单核转录组图谱分析揭示大豆根尖对铝胁迫的细胞类型特异性反应

《Journal of Hazardous Materials》：Single-nucleus transcriptomic profiling reveals cell type–specific responses of the soybean root tip to aluminum stress

　　

摘要：土壤酸化导致的铝（Al）毒害是制约作物生产力的主要因素之一。尽管根尖是铝感知和适应性重塑的主要部位，但细胞类型分辨的长期铝暴露响应仍未得到充分表征。本研究利用单核RNA测序（snRNA-seq）技术，构建了大豆（Glycine max）根尖在铝胁迫下的细胞类型分辨转录组图谱。我们分析了总计79,201个高质量细胞核，并鉴定了九种主要根细胞类型。研究结果表明，铝胁迫在细胞类型间引发共同的转录应答，同时重塑了根细胞类型组成。值得注意的是，表皮细胞层中细胞核的比例增加（从34.16%增加到70.41%）。相比之下，皮层细胞中细胞核数量显著减少（从40.70%降至8.53%）。有趣的是，显微观察进一步表明，与皮层细胞核减少不一致的模式区域发生了显著扩展。细胞类型特异性分析共鉴定出20,544个差异表达基因（DEGs），结果显示表皮细胞主要通过激活与运输、细胞壁加固和防御相关的转录程序来应对铝胁迫，同时伴随脂肪酸生物合成和角质层相关通路的增强。相比之下，皮层细胞表现出细胞周期相关转录程序的抑制，与其细胞丰度降低相一致，表明细胞分裂限制与皮层细胞丢失密切相关。此外，非靶向代谢组学分析支持了脂质代谢在铝胁迫响应中的重要角色。总之，本研究在单核分辨率水平上揭示了大豆根尖对长期铝胁迫的细胞类型特异性响应模式，为理解作物根系耐铝的细胞机制提供了新的见解。

1. 引言

铝（Al）是地壳中除氧和硅以外含量最丰富的金属，由于其高丰度和广泛分布，加之土壤酸化的进程日益加剧，已成为全球作物生产日益严峻的制约因素[1]，[2]。在自然条件下，铝主要以硫酸盐和硅酸盐等非植物毒性形式存在于土壤中[3]，[4]；然而，当土壤pH值降至5.5以下（酸性土壤）时，铝会溶解为土壤溶液中的离子态Al3?，从而对土壤和植物产生毒害作用[5]。作为酸性土壤中的主要限制因素，铝胁迫目前被认为是限制全球农业生产力的最重要非生物胁迫之一，仅次于干旱胁迫[6]。在实际中，根系作为首个接触铝胁迫的器官，Al3?直接靶向细胞壁和质膜等关键细胞位点[7]，导致细胞分裂受抑和根尖分生组织坏死。这些效应随后导致根系形态发生显著变化，包括主根伸长迅速受抑、侧根和根毛形成减少[8]，[9]，以及矿质营养和水分吸收运输效率降低[10]。然而，铝诱导的形态变化是否涉及细胞增殖、细胞扩展的改变或根尖细胞类型组成的变化，目前仍不清楚。在众多受铝胁迫影响的作物中，大豆（Glycine max）因其在全球食物系统中作为食用植物油和植物蛋白主要来源、动物饲料及工业原料的重要作用而尤为值得关注[11]。然而，相当比例的大豆种植区域具有广泛的酸性土壤特征，如南美洲和东南亚，在这些地区，铝胁迫对根系发育、作物产量和粮食安全构成了严重挑战。值得注意的是，大豆根系具有较高的结构可塑性和环境适应性，常根据养分供应和土壤pH等环境信号调整其形态[12]。因此，全面了解铝诱导大豆根系形态重塑的细胞过程和分子机制，对于鉴定优良根性状、培育耐铝品种以及增强铝毒条件下的韧性和产量至关重要。

