功能的影响，我们首先评估了关键产热调节因子的转录表达 [15]，包括 Ppargc1a 和 Ucp1。BPA 暴露组与对照组之间这两个基因的表达水平没有显著差异（图 3A）。在蛋白质水平上，BPA 暴露后 UCP1 略有下降，尽管这一变化未达统计学显著性（补充图 2 A，B）。鉴于甲状腺激素在调节产热脂肪组织中的作用，我们还检测了甲状腺激素受体 α（TRα）和 β（TRβ）的表达水平。BPA 暴露不影响这些受体的基因表达水平（图 3B），但检测到 TRβ 蛋白质表达适度增加（图 3C，D）。然而，线粒体 DNA 含量（COXII 相对于 RIP140 归一化）的定量显示，BPA 暴露组每个细胞的线粒体 DNA 含量显著降低（图 3E）。这些发现表明，尽管产热基因表达未变，但棕色脂肪细胞中线粒体减少进一步支持了 BPA 诱导的 BAT 变白。3.3. BPA 通过 NF-κB 激活诱导 BAT 炎症鉴于脂肪细胞功能障碍会触发局部和全身炎症 [38]，我们接下来检测了免疫和炎症信号的变化。与对照组相比，BPA 暴露组中促炎细胞因子 Tnf 和 Il11 的 mRNA 表达显著上调（图 4A）。相反，BPA 暴露后抗炎细胞因子 Il4 和 Il10 下调（图 4B）。在蛋白质水平上，我们观察到 BPA 处理后 BAT 中泛素化蛋白质水平增加（图 4C），提示蛋白质毒性压力增强。

此外，炎症介质的表达水平在BPA组中显著升高，包括TNF-α和IκBα（NF-κB p65:p50异二聚体的抑制剂）（图4D–F）；NF-κB p65在丝氨酸536位的磷酸化（其激活的标志物）也增加了（图4D，G）。BPA暴露还进一步上调了环氧合酶-2（COX-2）的表达，该酶是炎症反应中的关键酶（图4D，H）。综合以上发现，BPA暴露主要通过激活NF-κB信号通路在棕色脂肪组织中诱导炎症反应。

图4. 双酚A（BPA）暴露后棕色脂肪组织（BAT）的NF-κB介导的炎症反应。A 促炎细胞因子基因的mRNA表达（n = 10）。B 抗炎细胞因子基因的mRNA表达（n = 10）。C、D 炎症相关关键蛋白的代表性Western blot图像（n = 6）。E–H D的图形化呈现。数据以均值±标准误（SEM）表示。组间显著差异以星号标注（? P < 0.05，?? P < 0.01，??? P < 0.001，???? P < 0.0001）。

**3.4 BPA诱导的棕色脂肪组织过氧化物酶体β-氧化和抗氧化反应**

BPA会破坏多种组织中的氧化还原稳态[8]、[52]。为探究氧化应激的来源，我们检测了过氧化物酶体β-氧化基因（Acox1、Ehhadh）和过氧化物酶体生物合成基因Pex11a的表达水平。这些基因的上调提示BPA暴露后过氧化物酶体脂肪酸氧化增强（图5A）。鉴于β-氧化过度激活可产生过量过氧化氢[21]，我们随后评估了关键抗氧化酶的活性。qRT-PCR分析表明，与对照组相比，BPA暴露组中Sod1和Sod2的表达水平显著升高，这两种酶负责中和超氧阴离子自由基（图5B）。负责分解过氧化氢的Cat也显著上调（图5C）。Prdx和Gpx家族基因在BPA暴露后表达显著增加，这些基因在过氧化氢解毒中起关键作用，但Gpx1除外，其表达未发生变化（图5D、E）。在蛋白水平上，BPA暴露组中PRDX4和GPX4均上调（图5F–H）。这些发现提示BPA暴露导致棕色脂肪组织中活性氧（ROS）产生增加，从而激活代偿性抗氧化防御系统。

