亚微米牡蛎壳粉通过加固土壤与根系屏障缓解镉的植物毒性

《Journal of Hazardous Materials》：Sub-micrometer Oyster Shell Powder Mitigates Cadmium Phytotoxicity through Soil and Root Barrier Reinforcement

　　

摘要 牡蛎壳是一种丰富的海洋生物源废弃物，具有作为土壤改良剂再利用的潜力，但传统颗粒粉末有限的反应活性限制了其镉（Cd）修复效率。在此，我们开发了一种可扩展的机械微细化策略，将颗粒牡蛎壳粉末（GOSP）制备为平均直径亚微米级的微细化牡蛎壳粉末（SOSP），并评估了粒径细化能否提高其缓解镉植物毒性的能力。缓解效率随添加剂量增加而提高，在1000 mg kg?1时效果最为显著。在此水平下，与GOSP相比，SOSP使地上部和根部生物量分别增加37%和55%，并使地上部和根部镉浓度分别降低15%和54%。这种缓解作用由土壤—根系系统中双重机制驱动。在土壤中，SOSP使pH升高2%、钙有效性提高4%，使交换态镉较GOSP降低58%。在根部，SOSP将细胞壁结合态镉比例从GOSP处理下的58%提高至72%，并伴随苯丙烷途径（4CL-CCR-CAD）的激活、木质素积累增加和细胞壁增厚。这些结果表明，粒径细化将土壤镉强化固定与根部质外体屏障强化结合起来，为开发高反应活性牡蛎壳衍生改良剂以缓解镉风险提供了支撑。

1. 引言
镉（Cd）是农业土壤中一种高移动性的有毒元素，可被植物吸收，对健康构成风险[1]、[2]。因此，降低土壤镉生物有效性并减少植物镉积累是农业土壤修复和镉风险管理的核心目标[3]。两道互补的屏障决定镉从土壤向地上部的转移。第一道是土壤化学屏障，即通过pH调节、碳酸盐反应、矿物沉淀和表面络合，将镉从交换态形式转变为有效性较低的形态池[4]。第二道是根部质外体屏障：多糖和木质素为Cd2?提供结合位点，而木质素沉积和细胞壁增厚则限制镉向共质体和木质部的径向运输[5]。因此，协调外部和内部这两道屏障，可能比单独针对其中任一过程提供更强保护[6]、[7]。

牡蛎壳是牡蛎养殖和海鲜加工产业产生的丰富海洋生物源废弃物，其不当处置会造成环境负担。因此，牡蛎壳废弃物的回收利用越来越多地被认为是减轻废弃物处理压力、开发用于环境修复的增值材料的可持续策略[8]。当施用于酸性土壤时，牡蛎壳衍生的改良剂可通过提高pH、供给碳酸盐，并促进Cd、Pb、Zn和Cu等有毒元素沉淀、共沉淀和表面络合形成溶解度较低的形态，从而改变土壤化学条件[9]、[10]、[11]。这些过程可将有毒元素从交换态转变为更稳定的组分，降低其生物有效性和移动性。值得注意的是，先前大多数研究使用的是粗磨材料或颗粒状/散装牡蛎壳粉末，其修复效率可能受到有限的比表面积和反应活性的制约[12]。

关于粒径工程化材料的丰富文献表明，将粒径减小至微米或纳米尺度可显著提高表面反应活性和金属结合能力[13]。这一提升主要归因于更小颗粒具有更大的比表面积、更多的反应位点以及增强的离子交换能力[14]。在一块冶炼影响土壤中，将羟基磷灰石粒径从常规（0.25 mm）减小至微-HAP（3 μm）或纳米-HAP（40 nm）后，原位处理使交换态Cu降低73.7–80.1%，交换态Cd降低20.8–35.2%[15]。近期综述指出，更小的土壤改良剂颗粒通常能为金属吸附和转化提供更多活性表面，有望改善修复性能[16]、[17]、[18]。这些发现共同表明，粒径减小是不同改良体系中超重金属固定性能改善的关键驱动因素。

关于牡蛎壳改良剂的现有证据大多基于相对较大的颗粒（GOSP），进一步减小粒径能否提高镉修复效率尚不清楚。更重要的是，这种粒径细化是否仅影响土壤镉固定，还是也会影响植物根部屏障响应，尚未得到确认。烟草是一种累积镉的叶用经济作物，其叶片镉积累直接关系到烟草产品安全和通过吸烟造成的人体暴露。其对土壤镉胁迫的敏感性也使其成为评估改良剂所引起的镉生物有效性变化、植物镉分配和根部屏障响应的适宜植物体系。在此，我们使用一种具有工业相关性的机械微细化工艺，从颗粒牡蛎壳粉末（GOSP）制备出平均直径亚微米级的微细化牡蛎壳粉末（SOSP），并以接种镉土壤中的烟草幼苗（Nicotiana tabacum L.，品种NC55）为材料。将材料表征、土壤镉组分分析、植物生理分析、亚细胞镉分配、细胞壁超微结构以及整合转录组学—代谢组学分析相结合，以确定粒径细化能否改善镉缓解，并阐明相关的土壤和根部机制。因此，本研究评估了一种可扩展、无需试剂的牡蛎壳废弃物升级策略，同时阐明粒径工程如何影响土壤—植物系统中的镉行为。