根系由三个基本组织系统组成：外层表皮、中层的皮层和内皮层（同心排列），以及中柱内被中柱鞘包围的维管组织，共同构成径向对称结构[13]。越来越多的证据表明，这些基本组织间的代谢功能和空间区室化可能是植物适应金属胁迫的关键决定因素。例如，表皮细胞可通过细胞壁修饰和程序性细胞脱落有效滞留Al3?，从而构成根系抵御铝毒的第一道保护屏障[14]。同时，木质素和胼胝质在铝胁迫下特异性诱导，分别沉积于皮层细胞壁和胞间连丝中，从而在物理上限制Al3?的质外体扩散和纵向运输[15]。此外，大豆根皮层细胞中铝和镉（Cd）的区室化积累策略，进一步凸显了基本根组织在金属胁迫中的潜在作用[16]。在分子水平上，植物对铝胁迫的响应已通过常规高通量方法（如bulk RNA测序）进行了广泛研究。Ding等人鉴定了拟南芥中的一种Al3?传感器ALR1；当Al3?在胞内结合后，ALR1抑制RAE1的功能，从而促进STOP1的积累，进而激活有机酸外排相关的关键基因（如ALMTs和MATEs）以增强耐铝性[17]，[18]，[19]。类似地，大豆对铝胁迫响应的bulk RNA-seq分析表明，铝毒害响应性差异表达基因（DEGs）主要富集于细胞壁生物合成与修复、氧化还原循环以及ATP结合盒（ABC）转运蛋白相关通路[20]。此外，包括GmWRKY81[21]、GsMYB10[22]和GmSTOP1-3[23]在内的多个转录因子在大豆根尖的铝胁迫下特异性上调。这些转录因子通过调控有机酸外排、抗氧化响应和细胞壁修饰相关基因，限制根尖铝离子积累并改善根系生长。此外，大豆根部的磷酸化蛋白质组学分析表明，铝胁迫显著改变根尖中蛋白激酶（如CIPK23和CIPK25）和转运蛋白（如NRT2和PIP2-2）的磷酸化状态，凸显了蛋白磷酸化在耐铝性调控中的核心作用[24]，[25]。综合来看，这些研究已建立了大豆应对铝胁迫的分子网络框架，为进一步理解植物铝胁迫响应奠定了重要基础。值得注意的是，即使在同一组织中，不同细胞类型对胁迫也可能表现出高度差异化的响应。然而，常规高通量测序方法通常只能捕获组织水平的平均基因表达谱，从而掩盖了不同细胞类型间的内在异质性。此外，即使在同一细胞类型中，分化轨迹也可能存在异质性[26]，忽视这种细胞间功能分歧和动态命运转变将直接制约我们对根系铝胁迫响应复杂性的理解。因此，迫切需要构建高分辨率、细胞类型和区域分辨的大豆根尖表达图谱，以阐明铝胁迫响应中的细胞类型特异性转录异质性和分化轨迹的潜在差异。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq）分别依赖于原生质体分离和单核捕获，显著提高了常规高通量测序在时空分辨率方面达到单细胞水平的能力。这些技术不仅能够解析单个细胞的转录特征，还能捕捉对外部信号响应的动态转录变化，从而揭示细胞间调控网络以及bulk转录组分析难以解析的细胞命运和器官发育轨迹。由于snRNA-seq不需要酶解细胞壁，样品制备通常更为简便且不具破坏性[27]。近年来，这些技术已被广泛应用于研究植物在各种非生物胁迫（包括盐胁迫[26]、[28]、热胁迫[29]、[30]、干旱[31]和机械扰动[32]）下的细胞动态。值得注意的是，在土壤物理胁迫下，水稻根细胞表现出差异化的转录重编程，外层细胞在细胞壁重塑和防御相关通路上变化显著。这一观察结果表明，根系可能通过调节不同细胞类型的比例和功能状态来适应恶劣环境[32]，[33]。单细胞技术最近推进了我们对金属离子胁迫下细胞类型分辨调控网络的理解。例如，对暴露于镉的景天（Sedum alfredii）叶片进行单细胞转录组分析，发现不同细胞群体中金属转运蛋白基因（包括CAX5、COPTS和ZIP5）的表达特征存在差异[34]。类似地，辣椒根尖的高分辨率单细胞图谱定位了内皮层作为硼诱导木质素基因赋予增强耐镉性的特异性细胞位点[35]，[36]。值得注意的是，在大豆中，涵盖叶片、茎、根和结节点的高分辨率单细胞图谱已经生成，实现了系统性的细胞类型注释并鉴定了大量标记基因[37]，[38]，[39]。这些开创性研究为解析大豆对非生物胁迫的细胞类型特异性响应奠定了坚实基础。然而，尽管单细胞技术具有精确性和价值，其在金属离子胁迫中的应用仍然有限。特别是，大豆根尖对铝胁迫的单细胞水平细胞类型分辨响应尚未得到阐明。