图5. 棕色脂肪组织（BAT）中的过氧化物酶体β-氧化和活性氧（ROS）驱动的抗氧化反应。A、B 过氧化物酶体功能关键基因的mRNA表达（n = 10）。C–F 抗氧化酶关键基因的mRNA表达（n = 10）。G PRDX4和GPX4蛋白的代表性Western blot图像（n = 6）。H G的图形化呈现。数据以均值±标准误（SEM）表示。组间显著差异以星号标注（? P < 0.05，?? P < 0.01，??? P < 0.001，???? P < 0.0001）。

**3.5 BPA诱导的棕色脂肪组织过氧化物酶体自噬**

持续的ROS积累和过氧化物酶体损伤可触发过氧化物酶体的选择性自噬，即过氧化物酶体自噬（pexophagy）[46]。qRT-PCR分析显示，过氧化物酶体靶向基因Pex5和Pex15显著上调，但Pex13未发生变化，提示过氧化物酶体识别增强（图6A–C）。与对照组相比，BPA暴露组中自噬启动基因Becn1、Atg5和Atg7的mRNA水平显著升高（图6D–F）。蛋白水平显示，磷酸化的p62（磷酸化p62）显著增加，p62介导受损过氧化物酶体向自噬体的募集；同时，BPA暴露后ATG5和ATG7表达升高（图6G–J）。此外，LC3A是自噬体形成和周转的关键标志物，其脂化形式（LC3A-II）与未修饰形式（LC3A-I）的比值显著增加（图6K），提示自噬通量增强。综合以上发现，BPA暴露激活了选择性自噬，包括过氧化物酶体自噬，作为棕色脂肪组织中清除受损过氧化物酶体的适应性机制。

图6. 双酚A（BPA）暴露后棕色脂肪组织（BAT）中的选择性过氧化物酶体自噬。A–C 过氧化物酶体特异性识别基因的mRNA表达（n = 10）。D–F 自噬基因的mRNA表达（n = 10）。G 自噬相关蛋白的代表性Western blot图像（n = 6）。H–K G的图形化呈现。数据以均值±标准误（SEM）表示。组间显著差异以星号标注（? P < 0.05，?? P < 0.01，??? P < 0.001，???? P < 0.0001）。

**3.6 BPA诱导的棕色脂肪组织凋亡**

为探究观察到的细胞数和组织质量减少是否由凋亡引起，我们评估了BPA暴露对棕色脂肪组织的影响。通过TUNEL染色检测棕色脂肪组织中的凋亡性细胞死亡（图7A、B）。TUNEL阳性细胞比例从对照组的9.6%显著增加到BPA暴露组的53.7%（图7B），表明BPA处理后凋亡显著增加。

图7. 双酚A（BPA）暴露后棕色脂肪组织（BAT）的严重凋亡。A 棕色脂肪组织TUNEL检测的代表性荧光显微图像（比例尺 = 50 μm）（n = 5）。B A的图形化呈现。C 外源性和内源性凋亡通路相关蛋白的代表性Western blot图像（n = 6）。D–F 外源性通路蛋白的图形化呈现（对应C）。G 腹股沟白色脂肪组织（iWAT）TUNEL检测的代表性荧光显微图像（比例尺 = 50 μm）（n = 5）。H G的图形化呈现。I iWAT和BAT中Casp3和Casp7的mRNA表达（n = 10）。数据以均值±标准误（SEM）表示。组间显著差异以星号标注（?? P < 0.01，??? P < 0.001，???? P < 0.0001）。

为进一步验证凋亡的激活，我们通过Western blot分析检测了关键凋亡相关蛋白（图7C–F）。FAS受体和裂解的caspase-8（外源性凋亡通路的启动因子）在BPA暴露组中显著上调（图7D）。同样，裂解（活性）形式的caspase-3、caspase-7和PARP——这些是凋亡执行的公认标志物——在BPA暴露动物中大幅增加（图7E）。关于内源性通路，促凋亡标志物BAX的表达在BPA暴露的棕色脂肪组织中明显升高，同时抗凋亡蛋白BCL2也增加（图7F）。这种同时上调提示细胞试图应对线粒体凋亡。支持这一观点的是，细胞色素c水平未发生变化，表明BCL2活性可能抑制了内源性凋亡。这些结果表明，主要通过FAS信号激活了外源性凋亡通路，而内源性凋亡可能被BCL2上调所对抗。