2. 材料与方法
2.1 牡蛎壳衍生材料的制备与表征
将牡蛎壳用去离子水清洗并干燥至恒重。将清洗后的壳在600 °C下煅烧，冷却至室温后粗磨，得到颗粒牡蛎壳粉末（GOSP）。随后取部分GOSP用高能研磨机（JXFSTPRP-24L，精新，中国）研磨2–10分钟，制成平均直径亚微米级的微细化牡蛎壳粉末（SOSP）。SOSP的形貌采用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）（Hitachi SU8010，日本）观察。SOSP的表面元素组成用X射线光电子能谱（XPS）表征，仪器为ESCALAB 250Xi（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。官能团图谱通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）获取，仪器为Nicolet iS10（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。对于胶体特性，将SOSP在去离子水中配制成0.1 mg mL?1悬浮液，用动态光散射（Zetasizer Nano ZS90，Malvern Panalytical，英国）测量微细化粉末的水动力学直径（Z-average）、多分散指数（PDI）和ζ电位。测量以独立重复分散液进行（n = 3），结果以均值 ± 标准差表示。

2.2 实验设计
田间土壤采集自山东农业大学，经风干、筛分（2 mm）和灭菌处理，以减少不可控的生物变异性并建立更可重复的镉胁迫体系。该田间土壤背景总镉浓度为0.295 ± 0.024 mg kg?1（干重），其他理化性质见表S1。
除未污染对照（CK）外，将灭菌的田间土壤与育苗基质（泥炭，3:1，v/v）按4:1（w/w）比例混合，并用CdSO?溶液加镉至最终浓度40 mg Cd kg?1干重。选择该镉浓度是为产生稳定、可重复的镉胁迫表型，便于GOSP与SOSP之间的机制比较，而非代表田间应用阈值。将土壤充分混匀，调至田间持水量的60–70%，在25 ± 1 °C下平衡30天。平衡后，将GOSP或SOSP按100、500或1000 mg kg?1干混入加镉土壤中。共设置八个处理：CK（不加镉也不加改良剂）、Cd（不加改良剂的40 mg kg?1镉）、Cd+GOSP100、Cd+GOSP500、Cd+GOSP1000、Cd+SOSP100、Cd+SOSP500和Cd+SOSP1000。施入改良剂的土壤再平衡3天后移栽。

将长势一致的烟草（Nicotiana tabacum L.，品种NC55）幼苗移栽至预处理土壤中。每个处理设三个重复盆，每盆一株（n = 3）。各盆在光控生长箱中随机摆放（14 h光照/10 h黑暗；400 μmol m?2 s?1；25/22 °C；相对湿度60–70%）。通过称重将土壤水分维持在田间持水量的60–70%，不额外施肥。
100、500和1000 mg kg?1剂量下生物量和镉积累的剂量—效应结果见图S1。在所测剂量中，1000 mg kg?1产生的镉毒性缓解最强且最一致，因此被选为主文中详细机制表征的剂量。

2.3 表型观察与生物量测定
暴露2周后，从顶部和侧面拍摄地上部照片。将各盆地上部和根系吸干水分，分别称取鲜重，然后先在105 °C下烘干15–30分钟，再在65 °C下烘至恒重，测定干生物量。每盆（每盆一株）视为一个生物学重复（n = 3）。

2.4 土壤镉组分及理化性质的测定
将各盆根际土壤风干、粉碎并筛分（0.15 mm）。土壤pH、交换态钙、有机质以及有效N、P、K采用Text S1所述的标准方法测定[19]。土壤镉组分采用社区参考局（BCR）顺序提取法测定，获得交换态、可还原态、可氧化态和残余态镉，如Text S2所述[20]。土壤总镉计算为各组分之和。为进一步评估牡蛎壳粉末本身能否直接吸附镉，另用GOSP和SOSP进行了批次镉去除试验，测定培养后的残余镉浓度，详细步骤见Text S3。