在本研究中，我们采用snRNA-seq技术系统表征了大豆根尖对铝胁迫的细胞类型特异性响应。我们生成了包含79,201个高质量细胞核的高分辨率单核转录组图谱，并鉴定了9种主要根细胞类型。通过谱系信息的表达模式分析，我们 delineated 了大豆应对铝胁迫的细胞类型特异性基因表达程序和关键调控通路，从而为铝毒性和根细胞异质性提供了分子层面的见解。

2. 材料与方法

2.1 大豆生长条件及根尖单核分离

健康大豆种子经表面消毒、去离子水充分冲洗后，在25°C暗处萌发3天，期间每日补充蒸馏水以保持湿润。选择生长均匀的幼苗，转移至含有25%浓度无铝霍格兰营养液的15升塑料容器中。待真叶出现后，将生长一致的植株在含0.5 mM CaCl?（pH 4.3）的溶液中预处理1天。随后，将幼苗随机分为对照组（CK：0.5 mM CaCl?，pH 4.3）和铝处理组（Al：0.5 mM CaCl?补充50 μM AlCl?，pH 4.3）。在本研究中，我们将长期铝胁迫定义为连续暴露3天，这足以诱导持续的转录和发育重编程，而非早期信号事件。所有植株在25 ± 1°C、16小时光照/8小时黑暗的 controlled 光周期下在人工气候室中培养，营养液每两天更换一次。处理3天后，切除约0.5 cm根尖组织并收集用于后续snRNA-seq分析[40]。

根尖样品在冰上快速切碎并轻柔匀浆，然后转移至预冷的核分离缓冲液中[41]。匀浆物在4°C下以300 × g离心1分钟，上清液依次通过70 μm和40 μm细胞滤器去除组织碎片。随后在4°C下以2000 × g离心5分钟收集细胞核，并重悬于洗涤缓冲液（10 mM PBS，1% BSA，2 U/μL RNase抑制剂）中。经4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后，基于核大小和荧光强度通过流式细胞术排除细胞核聚集体和碎片[42]。最终单核悬液调整至1000–2000个核/μL的浓度，并在冰上保存直至构建snRNA-seq文库。

2.2 单核RNA测序文库构建与测序

单核RNA测序文库按照制造商的标准方案使用Chromium Single Cell 3′试剂试剂盒（10x Genomics）构建。简要而言，将单核悬液调整至适当浓度并加载至Chromium微流控芯片上，单个细胞核与编码凝胶微珠一起包裹形成乳液包封的微珠（GEMs）。在每个GEM中，进行核裂解和反转录，期间核RNA转录本被标记上核特异性条形码和唯一分子标识符（UMIs）。

所得的带有分子条形码的cDNA随后经过纯化和扩增，构建了带有Illumina测序接头的3′端转录组文库。文库质量和片段大小分布采用Agilent Bioanalyzer 2100系统进行评估，以确保满足测序要求。合格的文库在Illumina NovaSeq 6000平台上以10x Genomics推荐的配对末端模式进行测序（Read 1：26 bp，用于细胞条形码和UMI；Read 2：98 bp，用于转录本序列），从而确保足够的测序深度和敏感性以进行单细胞核转录组分析。原始snRNA-seq测序数据已存入NCBI序列读取档案（SRA），登录号为PRJNA1481788。