为评估棕色脂肪组织是否比白色脂肪组织更易受BPA诱导的凋亡影响，我们在相同实验条件下同时分析了iWAT和BAT。TUNEL染色显示，与BPA暴露的棕色脂肪组织相比，BPA暴露的iWAT中凋亡细胞比例显著但温和增加（约1.8倍），而棕色脂肪组织的增加更为明显（约6倍；图7G、H）。相应地，BAT中Casp3和Casp7的表达水平上调约两倍，而iWAT中仅观察到极小的变化（图7I）。综合以上结果，BPA在棕色脂肪组织中诱导的凋亡比在白色脂肪组织中更为显著，表明在这些条件下棕色脂肪组织对BPA诱导的细胞死亡尤为敏感。

**3.7 原代棕色前脂肪细胞中BPA诱导的显著凋亡伴炎症**

为进一步阐明体内观察到的代谢表型背后的细胞机制，我们使用原代小鼠棕色前脂肪细胞在细胞水平上检测了BPA的细胞毒性效应。从棕色脂肪组织和白色脂肪组织中分离的原代前脂肪细胞分别进行分化培养（补充图3A）后，UCP1蛋白表达仅在选择性检测到棕色脂肪组织来源的分化脂肪细胞中，证实了后续实验所用细胞的棕色脂肪细胞身份（补充图3B）。

经递增浓度BPA处理24小时后，细胞活力呈剂量依赖性下降，在50 μM及以上浓度时显著降低，在200 μM时降至对照组水平的26.8%（图8A）。同时观察到形态学变化，在100 μM时出现细胞缩小，在200 μM时更加明显（图8B）。

图8. 双酚A（BPA）暴露的原代棕色前脂肪细胞中炎症和凋亡的时间依赖性激活。A BPA暴露24小时后的代表性细胞活力。B 原代棕色前脂肪细胞经所示浓度BPA暴露24小时后的代表性明场细胞图像（比例尺 = 200 μm）。C Tnf、Tnfaip3、Nfkbia和Ptgs2的相对mRNA表达水平，以脂多糖（LPS，10 μg/mL）作为阳性对照。D 显示IκBα、PCNA、pro-caspase-8、cleaved-caspase-8、pro-caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白水平的代表性Western blot图像。E D中相应蛋白表达水平的定量分析，以α-微管蛋白标准化。数据以均值±标准误（SEM）表示（n = 3）。A中组间差异通过单因素方差分析后Dunnett多重比较检验确定，C和E中组间差异通过Tukey多重比较检验确定。星号表示与对照组相比的显著差异（?? P < 0.01，??? P < 0.001，???? P < 0.0001），不同字母表示组间显著差异（P < 0.05）。

为进一步评估BPA诱导的炎症反应，我们用BPA（10、100和200 μM）处理棕色前脂肪细胞2小时，随后通过qRT-PCR分析炎症基因（包括Tnf、Tnfaip3、Nfkbia和Ptgs2）的表达。在此短暂暴露期间，BPA处理细胞未观察到明显细胞毒性。作为阳性对照的LPS处理显著增加了所有四个基因的表达。同样，BPA在200 μM时显著增加了所有四个炎症反应基因的表达（图8C），提示在明显细胞毒性发生之前炎症信号通路已被快速激活。

通过Western blot分析进一步检测了BPA暴露24小时后的凋亡信号（图8D、E）。经200 μM BPA处理后，IκBα和PCNA的蛋白水平显著降低（图8E）。相反，裂解caspase-8和裂解caspase-3的水平与对照组相比增加了约7至8倍。综合2小时时炎症基因的早期诱导和24小时时凋亡标志物的后续激活，BPA诱导的炎症信号可能先于并促进原代棕色前脂肪细胞的凋亡反应。