2.5 叶片光合特征
在暴露期第14天进行叶片生理测定，于09:00至11:00之间，使用LI-6400XT系统（LI-COR，美国）测量第3–4片完全展开叶的气体交换（n = 3；每盆一株），条件为PPFD 800 μmol m?2 s?1、CO? 400 μmol mol?1、25 ± 1 °C和相对湿度60–70%。记录净光合速率（A）、气孔导度（Gs）、胞间CO?浓度（Ci）和蒸腾速率（E），并按A/E计算水分利用效率（WUE）（[21]；Text S4）。暗适应25分钟后，用Imaging-PAM MAXI系统（Heinz Walz，德国）测量叶绿素荧光参数（Fv/Fm、QY、NPQ和QP）。叶绿素a和b含量采用乙醇提取后分光光度法测定，方法参照Zhou等人[22]，详细步骤见Text S5。

2.6 镉积累、亚细胞分布及根部木质素含量的测定
将地上部和根系洗净、烘干，用玛瑙研钵研磨成细粉。经HNO?–H?O?消解（0.200 g组织）后，采用石墨炉原子吸收光谱法（AAS；PinAAcle 900 T，PerkinElmer，美国）测定总镉，并使用标准参考物质进行质量控制（[23]；Text S6）。根和叶中的亚细胞镉分布采用差速离心法分为细胞壁、细胞器和水溶性组分，随后按上述方法消解并测定镉；根据土壤、根和地上部中的镉浓度计算富集因子和迁移系数（TF = 地上部/根部镉）（[24]；Text S7）。根部木质素含量采用乙酰溴法在280 nm处测吸光度定量，方法见Text S8[25]。

2.7 根部整合转录组学与代谢组学分析
从CK、Cd、G1000和S1000处理中采集根部，每个处理三个独立生物学重复。样品立即用液氮速冻并保存于?80 °C直至分析。
对于转录组分析，从冷冻组织中提取总RNA，进行质量评估和文库构建。文库在Illumina平台上以双端模式测序。经质量过滤后，将干净reads比对至烟草（Nicotiana tabacum）参考基因组，并生成基因表达矩阵用于差异表达和功能富集分析。
对于代谢组分析，从冷冻组织中提取代谢物，采用超高效液相色谱联用高分辨质谱进行分析。原始数据经峰检测、保留时间对齐、解卷积和归一化处理，并通过与可用的光谱数据库和谱库比对进行代谢物注释。
转录组与代谢组数据集通过差异分析、途径富集，以及将差异表达基因和差异代谢物映射至共享的KEGG途径进行整合。样品制备、质量控制、数据处理和多组学整合的详细步骤见Text S9，并遵循Sun等人[26]所述的一般流程。

2.8 数据处理与统计分析
数据以盆为单位（n = 3）进行分析，以均值 ± 标准差表示。统计分析在SPSS 26.0中进行，检验正态性和方差齐性后，采用单因素方差分析及Tukey's HSD检验（p < 0.05）。图形由Origin 2021绘制，不同小写字母表示差异显著（p < 0.05）。对于组学数据集（每处理三个生物学重复，n = 3），使用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs）（FDR < 0.05且|log?FoldChange| ≥ 1），并根据变化倍数和统计显著性（p值或FDR）筛选差异代谢物，适用时结合多元标准（如VIP）；GO/KEGG富集和转录组—代谢组整合按Text S9所述进行。

3. 结果
3.1.

牡蛎壳衍生材料的制备与表征（GOSP、SOSP）

新鲜牡蛎壳经清洗去除杂质后在600°C下煅烧。煅烧后的贝壳粗磨得到GOSP，部分GOSP进一步经高能微粉碎处理制得SOSP（图1A）。

图1. SOSP和GOSP的制备与表征。（A）牡蛎壳衍生材料（GOSP和SOSP）制备流程示意图。（B–C）SOSP的SEM图像，两种放大倍数。（D）主要元素结合能的XPS谱。（E）牡蛎壳粉特征官能团的FTIR谱。（F）不同研磨时间（2–10分钟）制备的粒子的粒径分布（Z-Ave）、（G）Zeta电位和（H）多分散指数（PDI）。不同字母表示差异显著，p < 0.05（均值±SD，n = 3）。

SEM观察显示，SOSP主要由不规则的片状和碎块状颗粒组成，具有锐利边缘和粗糙表面（图1B–C）。粒径分布统计表明平均直径为0.867±0.341 μm，D10–D90范围为0.673–2.211 μm。分布分析进一步显示80.5%的测量粒子小于1 μm，但部分粒子大于1 μm，证实SOSP具有亚微米平均直径，但并非完全由1 μm以下的粒子组成（图S2）。在更高放大倍数下，颗粒表面可见微/纳米孔特征（图1C），表明其具有高度纹理化的形貌。XPS分析表明表面元素组成以Ca为主，同时检测到C和O（图1D）。FTIR谱显示典型的碳酸盐相关特征峰，包括1420 cm?1附近的强吸收峰以及878和712 cm?1处的峰（图1E），确认保留了CaCO?相关的官能团。