2.3. 单细胞核RNA-seq原始数据处理和质量控制

原始测序数据首先使用Cell Ranger流程（v6.1.2，10x Genomics）进行样本解复用、条形码处理和转录本定量[43]。测序reads比对至G. max参考基因组（Glyma.Wm82.a4.v1），在比对和计数过程中启用了内含子reads，以适应snRNA-seq数据的特征。Cell Ranger生成的基因–细胞核计数矩阵用于下游分析。后续数据处理在R环境中使用Seurat包（v4.0.0）完成。质量控制步骤用于筛选高质量细胞核，保留每个细胞核检测到200–8000个基因且独特分子标识符（UMI）数为12,000–40,000的细胞核[44]。为尽量减少多聚体对下游分析的影响，使用DoubletFinder（v2.0.3）识别并去除潜在的doublets。经质量过滤后，保留的细胞核使用Seurat标准流程进行归一化，并基于前2,000个高变异基因进行数据缩放，为后续的降维和细胞核聚类分析奠定基础。

2.4. 细胞聚类和细胞类型鉴定

细胞聚类使用Seurat包完成。首先对基因–条形码矩阵进行主成分分析（PCA）以进行特征选择，并使用前30个主成分以0.5的分辨率参数进行细胞聚类。为了在二维空间中可视化细胞群，同时使用了t分布随机邻域嵌入（t-SNE）和均匀流形逼近与投影（UMAP）。每个细胞群的特异性表达基因（DEGs）采用以下标准进行鉴定：P ≤ 0.01，log?FC ≥ 0.36，且在对应群中至少25%的细胞中表达。细胞类型注释通过整合先前报道的G. max根组织标志基因[37]、[38]、[39]以及拟南芥根尖成熟标志基因[45]、[46]进行。通过热图和气泡图展示代表性标志基因在不同细胞类型中的表达模式。出于可视化目的，由于数值下溢导致的P值为零时，在对数转换前将其替换为最小非零P值；由对照组零表达导致的无穷大log2FC值则截断为最大值。对于来自不同G. max品种（如中黄13；https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/index.jsp）和拟南芥基因组（已存于NCBI GEO，登录号GSE235495）的标志基因，使用基于BLAST的序列比对鉴定同源基因。使用Seurat按以下标准鉴定DEGs：校正后P值（P_adj）≤ 0.01，|log?FC| ≥ 1，且在对应细胞类型中至少10%的细胞中表达（pct.1或pct.2 ≥ 0.1）。

2.5. 基因功能富集和拟时间分析

基因功能富集分析使用clusterProfiler R包（v4.0）完成。在对照（CK）和铝处理（Al）之间各细胞类型中鉴定的差异表达基因（DEGs）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以探索Al胁迫下不同细胞类型相关的生物学功能。此外，使用Monocle2[47]、[48]进行拟时间轨迹分析。具体而言，将Seurat对象转换为CellDataSet对象，选择高变异基因进行细胞排序。随后使用DDRTree算法进行降维，并利用orderCells函数沿推断的轨迹对细胞进行排序。沿拟时间表现出显著表达变化的基因使用plot_pseudotime_heatmap函数进行聚类和可视化。对沿发育轨迹不同阶段相关的DEGs进一步进行GO和KEGG富集分析。

2.6. 细胞类型内加权基因共表达网络分析（WGCNA）

使用R中的WGCNA包对过滤后的CK和Al处理样本进行WGCNA分析，以结合细胞类型特异性信息来调查基因共表达模式并表征模块特异性特征。在网络构建之前，对基因进行过滤，保留在各对应细胞类型中表达稳定的基因，从而减少低表达和噪声基因的影响。基于软阈值方法构建加权邻接矩阵，软阈值幂设为14。使用动态树切割算法鉴定共表达模块，随后合并具有相似表达谱的模块。最后，计算模块特征基因与不同处理条件下细胞类型之间的Pearson相关系数及对应显著性值。每个模块中根据k-ME值排名前位的基因被定义为hub基因。