**3.8 原代棕色前脂肪细胞中抑制炎症减轻BPA诱导的凋亡并恢复产热**

为进一步阐明原代棕色前脂肪细胞中BPA诱导的炎症与凋亡之间的分子机制联系，我们将细胞与BPA（200 μM）联合处理三种通路特异性抑制剂，分别靶向TAK1（5Z-7-oxozeaenol）、NF-κB p65（紫胶杉醇）或PI3K（LY294002）。尽管三种抑制剂均提高了细胞活力（与单独BPA处理相比），但仅5Z-7-oxozeaenol显著改善了细胞活力（补充图4A）。基于这些发现，我们进一步研究了TAK1在BPA诱导的炎症反应中的作用。5Z-7-oxozeaenol的联合处理在mRNA水平显著抑制了BPA诱导的Tnf、Tnfaip3、Nfkbia和Ptgs2的表达（图9A）。

图9. TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol在原代棕色前脂肪细胞中减轻BPA诱导的炎症、凋亡和产热反应。A BPA（200 μM）暴露有或没有5Z-7-oxozeaenol（5Z7O，5 nM）处理2小时后Tnf、Tnfaip3、Nfkbia和Ptgs2的相对mRNA表达水平。B BPA（200 μM）暴露有或没有5Z7O（5 nM）处理24小时后IκBα、PCNA、pro-caspase-8、cleaved-caspase-8、pro-caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白水平的代表性Western blot图像。C B中相应蛋白表达水平的定量分析，以α-微管蛋白标准化。D 原代棕色前脂肪细胞在有BPA（10 μM）和5Z7O的条件下进行分化培养。PGC-1α和UCP1蛋白水平的代表性Western blot图像。E D中相应蛋白表达水平的定量分析，以α-微管蛋白标准化。数据以均值±标准误（SEM）表示（n = 3）。组间差异通过单因素方差分析后Tukey多重比较检验确定。不同字母表示组间显著差异（P < 0.05）。

我们随后评估了TAK1抑制是否通过抑制炎症反应减轻BPA诱导的凋亡信号（图9B、C）。5Z-7-oxozeaenol联合处理使BPA诱导的IκBα和PCNA降低恢复到与对照组相当的水平（图9C）。相反，与单独BPA处理相比，5Z-7-oxozeaenol联合处理的细胞中裂解caspase-8和裂解caspase-3的水平降低了超过50%。

先前的研究表明，棕色前脂肪细胞分化期间BPA暴露在10 μM浓度下增加了脂肪生成和脂质积累，同时降低了产热标志物，提示出现白色化样表型[11]。

基于上述发现，我们进一步探讨了炎症信号通路的抑制能否恢复BPA所诱导的分化过程中产热功能受损。棕色脂肪前脂肪细胞在含BPA（10 μM）的条件下进行分化培养，同时加入或不加入5Z-7-oxozeaenol，并通过Western blot分析评估产热蛋白的表达（图9D-E）。BPA处理显著降低了PGC-1α和UCP1的表达水平，而联合5Z-7-oxozeaenol处理则部分恢复了其表达（图9E）。然而，仅PGC-1α的恢复达到了统计学显著性。

## 4. 讨论

在21世纪，塑料已成为最普遍的人工合成材料之一，而双酚A（BPA）是全球产量最大的化合物之一。全球BPA的年产量超过380万吨[82]，预计到2023年市场规模将达到约730万吨[60]。由于BPA具有内分泌干扰特性，其对生殖功能、代谢调节和免疫应答的影响引发了广泛关注[19]。然而，BPA对脂肪组织尤其是棕色脂肪组织（BAT）的细胞毒性作用目前仍知之甚少。本研究旨在利用最低作用水平（LOAEL，50 mg/kg体重/天）的暴露量，在鼠模型中探讨BPA诱导的BAT细胞及细胞毒性变化，以阐明其毒理机制。

