氢辅助的不饱和全氟羧酸的生物脱氟作用

《Journal of Hazardous Materials》：Hydrogen-Supported Biodefluorination of Unsaturated Perfluorinated Carboxylic Acids

　　**摘要**
(E)-全氟(4-甲基戊-2-烯酸)（PFMeUPA）是一种不饱和的全氟己酸，因其可能引起发育毒性而受到关注。本文研究了在缺氧条件下使用氢（H2）作为唯一电子供体的可持续生物处理方法，探讨了其降解潜力及连续流动反应器的动态过程。在批次实验中，加入厌氧消化污泥后，一种富集的氢化细菌群落能够在90天内几乎完全去除50 μM的PFMeUPA，并释放出125 μM的氟离子（F-），相当于每个分子中有两个C-F键被断裂，脱氟率为26%。基于氢的膜生物膜反应器（H2-MBfR）在连续运行130天后，实现了5 μM PFMeUPA的100%去除，并且脱氟率达到20%，其水力停留时间（HRT）为6小时。高分辨率质谱分析表明，转化产物主要为还原脱氟产物，后期则出现氢化副产物。宏基因组学结果显示，参与该过程的微生物群落主要包括Hydrogenophaga（hp_bin.22）和Azonexus（hp_bin.19），它们携带氢代谢基因（hoxH）和氟离子外排泵基因（crcB）。这项研究证明了氢支持的生物处理方法可用于受污染水中不饱和全氟羧酸的去除。

**摘要（中文简化版）**
(E)-全氟(4-甲基戊-2-烯酸)（PFMeUPA）是一种不饱和的全氟羧酸，因其潜在的发育毒性而备受关注。本研究通过氢气作为唯一电子供体，在缺氧条件下探讨了其生物处理的可行性，分析了其降解过程及反应器动态。实验发现，富集的氢化细菌群落能够在90天内几乎完全去除50 μM的PFMeUPA，并产生125 μM的氟离子，脱氟率为26%。基于氢的膜生物膜反应器在连续运行130天后，PFMeUPA的去除率达到100%，脱氟率为20%。质谱分析显示，转化产物主要为还原脱氟产物。

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**提示**
- 本文使用了复杂的化学术语和实验方法，建议阅读时结合相关领域背景知识。
- 文中多次提到“氢化细菌群落”和“宏基因组学”，建议查阅相关生物学手册以理解这些概念。
- 数据分析和图表较多，建议使用数据可视化工具辅助理解实验结果。通过使用密封注射器刺穿橡胶塞，采集了100微升的顶空间气体样本，并手动注入气相色谱仪（GC 8860，Agilent，美国）。该色谱仪配备有CP-Molsieve柱（25米×0.33毫米×50微米，CP7538）和热导率检测器（TCD）。氮气作为载气，压力保持在5.4巴（流量：0.014立方米/天）。注射器、柱子和检测器的温度分别设置为120摄氏度、145摄氏度和150摄氏度。分析级氢气用于校准和实验。硝酸盐浓度通过离子色谱（Dionex ICS-1000，Thermo Fisher Scientific，美国）测定，使用AS 11分析柱和AG 11保护柱。洗脱液为15毫摩尔/升的KOH，流量为1.0毫升/分钟，检测限为50微克/升。

2.6. DNA提取
在第40天，当脱氟反应活跃时，从HP、HN、HNP和ArP处理的接种物中收集了大约1.5克的沉淀物。根据制造商的协议，使用QIAGEN RNeasy PowerSoil Total DNA Kit从这四个样本中提取微生物DNA。此外，在第0天和第130天，从H2-MBfR上刮取生物膜样本，使用QIAGEN DNeasy PowerSoil Kit进行DNA提取。所有提取的核酸的浓度和质量最初使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）进行评估。

2.7. 16S rRNA测序
使用引物338 F/806 R扩增来自批次反应器的DNA，并在Illumina MiSeq系统上进行测序（2×300 bp）。原始序列使用DADA2在QIIME2中进行分析，通过质量控制、去噪和去除嵌合体等步骤生成扩增子序列变异体（ASVs）。使用Na?ve Bayes分类器和SILVA 138.2 16S rRNA数据库将ASVs进行分类，置信阈值为0.8。