为优化高能微粉碎条件，基于流体力学直径（Z-Ave）、ζ电位和多分散指数（PDI）评估了时间梯度（2–10分钟）（图1F–H）。Z-Ave呈下降-回升趋势，在4分钟时达到最小值（0.89 μm）（图1F）；4分钟处理还表现出最低的PDI（0.45）和稳定的负ζ电位（图1G–H）。因此，选择4分钟作为后续实验中SOSP制备的标准条件。

3.2. 生长和光合性能

Cd暴露抑制了烟草生长，而牡蛎壳改良剂显著缓解了这种植物毒性（图2A–B）。与CK相比，Cd使地上部干重降低了41.99%（图2B；p < 0.05）。在1000 mg kg?1水平下，两种改良剂均促进了生物量恢复，SOSP（S1000）优于GOSP（G1000），尤其在根部表现突出：相对于Cd，S1000和G1000分别使根干重增加232.6%和114.8%（图2B）。在牡蛎壳改良剂处理下，根形态呈现一致改善，SOSP总体上优于GOSP（表S2）。具体而言，与Cd相比，S1000显著增加了总根长、根表面积和根体积，并增强了根的增粗和分支（更高的平均直径、分叉数和根尖数），表明根系架构恢复能力更强。

图2. SOSP和GOSP对Cd胁迫下烟草生长和光合性能的影响。（A）表型特征。（B）地上部和根部的干重。（C）净光合速率。（D）叶绿素荧光图像。（E）叶绿素a和b含量。（F–I）Fv/Fm（F）、QY（G）、QP（H）和NPQ（I）的定量分析。不同字母表示差异显著，p < 0.05（均值±SD，n = 3）。G和S分别代表GOSP和SOSP。

Cd暴露抑制了光合作用，净光合速率（A）相比CK降低了43.16%，而S1000使A相比Cd提高了81.87%（图2C）。其他气体交换参数（Ci、gs、E和WUE）和PSII相关荧光指标呈相似趋势，S1000的恢复效果强于G1000（图2D–I；图S3）。叶绿素含量呈相同模式（图2E；p < 0.05）。总体而言，S1000最有效地缓解了Cd引起的生长和光合抑制。对综合生理和Cd相关性状的主成分分析进一步将Cd+S1000与Cd及Cd+G1000在根和地上部中区分开来（图S4）。

3.3. 牡蛎壳改良剂调控土壤pH/Ca并驱动Cd向稳定化库转化

在Cd暴露条件下，牡蛎壳改良剂显著改变了土壤化学条件（图3B–C）。与CK相比，Cd略微降低了土壤pH（p > 0.05），而两种改良剂均显著提高了pH（p < 0.05），SOSP的pH数值高于GOSP（7.83对7.68），但S1000与G1000之间的差异无统计学意义（p > 0.05）（图3B）。与Cd相比，G1000和S1000分别使土壤Ca增加4.30%和8.94%（图3C；p < 0.05）；其他性质详见表S3。

图3. SOSP和GOSP对Cd赋存形态和土壤理化性质的影响。（A）不同处理下Cd在交换态（EXC）、氧化态（OXI）、还原态（RED）和残渣态（RES）中的分布。（B）土壤pH。（C）土壤Ca含量。（D）Cd赋存形态与土壤环境因子（Ca和pH）之间关联的冗余分析（RDA）。（E）环境距离（基于pH和Ca）与Cd形态距离之间的Mantel检验（r = 0.696，p = 4.9×10?3）。（F）土壤因子与Cd赋存形态之间Mantel关联的网络可视化，线条粗细表示Mantel R值，颜色深浅表示Mantel p值。不同字母表示差异显著，p < 0.05（均值±SD，n = 3）。G和S分别代表GOSP和SOSP。

土壤改良使Cd赋存形态向更稳定的库转移（图3A）。与Cd相比，两种改良剂均减少了交换态Cd并促进了稳定化，S1000的效果更强：EXC-Cd下降19.94%（G1000）和66.68%（S1000），同时OXI-Cd增加91.96%和271.1%，RES-Cd增加8.45%和48.10%（图3A；p < 0.05）。EXC占比从16.92%（Cd）降至13.43%（G1000）和5.13%（S1000），而OXI从9.79%分别增至18.62%和33.02%（图3A）。

多元统计分析支持土壤因子与Cd形态之间的紧密关联（图3D–F）。RDA分离了不同处理（置换检验p = 0.001），RDA1和RDA2分别解释了57.18%和31.19%的方差（图3D）。土壤pH和Ca与EXC/RED负相关，但与OXI/RES正相关，S1000在pH/Ca–OXI/RES方向上的偏移最为显著（图3D）。Mantel分析证实了这一关联（r = 0.696；p = 4.9×10?3；图3E），Mantel网络突出了pH/Ca与稳定态Cd赋存形态更强的关联（图3F）。总体而言，S1000比G1000更有效地提高了土壤pH和Ca，并驱动Cd从活性态向稳定态库转移。