本研究显示，BPA会引起脂肪组织（包括BAT、皮下白色脂肪组织（iWAT）和附睾白色脂肪组织（eWAT））的显著改变，其中BAT的体重和脂肪细胞形态变化最为突出。鉴于脂肪细胞大小与细胞应激之间存在明确的关联[26]，BAT似乎对BPA尤为敏感。表型变化包括BAT颜色改变、周围白色脂肪组织比例增加以及脂肪细胞增大，表明BAT发生了"白化"。BPA已被报道可在脂肪组织中激活PPARγ[29]，从而促进脂肪生成。与此一致，我们在BPA暴露的BAT中观察到Pparg和Cebpa的上调，提示BPA诱导的主要脂肪生成转录因子可能增强棕色脂肪细胞的脂肪生成。这可能是通过增加脂肪酸摄取和激活甘油三酯合成来促进脂质积累的，共同导致BAT白化。此外，BAT减少还可能源于BPA诱导的细胞毒性，导致细胞死亡显著增加和细胞数量减少。为此，我们根据组织切片的体积、组织密度以及每组的平均组织质量，估算了每个BAT位点的总细胞数。分析结果显示，BPA暴露组的总细胞数减少更为显著。

与白色脂肪组织可能因代谢周转较慢而作为BPA的长期储存库不同，BAT较高的代谢活性可能导致BPA代谢更为迅速，从而可能产生有毒代谢物和活性氧（ROS）。因此，BPA似乎同时驱动BAT的细胞毒性和表型重塑，存活细胞中脂滴的扩大可能填充了凋亡细胞丢失留下的空间，这可能解释了为何尽管BAT减少，总体脂肪量却保持稳定。

BAT的产热功能主要由线粒体生物合成和解偶联过程调控[10]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1-α（PGC-1α）是线粒体功能和能量代谢的主调控因子[41]，UCP1则是非耦联呼吸的关键介质[14]，两者对BAT的产热能力均至关重要。甲状腺激素信号传导对BAT发育和产热激活同样必不可少，尤其在胎儿BAT发育中[73]。在本研究中，BPA暴露并未显著改变产热基因的表达，仅TRβ蛋白表达略有增加，这与此前报道BAT白化时产热受抑制的描述[75]、[80]形成对比。然而，线粒体DNA含量的测定显示BPA暴露组显著降低。这提供了有力证据，表明BPA处理BAT中线粒体数量显著减少很可能导致组织水平的产热功能障碍。棕色脂肪细胞增大伴随BAT质量下降，进一步表明总细胞数减少。由于qRT-PCR测量的是每单位总mRNA的产热基因表达，结果不一定反映整个BAT位点的总体产热能力。考虑到线粒体耗竭以及估算的总细胞数较对照组减少约2倍，BPA暴露后BAT的总体产热潜力很可能下降。这些数据为解释此前观察到的BPA暴露后BAT产热降低[54]提供了科学依据。

慢性脂肪组织炎症通常与脂肪细胞肥大和脂质过度积累相关[28]、[65]。与此一致，BPA暴露显著上调了促炎细胞因子的表达，增加了NF-κB p65在Ser536位点的磷酸化水平，并增强了BAT中的蛋白泛素化。TAK1是NF-κB信号通路的重要上游调控因子，通过激活IKK复合物促进炎症反应，诱导NF-κB抑制因子IκBα的泛素依赖降解和随后NF-κB的激活[2]、[71]。活化的NF-κB随后调控炎症介质的表达，如TNF-α、COX-2及其他炎症相关基因[84]。尽管炎症通路已被激活，但肥大白化的棕色脂肪细胞不太可能是炎症信号的唯一起源，尽管增大的脂肪细胞通常会产生脂因子及相关炎症信号。BPA诱导的BAT中凋亡显著增加可能还会招募额外的免疫细胞来清除死亡细胞，进一步放大局部炎症信号。因此，BPA诱导的炎症可能反映了脂肪细胞功能障碍、细胞死亡和炎症信号之间的正反馈交互作用，而不仅仅是脂肪细胞肥大和白化的结果。