2.7. 甲苯胺蓝染色和扫描电子显微镜

G. max的栽培条件和采样时间点与第2.1节描述相同。CK和Al处理3天后，切取G. max根尖（约0.5 cm长）并立即在4°C条件下用FAA固定液过夜固定。固定后的样品经梯度乙醇系列脱水。根据Wang等人的方法[29]，使用Van-Clear作为二甲苯的环保替代品实现组织透明化。样品随后包埋在石蜡中，并切成厚度约10 μm的连续切片，粘贴于载玻片上（Fisher Scientific）。经脱蜡和复水后，切片用0.01%（w/v）甲苯胺蓝溶液（pH 4.0）染色90秒，以增强根尖细胞轮廓和细胞壁结构的可视化效果。染色后，切片快速脱水并用中性胶封片。最终，在光学显微镜下观察和成像染色切片，对不同根尖组织的结构进行比较及后续形态学分析。使用ImageJ软件基于甲苯胺蓝染色的横截面进行根解剖参数的定量分析。此外，从各处理组收集0.5 cm根尖组织用于解剖测量和扫描电子显微镜（SEM）分析。解剖测量时，根尖组织在FAA（95%乙醇：冰醋酸：福尔马林：蒸馏水=10:1:2:7，v/v）中快速固定；SEM分析时则使用磷酸缓冲液（0.1 M，pH 7.0）中2.5%的戊二醛固定。

2.8. 代谢组学分析

采集CK和Al处理组G. max根尖样品，每组设6个生物学重复。样品立即液氮速冻后保存待分析。代谢物提取、检测和初步数据处理由广州基因诺沃生物科技有限公司按照标准方案完成。代谢组学分析使用超高效液相色谱–串联质谱（UPLC–MS/MS）平台，该系统由配备HSS T3柱的Thermo Vanquish UHPLC系统连接Thermo Q Exactive HF-X高分辨质谱仪组成。代谢物鉴定通过自动搜索多个公共数据库和谱库实现，包括mzCloud、ChemSpider、KEGG和HMDB，并结合使用mzVault进行本地数据库搜索。对所有检测到的代谢物进行相对定量。首先应用主成分分析（PCA）评估整体代谢变异和生物学重复间的一致性。随后使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）区分CK和Al处理样品之间的代谢谱。基于以下标准鉴定差异积累代谢物（DAMs）：变化倍数（FC）≥ 2或≤ 0.5，且变量重要性投影值（VIP）≥ 1。将鉴定到的DAMs映射至KEGG数据库进行通路注释和富集分析，以表征Al胁迫下大豆根尖的代谢重编程。

3. 结果

3.1. Al胁迫下G. max根尖单细胞核转录组图谱的构建

为表征Al胁迫下G. max根尖的转录图谱，对CK和Al处理根尖中分离的细胞核使用10x Genomics平台进行snRNA-seq（图1a；表S1）。每种处理包含三个独立生物学重复。经质量控制和数据过滤后，共保留79,201个高质量细胞核，其中CK样品39,619个，Al处理样品39,582个。所有文库中，每个细胞核检测到的中位基因数范围为2,261至2,839，中位UMI计数范围为3,049至3,995（表S2），表明具有足够的测序深度和转录组覆盖度。此外，各处理组内生物学重复之间观察到强相关性（CK-1 vs CK-2 vs CK-3；Al-1 vs Al-2 vs Al-3）。使用UMAP进行降维分析揭示CK和Al处理样品之间共存在28个转录特征不同的细胞群（图1b；图S2）。

图1. snRNA-seq揭示的G. max根尖细胞类型聚类、注释和转录组特征。（a）G. max根尖snRNA-seq工作流程示意图，包括荧光激活细胞核分选（FANS）和基于液滴的单细胞核捕获用于文库构建。（b）根尖snRNA-seq数据鉴定的28个群落的UMAP可视化，每个点代表一个细胞核。（c）各群落中标志基因表达的点图。点的大小表示表达该基因的细胞核百分比，点的颜色代表每个群落中的平均表达水平，颜色越深表示表达量越高。（d）大豆根尖中九个注释细胞类型的UMAP可视化及其空间分布。