3.4. 牡蛎壳改良剂降低Cd积累并重塑烟草亚细胞分配

两种牡蛎壳改良剂均减轻了烟草中的Cd积累，S1000优于G1000，尤其在根部表现更为突出（图4A、D）。与单独Cd处理相比，G1000使地上部Cd降低13.71%，S1000降低27.06%（图4A；p < 0.05）。根部Cd响应更为强烈，G1000使根Cd下降21.26%，S1000下降64.13%（图4D；p < 0.05）。

图4. SOSP和GOSP对烟草中Cd积累和亚细胞分布的影响。（A）地上部Cd含量。（B）叶片亚细胞组分（细胞壁、可溶组分和细胞器）中Cd含量。（C）叶片各亚细胞组分中Cd的比例。（D）根部Cd含量。（E）根部亚细胞组分中Cd含量。（F）根部各亚细胞组分中Cd的比例。不同字母表示差异显著，p < 0.05（均值±SD，n = 3）。G和S分别代表GOSP和SOSP。

亚细胞组分分析揭示了组织特异性的再分配模式（图4B–C、E–F）。在叶片中，Cd主要在可溶组分和细胞壁之间分配，细胞器贡献较小（图4B–C），两种改良剂下比例分布均在较小范围内变化（图4C）。

在根部，两种改良剂均优先耗竭了代谢活性库中的Cd并增加了细胞壁的相对贡献（图4E–F）。与Cd相比，G1000使可溶态Cd降低23.36%，S1000降低65.86%；细胞器态Cd分别降低39.97%和59.27%（图4E；p < 0.05）。虽然细胞壁态Cd也有所下降，但可溶态和细胞器态库更强的耗竭使细胞壁占比从52.59%（Cd）提升至57.99%（G1000），并进一步升至72.09%（S1000）（图4F）。这些发现表明S1000不仅降低了Cd总积累量，还将根部Cd分配向细胞壁相关库转移。富集和转位指标支持了这一趋势（图S5）；土壤因子、亚细胞Cd库和转运指标之间的综合关联见图S6A。

3.5. 根部多组学定义了Cd胁迫特征标记及SOSP的差异化重编程

整合转录组和代谢组学分析显示，Cd驱动了强烈的根部响应，且改良剂具有依赖性的重编程效应（图5A–E）。UpSet分析鉴定出大量Cd特异性差异表达基因（DEGs），表明Cd主导了转录扰动，而非在改良剂间广泛共享（图5A）。代谢组学呈现类似的"核心与特异性"模式，表明改良剂重塑而非简单恢复了Cd诱导的代谢状态（图5B）。

图5. 根部整合转录组和代谢组学分析。（A）不同比较间差异表达基因（DEGs）的UpSet图。（B）不同比较间差异代谢物的韦恩图。（C）DEGs（左）和差异代谢物（右）的KEGG富集分析；红色虚线分隔转录组（左）和代谢组（右）结果。（D）DEGs火山图。（E）差异代谢物火山图。G和S分别代表GOSP和SOSP；"_R"表示根部样本。

KEGG富集分析揭示了跨组学在苯丙烷相关过程上的汇聚（图5C），同时还包括转录层面的应激相关通路（MAPK信号、谷胱甘肽代谢、激素信号和ABC转运体）以及代谢物层面的碳和氨基酸代谢。火山图进一步显示，在Cd胁迫下SOSP诱导的转录变化范围比GOSP更广（S_R对Cd_R：上调3619个、下调1562个；G_R对Cd_R：上调1373个、下调497个），S_R对G_R确认了改良剂间的分化（图5D）。重要的是，代谢组学变化呈现相同趋势（图5E）。

3.6. 在Cd胁迫下SOSP通过协调木质化强化根细胞壁屏障

根木质化和细胞壁超微结构对Cd胁迫和牡蛎壳改良剂均呈强烈响应（图6）。Cd暴露使根木质素含量从87.77（±2.05）mg g?1 DW增至93.27（±1.96）mg g?1 DW，两种改良剂进一步增强了木质素沉积，SOSP效果显著更强：Cd+G1000下木质素达105.30 mg g?1 DW，Cd+S1000下达135.16 mg g?1 DW（相比单独Cd分别增加12.90%和44.92%；图6B；p < 0.05）。

图6. SOSP和GOSP对Cd胁迫下烟草细胞壁结构和木质素合成的影响。（A）透射电子显微镜（TEM）图像，显示不同处理下根细胞壁（CW）超微结构。红色箭头指示细胞壁厚度。（B）木质素含量。（C）基于TEM测量的细胞壁厚度定量。（D）整合转录组和代谢组数据的木质素合成通路总览。不同字母表示差异显著，p < 0.05（均值±SD，n = 3）。G和S分别代表GOSP和SOSP。