由于炎症信号和凋亡在体内同时被激活，我们接下来试图在细胞水平确定炎症信号是否参与了BPA诱导的凋亡，而不仅仅与凋亡平行发生。为此，我们考察了棕色脂肪前脂肪细胞中炎症信号与凋亡信号的时间关系，并测试了TAK1的药理学抑制是否能减轻BPA诱导的凋亡。BPA在暴露后2小时内迅速诱导炎症反应基因的表达，包括Tnf、Tnfaip3、Nfkbia和Ptgs2，而24小时后则观察到剪切型caspase-3和caspase-8水平升高，PCNA和IκBα蛋白表达降低。炎症基因在凋亡标志物可检测到激活之前即被诱导，提示炎症信号可能参与后续BPA诱导的凋亡。与此解释一致，使用5Z-7-oxozeaenol进行TAK1药理学抑制显著减弱了BPA诱导的炎症反应，将IκBα和PCNA表达恢复至接近对照组水平，并减少了caspase-3和caspase-8的剪切。此外，TAK1抑制部分恢复了棕色脂肪细胞分化过程中PGC-1α的表达，提示TAK1依赖的炎症信号也参与了BPA诱导的产热程序受损。

综上所述，这些发现支持这样一种模型：BPA诱导的TAK1依赖的炎症信号促随后凋亡通路的激活以及棕色脂肪前脂肪细胞产热程序的受损。反过来，凋亡及其导致的组织重塑可能在体内进一步加剧炎症反应，从而在炎症与凋亡之间建立一个正反馈循环，导致慢性BPA暴露后BAT功能障碍。

与此一致，BPA还诱导了氧化应激，这是已知凋亡和炎症的上游触发因素[23]、[85]。暴露于BPA等环境毒物，加上脂质积累期间细胞内脂肪酸摄入过多，可导致毒性脂质代谢物的形成，包括二酰甘油、神经酰胺和其他生物活性脂质[5]、[77]。虽然白色脂肪组织主要储存这些脂毒性中间体，但BAT倾向于通过由PPARα调控的过氧化物酶体β-氧化等代谢途径来分解它们[48]、[70]。在此背景下，我们的数据表明BPA暴露可能在BAT中诱导了毒性脂质代谢物的异常积累，进而触发了过氧化物酶体β-氧化的过度激活作为一种补偿性解毒反应。一致的是，我们数据集中Ppara的上调表明PPARα激活可能介导了这种增强的过氧化物酶体β-氧化。然而，该通路的过度激活不可避免地会产生大量过氧化氢，从而加剧ROS水平升高。抗氧化基因（包括Sod1、Sod2、Cat、Prdx和Gpx）的同时上调表明细胞试图对抗过量的ROS产生[25]、[33]。PRDX4和GPX4蛋白水平升高进一步支持BPA暴露后BAT中存在ROS驱动的应激反应。

过氧化物酶体β-氧化后持续性ROS积累可损害过氧化物酶体蛋白和膜脂质。在BPA暴露的BAT中，这种过氧化物酶体损伤似乎通过诱导过氧化物酶体的选择性自噬（即pexophagy）触发了防御机制。与此观察一致，BPA处理的BAT中自噬相关基因（包括Becn1、Atg5和Atg7）表达上调，相应蛋白水平增加，表明自噬体的形成和扩张[86]。磷酸化p62水平升高（其负责将受损过氧化物酶体招募至自噬体），同时LC3-II周转增加[39]，支持自噬流增强。这些发现表明pexophagy（由p62介导）在BPA暴露的BAT中作为一种适应性反应，用于清除受损过氧化物酶体并减轻氧化应激。

我们的发现表明凋亡是BPA诱导细胞毒性的核心机制，驱动了BAT中观察到的大量细胞丢失。TUNEL染色显示BPA组凋亡细胞显著增加。这些凋亡的棕色脂肪细胞很可能被清除并由新分化的类白色脂肪细胞取代，参与结构性重塑。然而，凋亡与脂肪生成重塑是同时发生还是凋亡先发生并促进后续脂肪生成尚不清楚。因此，凋亡也可能通过减少产热细胞来促进白化，尽管因果关系需要进一步研究。与此同时，大量研究表明BPA会破坏线粒体稳态并降低多种细胞类型和组织中的mtDNA拷贝数[62]、[78]，这提示BPA可能首先减少棕色脂肪细胞特有的丰富线粒体。目前尚不清楚这种减少是由线粒体生物合成减少还是降解增加所致；但线粒体生物合成减少可能参与BPA诱导的白化过程，值得进一步研究。线粒体丢失可能损害BAT的细胞身份，使组织更容易发生白化过程。综上所述，BPA可能通过同时促进凋亡和BAT白化发挥双重作用。