细胞类型注释基于G. max和A. thaliana根组织中已确立的标志基因进行。来自与本研究所用参考基因组不同的基因组标志基因，首先使用BLAST映射至本研究G. max基因组中的同源基因（表S3）。基于这些标志基因的表达模式，鉴定出包含28个群落的九大细胞类型，包括柱细胞（1,385个细胞核，群落15）、表皮（41,402个细胞核，群落0、2、3、4、7、10、12、20和24）、皮层（19,498个细胞核，群落1、9、13、14、18、21和27）、内皮层（2,692个细胞核，群落11和23）、中柱鞘（3,971个细胞核，群落8和19）、韧皮部（1,043个细胞核，群落16和25）、维管形成层（3,613个细胞核，群落6）、木质部（119个细胞核，群落26）以及干细胞区（SCN，5,358个细胞核，群落5、17和22）（图1c；图S3）。在这些细胞类型中，表皮、皮层和SCN最为丰富，分别占总细胞核的52.27%、24.62%和6.77%（表S4）。

3.2. 细胞类型特异性的Al胁迫响应

Al胁迫暴露后，G. max根中仍能鉴定出相同的九大细胞类型，表明细胞类型分类未受Al处理影响（图S4）。为解析细胞类型特异性的Al转录响应，采用以下标准鉴定差异表达基因（DEGs）：校正后P值 ≤ 0.01，细胞比例 ≥ 0.1，|log?FC| ≥ 1。Al胁迫下九大细胞类型中共鉴定出20,544个DEGs。各细胞类型间DEGs数量差异显著。SCN在Al胁迫下DEGs数量最多（3,427个；2,195个上调，1,232个下调），其次为内皮层（3,114个；2,089个上调，1,025个下调）、中柱鞘（2,961个；1,938个上调，1,023个下调）和表皮（2,938个；1,797个上调，1,141个下调）（图2a；表S5）。

图2. G. max根尖中细胞类型特异性和共有的Al胁迫转录响应。（a）九个注释细胞类型中Al响应性上调和下调DEGs的数量。（b）UpSet图展示每个细胞类型中Al诱导上调DEGs的数量（左侧柱状图）及其在各细胞类型间的交集（上方柱状图）。（c）热图展示九个细胞类型中共调控DEGs的相对表达，包括参与转运、解毒和抗氧化防御、钙信号、转录调控以及生长和代谢的基因。（d）各细胞类型中Al响应性DEGs的KEGG（左）和GO（右）富集分析点图。

去除重复DEGs后，发现68个基因在所有九大细胞类型中对Al胁迫的响应中均共同上调（图2b；表S6）。

这些基因包括与转运相关的蛋白质，如ABC转运蛋白（ABCB11和ABCC3）、糖转运蛋白（SWEET2）和MATE家族转运蛋白（DTX43），这些基因可能参与促进代谢物和毒性离子的外排以减轻铝毒性。与此同时，多个与解毒和抗氧化防御相关的基因持续上调，包括细胞色素P450基因（CYP82A3和CYP71AU50）、谷胱甘肽S-转移酶（PARA、GST3和GSTU9）以及防御相关基因（MLO6和Glyma.05G082400）。此外，钙信号传导相关基因（ACA8、CML44和IQM2）的广泛诱导表明Ca2?介导的信号传导在根尖对铝胁迫的响应中发挥核心作用。多个转录因子编码基因（NAC073、NAC081、NAC002、WRKY6和HSFA4A）和锌指蛋白（ZAT18和ZAT11）也呈上调趋势，反映出铝胁迫下广泛的转录重编程。相比之下，一组基因在各类细胞中普遍下调，包括过氧化物酶前体（PER3）、果糖激酶4（FRK2）、水通道蛋白（TIP2-2）和扩张蛋白样蛋白（EARLI1）（图2c；图S5），表明铝胁迫下大豆根系中细胞壁重塑、碳代谢和水分运输的普遍抑制。