TEM定量显示细胞壁进行性增厚（图6A、C）。平均壁厚从0.36（±0.09）μm（CK）增至0.61（±0.13）μm（Cd），进一步增至0.80（±0.10）μm（Cd+G1000）和0.98（±0.14）μm（Cd+S1000）（图6C；p < 0.05），表明SOSP的壁增厚效果强于GOSP，这与pH/Ca升高与木质素积累和壁增厚之间的正相关一致（图S6B）。高分辨TEM图像支持这些趋势：Cd暴露诱导增厚但壁不均匀，可见不规则的电子致密沉积；GOSP产生更连续的增厚并减少了质外体空间；SOSP生成的壁最厚且最致密，电子密度更均一，细胞间隙明显缩窄（图6A）。

多组学整合进一步揭示了通路层面的木质素中心化强化作用（图6D）。

与单独Cd处理相比，GOSP部分恢复了苯丙烷-木质素通路的连续性，而SOSP促进了从上游起始步骤（PAL/C4H/4CL）到单体木质醇合成（CCR/CAD）再到聚合（POD/LAC）的协调调控，并伴随苯丙烷相关代谢物的一致性变化（图6D）。综合而言，图6A-D表明SOSP通过协调木质化增强了根部细胞壁屏障，这与木质素含量升高、细胞壁增厚以及更加致密的超微结构相一致。

3.7 SOSP介导缓解烟草Cd毒性的机制提出

基于上述结果，总结了一个综合机制方案（图7），用以说明与GOSP相比，SOSP如何在烟草中缓解Cd毒性。该模型突出了两条偶联途径。首先，土壤Cd固定：SOSP提高土壤pH和Ca有效性，驱动Cd从较活跃的生物有效性较高的组分向生物有效性较低/固定组分转化，从而降低Cd向根部的供应。其次，根部屏障增强与生理恢复：SOSP促进苯丙烷通路向木质素沉积的方向重编程，导致细胞壁木质化/增厚，从而加强质外体屏障并限制Cd吸收，进而降低地上组织的Cd积累。该示意图整合了研究中识别出的土壤-植物联系，并总结了SOSP相对于GOSP的优越保护效应。

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图7. SOSP介导缓解烟草Cd植物毒性的提出机制示意图。与GOSP相比，SOSP通过土壤-根部的偶联机制减轻Cd毒性。首先，在土壤/材料层面，SOSP增强了材料级别的Cd固持能力，并提高土壤pH和Ca有效性，从而将Cd从交换态向不活跃组分转移，降低Cd向根部的生物有效性。其次，在根部层面，SOSP促进Cd在细胞壁相关组分中的固定，并诱导苯丙烷通路重编程，导致木质素积累和细胞壁增厚。这些变化加强了根部质外体屏障，限制Cd吸收和根向苗的转运。

4. 讨论

在Cd暴露下，植物生物量积累受到显著抑制，这主要是由于Cd2?对光合装置的负面影响。升高的Cd2?水平破坏叶绿体超微结构，抑制光系统II性能——表现为Fv/Fm下降——并干扰Calvin循环的关键酶。这些效应损害RuBP再生并破坏碳同化效率，最终降低净光合速率[27],[28],[29]。

尽管两种牡蛎壳材料均缓解了Cd诱导的生长抑制，但SOSP明显比GOSP更有效。两种材料效果差异主要可归因于它们对植物体内Cd积累的对比影响。由于其独特的理化性质，SOSP更高效地在土壤中固定/钝化Cd2+并改变植物结构特征，从而减少Cd吸收和内部Cd负载。这种解毒作用有望缓解Cd对光合电子传递和碳同化的限制，而后者被广泛认为是高等植物中Cd毒性的主要生理靶标[30]。

4.1 土壤化学固定降低Cd生物有效性

Cd生物有效性主要由土壤pH和Cd形态决定[31]。碳酸盐基和生物源Ca丰富的改良剂可以通过直接固持Cd以及促进Cd从活跃的可交换态和可还原态向不活跃的可氧化态和残留态转化来降低Cd有效性，从而减少土壤-根部界面处可供Cd的供应[32]。当前结果表明，SOSP表现出明显强于GOSP的固定能力。具体而言，与单独Cd处理相比，SOSP将可交换态（EXC）Cd降低了66.68%，而G1000仅实现了19.94%的降低。

在材料层面，SOSP的更强效果可部分归因于粒径依赖的反应活性。尽管GOSP和SOSP均源自牡蛎壳，但机械微粉碎将SOSP的平均粒径减小至亚微米范围，并产生了粗糙、有纹理的颗粒。这种粒径细化可能增加了牡蛎壳与Cd溶液或土壤溶液之间的有效接触，从而促进了涉及Cd固持的界面反应。为进一步验证材料本身能否直接固持Cd，我们使用GOSP和SOSP进行了批次Cd去除试验。两种材料均以剂量依赖方式降低了水溶液中Cd浓度，证实牡蛎壳粉可直接从溶液中去除Cd。在相同剂量下，SOSP通常表现出比GOSP更高的Cd去除效率，尽管两种材料之间的差异相对温和（图S7）。这些结果支持直接Cd固持作为牡蛎壳粉降低Cd生物有效性的一个贡献机制。然而，批次系统中GOSP与SOSP之间的适度差异也表明，SOSP在土壤中的更强固定效果不能仅由直接Cd去除来解释。