在机制上，我们观察到BAT中凋亡相关蛋白大幅上调。虽然内源性和外源性凋亡通路均可被环境应激因子激活[49]，但我们的发现支持外源性通路的优先激活。尽管BAX表达（促凋亡内源性标志物）上调，但BCL2（抗凋亡）水平也增加，而细胞色素c和caspase-9（数据未显示）水平未变，提示内源性凋亡被缓解。内源性通路活化的有限程度可能反映了棕色脂肪细胞对线粒体介导凋亡的固有抵抗性，因为这类细胞高度依赖线粒体氧化代谢，而BPA暴露BAT中线粒体含量的减少可能限制了完全激活内源性凋亡所需的信号。相比之下，死亡受体FAS（CD95）及其下游起始caspase-8被强烈激活，效应caspases（caspase-3和caspase-7）及PARP剪切也增加，表明FAS介导的外源性凋亡是BAT中BPA诱导细胞死亡的主要途径。

为评估组织特异性，我们将BAT中的这些效应与iWAT进行了比较。虽然BPA也增加了iWAT中的凋亡标志物，但其幅度显著低于BAT，这与BPA及其类似物优先在BAT中积累的既往发现一致。例如，一项大鼠研究报告BAT中的BPA积累量比白色脂肪组织高7倍以上[54]；类似地，一项小鼠研究发现BPA的结构类似物双酚S在BAT中的积累量几乎是白色脂肪组织的10倍[80]。这可能反映了BAT更高的血管丰富度和代谢活性，有利于脂溶性毒物的摄取和滞留。这些数据凸显了BAT作为BPA毒性的主要和选择性靶点，鉴于其在能量稳态中的主导作用，这可能具有全身性影响。

尽管BAT对BPA的敏感性最高，白色脂肪组织也表现出显著改变，为全身代谢后果提供了额外见解。同样，BPA增加了白色脂肪组织中的脂肪细胞大小并诱导凋亡，但并未改变白色脂肪组织总质量，提示脂肪细胞肥大和细胞数减少的组合效应。这表明BPA不仅影响脂肪细胞的数量，还改变了其功能特征。增大的脂肪细胞已知表现为胰岛素信号受损[35]、促炎脂因子分泌增加[68]以及脂质储存能力降低[26]，均导致全身代谢功能障碍。脂肪细胞数量的同时减少可能通过限制组织缓冲循环中过量脂质的能力来加剧这些效应，可能促进其他器官的异位脂质积累[34]。