2.8. 元基因组测序与分析
如上所述，从HNP、HP、HN和ArP中提取的DNA用于使用Illumina TruSeq DNA Nano Library Prep Kit制备文库。文库在Illumina HiSeq X平台上进行测序（2×150 bp），每个样本产生7680万到10820万条读数。所有测序数据存放在Sequence Read Archive（SRA）中，BioProject访问号为SUB15332846。使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）评估原始数据质量，并使用Trimmomatic（版本0.38）根据默认参数修剪或删除低质量读数。质量控制后的读数分别组装并使用MEGAHIT组装成 contigs。排除长度小于500 bp的contigs，然后使用Metabat和CheckM2对合格的contigs进行分组，并评估元基因组组装基因组（MAGs）的质量。通过将质量过滤后的读数映射到长度大于500 bp的contigs来计算MAGs的相对丰度，使用BBmap（https://sourceforge.net/projects/bbmap/）。开放阅读框（ORFs）使用Prodigal v2.6.3预测，并使用EGGNOG-mapper（63）和HMM搜索（64）、DIAMOND比对（65）以及MMseq2（66）与eggNOG数据库进行注释。基于基因组的分析也首先使用Prodigal v2.6.3进行注释，功能注释使用Kofamscan和KOfam HMM set r02_18_2020进行预测。

3. 结果与讨论
3.1. 氢气供给生物膜的PFMeUPA脱氟稳定性
一个批次反应器接种了城市厌氧消化污泥，并与PFMeUPA一起培养，以富集氢氧化生物脱氟群落。大约50微摩尔的PFMeUPA在90天内稳定降解，释放了125微摩尔的氟离子（F-）（图1A）。PFMeUPA的消耗和F-的积累都遵循零级动力学（R2 >0.95），其速率常数分别为0.65微摩尔/天（kPFMeUPA）和1.56微摩尔/天（kF-）（图1A）。脱氟程度达到了26%，高于之前使用各种有机电子供体的相同接种物所达到的程度（11-17%），这对应于每个PFMeUPA分子大约两个C-F键的断裂。

3.2. 批次实验中的转化产物（TPs）谱型
使用LC-QTOF/MS在批次反应器和不同的批次实验中鉴定了PFMeUPA的转化产物（TPs）（表S2）。在批次反应器中，PFMeUPA的消耗伴随着四种主要TPs的依次出现：TP256（C6F8H2O2）、TP276（C6F9H3O2）、TP238（C6F7H3O2）和TP259（C6F8H4O2），这一点通过质量和ms/ms碎片得到证实（表S4）。如图2A所示，TP276在42天之前增加，然后达到平台期。TP256的强度在前32天内升高，随后TP259和TP238的积累增加。这种时间顺序表明PFMeUPA经历了逐步转化，其中TP256和TP259是还原脱氟的中间体。值得注意的是，TP238的结构被鉴定为4,5,5,5-四氟-4-(三氟甲基)-2-戊烯酸（FTMeUPA，C6H3F7O2；CAS 243139-64-2，表S4），其一级置信度通过匹配保留时间、高分辨率前体质量（m/z 238.9956，<3 ppm误差）和ms>2得到确认，表明作为主要电子供体的H2成功驱动微生物群落向更深层次的、多步骤的脱氟途径转化。

3.3. 长期脱氟性能和途径
为了评估稳定性，连续运营了一个H2-MBfR超过130天，分为三个运行阶段（图3A）。在第一阶段（第0-50天），反应器在大约5微摩尔的PFMeUPA浓度下运行，同时水力停留时间（HRT）逐步从48小时减少到24小时，最后到12小时。在整个第一阶段，PFMeUPA的去除效率（橙色菱形）迅速稳定在接近100%。在第二阶段（第51-90天），HRT压缩到6小时，PFMeUPA的进料浓度逐步增加（5、10和15微摩尔），以评估反应器的容积容量。系统成功耐受了5微摩尔和10微摩尔的转换（约100%的去除率）。然而，在第75天，当进料浓度增加到15微摩尔时，出现了明显的性能瓶颈。这种增加的质量负荷超过了生物膜的动态容量，导致底物突然突破（流出PFMeUPA浓度约为6微摩尔），使去除效率下降到70-75%。同时，脱氟百分比骤降至研究的最低水平，约为5%。这一急剧下降清楚地表明，在基线H2供应下存在底物过载和电子供体的限制，这为在第三阶段增加H2供应压力以恢复脱氟动力学提供了理由。这一调整引发了反应器性能的显著变化：流出物中的氟离子浓度从大约5微摩尔稳步上升，峰值超过14微摩尔。这一发现清楚地表明，连续的深度生物脱氟高度依赖于氢气分压，它提供了必要的还原当量来克服碳-氟键断裂的高激活能。