提高土壤pH可以通过减少H?与土壤有机质和Fe/Mn氧化物上带负电结合位点的竞争来直接抑制Cd移动性，同时促进表面羟基和羧基的去质子化，从而增强Cd吸附。来自农业土壤的最新证据进一步表明，高pH含碳酸盐的土壤维持了明显较低的孔隙水Cd，因为Cd被有机质和氧化物矿物更强地固持并可被纳入碳酸盐晶体结构中[33]。一致地，牡蛎壳-凹凸棒土改良剂提高了酸性农业土壤的pH并促进了稳定的含Cd碳酸盐相的形成，导致可交换态Cd持续下降[34]。类似地，产生最大土壤pH增幅的改良剂将Cd从水溶性和可交换池向Fe/Mn氧化物相关和残留组分转移，并显著减缓了其后续解吸[35]。相反，实验性土壤酸化增加了可溶性和可还原Cd组分，而碱性改良剂恢复了Cd固定并增加了残留态Cd比例[36],[37]。总之，这些发现支持这样的解读：SOSP的优越效果部分源于pH介导的Cd固定更为显著。

SOSP下土壤Ca的更大增幅可能反映了牡蛎壳来源的CaCO?更广泛的溶解和界面反应。除了作为改良剂反应活性的指标外，Ca可能同时在土壤和根部界面贡献于Cd缓解。方解石表面可以直接通过吸附固持Cd，而Cd2?也可以通过部分替代Ca2?被纳入或共沉淀于Ca-碳酸盐相中，从而促进其向不活跃形式转化[38],[39]。最近的土壤-植物研究进一步表明，即使土壤pH变化有限，增加Ca供应也能限制Cd吸收。CaCO?施用通过土壤-植物系统中的Ca-Cd拮抗作用减少了水稻中的Cd吸收和转运[40]，而高Ca供应减少了桑树的净Cd2?流入并抑制了根部Cd吸收[41]。因此，SOSP下更高的Ca有效性可能通过增强土壤中碳酸盐相关的Cd固持和减少根部表面的Cd获取来补充pH介导的固定作用。

总体而言，SOSP下土壤pH和Ca有效性的同步增加伴随着可交换态Cd的显著下降和向不活跃Cd组分转变（图3E），表明pH调节和Ca-碳酸盐反应以偶联方式共同降低了土壤Cd生物有效性。

4.2 根部屏障强化增强Cd固定

根部细胞壁是限制Cd转运和进入代谢活跃细胞区室的最重要生物屏障之一。果胶和半纤维素含有丰富的带负电功能基团，可以吸附和固定Cd2?，而结构聚合物沉积的增加扩大了壁基质并增强了其整体Cd固持能力。最近的研究表明，果胶脱甲基酯化增加通过暴露额外的羧基促进Cd结合，而半纤维素丰度增加和细胞壁增厚增强了根部Cd固定[10],[11],[42]。在水稻中的直接原位成像进一步证实，Cd2?被半纤维素静电固持并大量积累在表皮和中柱鞘组织的细胞壁中[43]。功能证据还表明，SpbZIP60激活的细胞壁增厚减少了Cd进入根部细胞并增强了Cd耐受性[44]。与这些机制一致，TEM观察显示SOSP使根部细胞壁增厚了60.38%，而亚细胞分馏显示与细胞壁组分相关的根部Cd比例从52.59%增加到72.09%。

除了增加细胞壁保留Cd的化学和结构能力外，木质化还可以限制Cd通过根部质外体的径向移动。局部木质素沉积在表皮形成凯氏带并在外皮层形成木质化屏障，这些中断了连续的质外体扩散并迫使溶质在选择性调控的质膜之前穿过才能进入维管柱。水稻中的比较研究表明，更早更强的凯氏带和亚角质层发育限制了Cd向维管柱的转运，而屏障形成的延迟增加了径向Cd转运和苗部积累[45]。类似地，增强的表皮木质化和凯氏带发育减少了辣椒根部Cd向维管柱的流入，如超微结构观察和单细胞转录组分析所示[46]。过氧化物酶介导的木质素聚合也被证明促进了表皮和外皮层中凯氏带的形成并抑制了水稻中的Cd吸收和积累[47]。在Kandelia obovata中，miR397调控的漆酶协调了根部外皮层的木质素聚合，提供了额外的Cd吸附和转运阻断屏障[48]。在本研究中，SOSP使根部木质素含量增加了44.92%。这一结果为加强根部质外体屏障、限制Cd进入维管柱和后续的木质部装载，并最终减少Cd向苗部的转运提供了合理的依据。