综合来看，我们的研究发现揭示了一种新颖的细胞机制，通过该机制BPA可能驱动代谢失调：脂肪细胞数量减少但体积增大（肥大），从而损害胰岛素敏感性并增加代谢紊乱（包括2型糖尿病）的风险。这一解释为既往将BPA暴露与代谢紊乱相关联的报告提供了新视角，强调了在理解环境毒物代谢后果时需同时考虑脂肪细胞大小与细胞数量。尽管本研究未评估体重以外的系统性代谢参数，但既往研究已在相似或显著不同的暴露条件下报道了BPA诱导的代谢紊乱。例如，雄性成年大鼠口服BPA 20–200 mg/kg持续30天可显著升高血清胰岛素，而空腹血糖无变化[30]；而短期低剂量暴露（100 μg/kg持续8天）可诱导雄性成年小鼠胰岛素抵抗并破坏全身能量稳态[6]。这些发现提示，本研究中观察到的BAT改变可能具有更广泛的系统性代谢意义，尽管这一关系仍需在所用暴露条件下直接验证。在解读这些结果时，需考虑本研究所用剂量。我们采用50 mg/kg/day的BPA剂量，对应既往报告的LOAEL。然而，该剂量比典型人类环境暴露水平高出数个数量级，因此不应直接视为代表真实人类暴露情况。鉴于BPA诱导BAT毒性的分子机制仍未完全阐明，本研究主要旨在表征这一已确立毒理学剂量下BPA诱导BAT功能障碍的生物学与分子机制。既往BPA机制研究也采用类似单剂量方法探究其生物学效应[4]，[57]。然而，单剂量使用无法确定剂量-反应关系，并限制将研究结果直接外推至环境相关的人类暴露。未来需纳入多种BPA剂量（包括环境相关低剂量）的研究，以确定本研究中鉴定的BAT表型及相关分子通路是否也在更低暴露水平下发生。因此，我们的发现为未来跨剂量BPA诱导BAT功能障碍的剂量-反应研究提供了机制基础。此外，本研究仅在雄性小鼠中进行。选择雄性动物旨在最小化动情周期相关激素波动的潜在混杂效应，尤其考虑到BPA的雌激素拟态活性[66]。由于雌激素在调节脂肪组织与脂质代谢中发挥重要作用[69]，不能排除性别特异性反应，本研究结果可能无法直接推广至雌性。未来纳入雌性小鼠的研究对于确定BPA诱导BAT功能障碍是否为性别共有或反映性别特异性易感性具有重要意义。总之，本研究提供了有力证据表明BAT是BPA毒性的特别易感靶点。BPA暴露（LOAEL水平）诱导BAT发生病理与细胞毒性改变，包括白化、凋亡、炎症、氧化应激及选择性自噬。BPA诱导棕色脂肪细胞凋亡不仅降低产热能力，还通过白化过程促进BAT细胞重塑，即代谢功能性的棕色脂肪细胞被白色脂肪细胞样细胞取代。这一转变可能进一步损害BAT功能，潜在促成系统性代谢功能障碍。这些发现凸显了BAT在环境毒理学中常被忽视的作用，并提示BPA诱导的功能障碍可能对代谢健康产生深远影响。鉴于该环境毒物潜在的生命早期暴露与累积效应，亟需进一步研究探索长期代谢结局，并评估潜在的保护性干预措施（如抗氧化剂），以减轻环境污染物对产热脂肪组织的影响。探讨BPA与BAT之间的分子相互作用可为理解BPA诱导代谢紊乱的机制提供关键洞察，并助力开发保护代谢健康的干预措施。环境意义暴露于美国环保署为啮齿类动物定义的LOAEL水平双酚A（BPA）会破坏棕色脂肪组织（BAT）形态与功能，诱导BAT白化、线粒体DNA减少及NF-κB介导的炎症。BPA还触发过氧化物酶体β-氧化、自噬、抗氧化反应及凋亡，共同损害产热活动与能量代谢。这些分子与细胞改变凸显了环境BPA暴露的潜在代谢危害。我们的发现强调了监测与监管消费品中BPA以降低人类与生态风险的重要性。解决BPA污染对于预防暴露人群能量稳态与脂肪组织健康的长期效应至关重要。CRediT作者贡献声明Buom-Yong Ryu：撰写-审阅与编辑、监督、方法学、资金获取、概念化。Kichoon Lee：撰写-审阅与编辑、监督、方法学、概念化。Myung-Geol Pang：资源、方法学。Sung-Hwan Moon：撰写-审阅与编辑、方法学。Won-Ki Pang：资源、方法学。Seung Hee Shin：撰写-审阅与编辑、撰写-原稿、可视化、方法学、调查、形式分析、概念化。Seul Gi Kim：撰写-审阅与编辑、撰写-原稿、可视化、方法学、调查、形式分析、概念化。Hyo Jin Gu：方法学。Seul Gi Kim | Seung Hee Shin | Hyo Jin Gu | Won-Ki Pang | Sung-Hwan Moon | Myung-Geol Pang | Kichoon Lee | Buom-Yong Ryu韩国中央大学动物科学技术系，京畿道安城市，邮编17546，大韩民国。