3.4. 生物脱氟过程中氢营养型氟耐受细菌的富集
在接种了H2和PFMeUPA的批次反应器中，经过90天的培养后，微生物群落结构发生了变化，Hydrogenophaga（9.4%）和Hydrogenophilaceae家族的其他成员（28.7%）成为优势种（图S5）。然而，这种分析不足以识别负责生物脱氟的细菌，因为这种富集可能是由于H2的代谢作用。因此，还对其他添加了H2的处理进行了比较宏基因组分析，以获得更多见解。这项比较分析考虑了125个中等至高质量（完整性>50%，污染<10%）的宏基因组组装基因组（MAGs）（表S5），其中13个在添加了PFMeUPA（HP和HNP）的培养条件下显著富集，而未添加PFMeUPA（HN）的条件下则没有这种富集（图4）。这些富集的MAGs分布在多个门中，其中假单胞菌门（Pseudomonadota）中的几个分类单元在外热图环中显示出最明显的丰度增加。其中一些MAGs编码了氢化酶和氟化物外排基因（hp_bin.19、hp_bin.22、co_bin.74和hnp_bin.5），使得能够利用H2，并表明具有持续细胞内脱氟所需的氟化物抗性。

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图4. 123个细菌宏基因组组装基因组中H2代谢和氟化物抗性的功能趋同。系统发育树展示了从批量处理中回收的细菌MAGs的分类学分布。同心热图表示与不含PFAS的对照组（HN）相比，暴露于PFMeUPA的组（HNP和HP）的丰度对数2倍变化。门级别的分类通过分支和叶片颜色表示。功能注释突出了关键活性分类单元中的氢化酶（红星）和crcB氟化物外排蛋白（粗体文本）的共定位。

在观察到最高脱氟率的HP培养条件下，高度富集的微生物是Azonexus（hp_bin.19，18.1%）和Hydrogenophaga（hp_bin.22，2.8%）（图5）。比较所有四种处理条件（HP、HN、HNP和无H2的对照ArP）下的相对丰度，hp_bin.19和hp_bin.22在HP条件下显示出最大的相对丰度，在ArP中仅占少量。这种模式与我们的独立生物转化实验结果一致，在没有H2的情况下，脱氟现象无法检测到，这提供了基因组层面的证据，表明这些分类单元的富集依赖于H2，而不仅仅是由PFMeUPA单独驱动的。作为兼性化能自养菌，Hydrogenophaga通常将H2氧化与氧气或硝酸盐还原结合起来[69]。然而，我们的数据显示，这一属在HP（H2 + PFMeUPA）处理条件下的富集程度高于含有硝酸盐的处理条件（HNP和HN）。考虑到Hydrogenophaga的反硝化能力，这种分类学变化值得注意。我们推测，Hydrogenophaga在HP组中的富集部分是由于PFMeUPA或其不饱和中间产物作为替代电子受体所致。在缺乏硝酸盐的情况下，该群落似乎利用PFMeUPA来消耗还原当量，从而推动生物脱氟。尽管如此，我们的数据不足以确定还原脱氟是呼吸作用还是合成代谢过程，在这种情况下，PFMeUPA可能被用作电子受体，例如用于再生还原型辅酶。

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图5. 在Hydrogen + PFMeUPA（HP）处理条件下富集的关键功能性MAGs的相对丰度和分类学分布。在最优越表现基因组中，钢括号标出的MAGs含有crcB氟化物外排蛋白，表明其具有细胞内脱氟所需的卤素抗性基因。右侧y轴提供了最低可识别等级的详细分类学分配。

Hydrogenophaga可能不是单独发挥脱氟作用的，而是作为合作性的、群落级别的代谢网络的一部分。不饱和C–F键的还原脱氟需要低氧化还原电位和专门的电子传输系统。Hydrogenophaga主要可能作为一种高效的氢 scavenger（捕获氢气的微生物），利用其[NiFe]-氢化酶氧化H2并生成高能量的还原当量（NADH或还原型铁氧化还原蛋白）或代谢辅因子（如corrinoids/cobalamin）。这些还原当量或辅因子随后可以通过共营养的交叉喂养或种间电子转移与共存的群落成员（例如Azonexus或其他富集的MAGs）共享。反过来，这些伙伴微生物或联盟中的未注释的新还原酶/脱卤酶利用这些电子供体来催化PFMeUPA活泼的??,??-不饱和骨架上的C–F键的还原断裂。值得注意的是，Hydrogenophaga也被生物信息学方法推断为含有卤酸脱卤酶基因（HAD，EC 3.8.1.2）[70]，这些基因可能使氟化副产物能够通过水解降解，利用水中的亲核攻击将氟原子替换为氢氧基团[10]，[71]，作为一种潜在的补充途径。