屏障强化的基本驱动因素在于恢复和增强苯丙烷-木质素生物合成通路。在Cd胁迫下，该通路通常面临通量限制和木质素单体供应不足的问题[36],[37],[49]。本文的综合多组学分析表明SOSP逆转了这一限制。与单独Cd处理相比，SOSP协调上调了参与通用苯丙烷通路起始（PAL和C4H）、单体木质醇生物合成（CCR和CAD）以及氧化聚合（POD和LAC）的基因，这些是木质素形成的关键酶步骤[47]。代谢组学分析进一步显示关键中间体（如肉桂酸和咖啡酸）的恢复积累以及下游木质素单体（G型和S型）的增加。综合来看，这些结果表明SOSP将碳通量重新导向木质素生产，为组织木质化提供了前体。

总体而言，SOSP通过协调的化学、结构和代谢强化增强了根部Cd固定。这种响应促进了Cd在根部质外体中的固定，减少了Cd进入代谢活跃细胞区室，并限制了其径向转运和向地上组织的后续输送。

4.3 环境相关性、研究范围和未来验证

本研究被设计为机制性概念验证研究，以确定粒径细化是否增强了牡蛎壳粉的Cd缓解能力，并阐明相关的土壤-根部机制。所设计的受控Cd胁迫系统旨在产生稳定可重复的Cd胁迫表型，从而为比较GOSP和SOSP并阐明相关的土壤和根部机制提供适当的实验窗口。在这一范围内，结果表明具有亚微米平均直径的微粉碎牡蛎壳粉通过涉及土壤Cd固定和根部细胞壁屏障强化的偶联机制缓解Cd植物毒性。

在将SOSP应用于田间规模之前，需要进一步的验证。本实验使用了人工添加Cd的土壤和较短的植物暴露期；因此，研究结果代表的是机制性证据，而非田间规模有效性或长期稳定性的直接证明。此外，BCR衍生的Cd组分被用作操作指标来比较相同条件下处理诱导的Cd重新分配，而非田间规模移动风险的绝对预测值，因为BCR基于的风险指数在某些土壤条件下可能高估重金属的移动性[6],[7],[50]。在自然污染土壤中，Cd老化、矿物结合、有机质络合、微生物过程、土壤再酸化、干湿循环、根分泌物以及材料老化可能影响Cd的重新动员和改良剂性能。最近的稳定化研究已纳入固定后释放测试，如模拟酸雨淋溶，以评估环境干扰下固定Pb/Cd的耐久性[51]。因此，未来的SOSP研究也应纳入类似的稳定性导向评估。

未来工作应进一步优化不同Cd浓度梯度、不同土壤类型、自然污染土壤、完整生长周期以及田间条件下的SOSP施用量。特别应注意平衡Cd固定与作物特异性pH需求，并评估SOSP是否能持续减少可食用作物或其他经济重要植物中的Cd积累。当较大的多土壤和长期数据集可获得时，数据驱动的方法，包括机器学习和人工智能模型，也可能有助于预测改良剂性能、Cd重新动员风险以及土壤条件依赖性稳定化效率[52],[53]。

5. 结论

总体而言，SOSP作为一种粒径细化的牡蛎壳废物改良剂，通过顺序性土壤-根部机制减轻了Cd植物毒性。

首先，粒径细化增强了牡蛎壳粉的活性，促进了材料对镉的直接固定，并推动了土壤镉的固持作用。该过程降低了交换态镉含量，促使其向难迁移形态转化，从而减少了根系可利用的镉供应，进而降低了根系总镉积累量。其次，在进入根系组织中的镉中，SOSP促进其优先保留在细胞壁结合态中，并通过木质化和细胞壁增厚强化了根细胞壁结构，从而限制了镉进入代谢活跃区室及后续向地上部的运输。这些发现从机制上证明了粒径细化能够通过整合材料层面的镉固定、土壤镉固持以及根屏障强化，将牡蛎壳废弃物用于镉胁迫缓解。要将这一机制转化为实际应用，未来工作应在自然污染土壤、完整生长周期、不同田间条件以及可食用作物或复合污染情景下验证SOSP的效果。

**CRediT作者贡献声明**

李 张：撰写——初稿。刘 鹏：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、经费获取。王凯迪：撰写——初稿、可视化、概念化。毕梦宇：可视化、方法论。钱 通：调查研究、形式分析。刘智国：可视化、概念化。杨 龙：撰写——审阅与编辑、监督、经费获取、数据整理。周育松：撰写——初稿、调查研究、形式分析、数据整理、概念化。Jason C. White：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、概念化。

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