为进一步表征各细胞类型的功能响应，对各细胞类型中铝诱导上调的差异表达基因（DEG）进行了KEGG和GO富集分析（表S7、S8）。与CK相比，铝处理下九种细胞类型中上调的DEG均显著富集于KEGG通路"ABC转运蛋白"。此外，"核质转运"、"剪接体"、"真核生物核糖体生物合成"和"自噬—其他"等通路为大多数细胞类型所共有。一致地，"核糖核蛋白复合物生物发生"、"细胞氮化合物代谢过程"、"基因表达"、"核糖体生物发生"和"核酸结合"等GO术语在大多数细胞类型中富集。值得注意的是，GO术语"结构分子活性"、"核糖体结构组成部分"和"翻译"特异性地在表皮细胞中富集（图2d）。综上所述，这些转录变化揭示了大豆根尖对铝胁迫的全局性且具有细胞类型特异性的响应模式。

**3.3. 表皮和皮层在铝胁迫下的细胞类型特异性重塑**

在鉴定的九种细胞类型中，CK处理下皮层、表皮和SCN是三种最丰富的群体，分别包含16,123个核（40.70%）、13,534个核（34.16%）和2,754个核（6.95%）。值得注意的是，经铝处理后，八种细胞类型的核数量显著减少，其中皮层下降最为剧烈，降至3,375个核（8.53%）。相比之下，表皮呈现相反的趋势，其核数量急剧增加至27,868个（70.41%）（图3a）。这一显著差异凸显了表皮和皮层是铝胁迫下响应最为突出的两种细胞类型。鉴于这些相反的变化，我们后续分析重点关注表皮和皮层特异性的转录响应。在表皮中检测到550个独特的差异表达基因（172个上调和378个下调）（图2b）。铝处理特异性诱导了表皮细胞中与细胞壁加固（如RBG3、Glyma.10G172300、Glyma.12G185200）、能量代谢（如ACLB-2、AATP1）、防御和应激响应（如EDR2L、Glyma.08G150901、RPM1、Glyma.17G180000）以及细胞增殖（如WDR12）相关基因的表达。相比之下，与程序性细胞死亡（如ACD6和RAP2-3）以及几种富亮氨酸重复受体样丝氨酸/苏氨酸激酶（如IOS1、Glyma.14G206300）相关的基因在铝处理后表皮中显著受到抑制（图3b）。相比之下，皮层细胞在铝胁迫下表现出明显的转录抑制。仅鉴定到99个皮层特异性DEG，包括15个上调和84个下调基因（图2b）。有趣的是，在皮层细胞中于铝胁迫下被独特且显著诱导的是对质子毒根敏感性基因2（STOP2），而非广泛报道的STOP1。同时，对细胞壁重塑和细胞周期进程至关重要的几个基因（包括XTH23、CYCD1-1、CYCU2-1和Glyma.08G360800）在皮层中被强烈下调（图3c）。这些结果表明，铝胁迫主要损害了皮层细胞的细胞壁动态和细胞周期活性，从而为皮层细胞丰度的显著降低提供了机制性解释，这可能是通过抑制正常有丝分裂过程实现的。