在第0天和第130天对H2-MBfR进行的宏基因组分析进一步证实了Hydrogenophaga在生物脱氟中的潜在作用（图6）。在门级别上，含有Hydrogenophaga的假单胞菌门（Pseudomonadota）从第0天到第130天的相对丰度增加，同时放线菌门（Actinomycetota）和芽孢杆菌门_B（Bacillota_B）也有适度增加（图6A）。在回收的MAGs中，属于Hydrogenophaga属的基因组（被认为是驱动氢支持脱氟的候选基因组）显示出明显的富集。具体来说，S_bin.9（Hydrogenophaga sp. sp021166755）和M_bin.41（Hydrogenophaga）的相对丰度都有显著增加（图6C，用粗体文本突出显示），同时还有其他共富集的分类单元，包括Desulfotomaculum（M_bin.4）、Anaerosomatales SKKZ01（M_bin.14）和Methanobacterium_D（M_bin.2），这表明在130天的富集过程中，群落向利用H2的厌氧分类单元转变。我们还量化了hoxH和crcB基因的总丰度（以每百万转录本计，TPM）（图6C）。这两个基因的丰度从D0天增加到第130天（hoxH：约4倍；crcB：约1.6倍）。这种氢化酶活性和氟化物抗性的同步增加反映了整个群落对持续氢驱动脱氟和氟化物通量增加的适应。

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图6. 在长期运行期间H?-MBfR生物膜中的微生物群落演替和核心功能基因丰度动态。(A) 微生物群落在门级别的相对丰度；(B) 运行130天前后高丰度宏基因组组装基因组（MAGs）的演替；(C) 编码双向氢化酶（hoxH）和氟化物外排蛋白（crcB）的功能基因的TPM。

3.5. 环境影响

本研究展示了使用H2作为电子供体对全氟羧酸PFMeUPA进行还原脱氟的过程，并确定Hydrogenophaga spp.为潜在的脱氟剂。通过成功地富集一个能够切割强C–F键的氢驱动微生物群落，我们实现了26%的脱氟效率，相当于每个分子去除两个氟原子。将该群落整合到连续膜生物膜反应器（MBfR）中，能够在6小时的短处理时间（HRT）内实现不饱和PFAS的去除，并同时回收氟化物。这些发现提供了一种有前景的、能源高效的生物催化策略，用于破坏性处理水中的不饱和PFAS污染，超越了单纯的隔离方法。Hydrogenophaga（hp_bin.22）和Azonexus（hp_bin.19）中同时存在[NiFe]-氢化酶和氟化物外排转运蛋白，突显了一个潜在的生物信息学网络，用于处理含氢的有机氟化合物。这一机制洞察可能为开发和优化针对不饱和PFAS的生物工艺铺平道路。

**意义声明**

我们证明了由H?供给的生物膜能够驱动支链PFMeUPA的还原脱氟——这是一种关键的环境污染物。宏基因组分析显示，Hydrogenophaga中氢化酶、卤酸脱卤酶和氟化物外排基因的同时上调与碳-氟键的断裂独特相关。我们将这一基因特征确定为生物脱氟潜力的首个预测性生物标志物。这项工作超出了单纯的PFAS吸附或降解副产品的范围，为监测和增强受影响地下水系统中PFAS的生物修复建立了生物学框架。

**作者贡献声明**

Pedro Alvarez：撰写 – 审稿 & 编辑，撰写 – 原始草稿
Qiu-Jin Xu：撰写 – 审稿 & 编辑，撰写 – 原始草稿，方法学，研究，数据管理
He-Ping Zhao：撰写 – 审稿 & 编辑，撰写 – 原始草稿，监督，项目管理，方法学，资金获取，概念化
Yi-Fei Zheng：撰写 – 审稿 & 编辑，撰写 – 原始草稿
Matthew Sima：撰写 – 审稿 & 编辑，撰写 – 原始草稿
Xin-Rui Liu：撰写 – 审稿 & 编辑，撰写 – 原始草稿，研究

**作者列表**

浙江省大学土壤污染控制与安全国家重点实验室，杭州，中国