**图3.** 铝诱导的细胞类型比例变化以及表皮和皮层特异性转录响应。（a）对照（CK）和铝（Al）处理下不同细胞类型的比例和绝对数量。（b、c）火山图显示表皮（b）和皮层（c）中独特鉴定的铝响应DEG。

**3.4. 铝胁迫导致皮层细胞数量与组织结构之间的不一致变化**

为研究铝胁迫对大豆根尖组织结构层面的影响，取CK和铝处理植物0.5 cm根尖制作横切面，并进行显微观察（图4a）。与CK相比，铝处理诱导了明显的表皮细胞脱落和表面破坏。与这些横切面观察结果一致，扫描电镜（SEM）分析进一步显示表皮表面严重破坏，观察到明显的裂缝、细胞塌陷和表皮细胞脱落（图S12）。值得注意的是，定量解剖分析揭示铝胁迫下皮层区域显著扩大。皮层总面积从CK中的1.27 × 10? μm2增加到铝处理后的2.38 × 10? μm2（图4b）。此外，铝处理根尖中单个皮层细胞的平均面积显著大于CK样品，且皮层细胞层数也增加（图4a、c）。这些结果表明，铝胁迫下皮层区域的扩大更可能归因于单个皮层细胞体积增大，而非皮层细胞数量增加。结合snRNA-seq结果显示的皮层细胞丰度显著降低，这些解剖学观察揭示了大豆根尖在持续铝胁迫下皮层中细胞组成与组织水平结构之间的显著不一致性。

**图4.** 铝胁迫对大豆根尖皮层微结构的影响。（a）基于snRNA-seq数据的皮层细胞丰度可视化（左）和相应根尖显微结构观察（右），对合并的CK和Al单细胞数据集进行UMAP分析以生成统一嵌入空间，其中CK（三个生物学重复合并）和Al（三个生物学重复合并）样本在同一UMAP空间可视化。（b）皮层面积对铝胁迫的响应变化。（c）铝胁迫下单个皮层细胞大小的变化。柱形图表示三个独立生物学重复的均值±标准差（SD）。使用Student's t检验评估统计显著性（*表示p < 0.05；**表示p < 0.01）。

**3.5. 伪时间轨迹分析揭示铝胁迫下表皮和皮层发育程序的差异性**

鉴于铝胁迫对表皮和皮层细胞丰度和转录状态的显著影响，我们假设大豆根尖可能通过改变这两种细胞类型的分化策略来响应铝毒性。为检验这一假设，对表皮和皮层细胞进行伪时间轨迹分析，以重建CK和铝条件下的发育轨迹，并评估铝胁迫对根尖细胞命运进程的影响。伪时间轨迹分析将表皮细胞分为三个不同的状态（状态1、状态2和状态3），其中状态1作为分叉前节点，随后分化为两个发育分支，分别命名为分支1和分支2（图5a、b）。在铝胁迫下，表皮细胞总体数量显著增加，伴随细胞在各伪时间状态中比例分布的显著变化。具体而言，状态1中表皮细胞比例增加，而状态2中比例减少，表明铝胁迫可能导致更大比例的表皮细胞停留在较早的伪时间阶段（图5c）。值得注意的是，状态3中表皮细胞比例从CK下的1.75%急剧增加至铝处理后的20.56%（图5c），表明铝胁迫将表皮细胞分化轨迹从分支1重定向至分支2。为进一步表征这种差异的分子基础，鉴定了分支依赖性基因并将其聚类为五个表达模块。模块1中的基因在分支2上高表达，显著富集于与脂肪酸代谢、脂肪酸生物合成和角质/木栓/蜡生物合成相关的KEGG通路（图5d；表S9）。与此结果一致，GO富集分析显示分支2与脂肪酸和有机酸代谢相关的多个生物学过程相关（图S6；表S10）。相比之下，在分支1上高表达的基因主要富集于与糖酵解/糖异生、α-亚麻酸代谢和氧化还原相关过程相关的通路（图5d），反映了支持基础能量代谢和氧化还原稳态的转录程序。这些结果表明表皮细胞在应对铝胁迫时沿替代分化分支经历不同的代谢重编程。此外，模块3和4中的基因在分叉前阶段上调，显著富集于与植物-病原体互作、MAPK信号通路-植物、ABC转运蛋白和核糖体生物合成相关的通路（图5d）。这些结果表明，在表皮分化早期阶段，铝胁迫快速激活了与信号转导、蛋白质合成和防御响应相关的转录程序。

**图5.** CK和铝处理下表皮细胞的分化轨迹。（a）表皮细胞的伪时间轨迹，每个点代表一个细胞，颜色表示伪时间评分。（b）表皮细胞沿伪时间轨迹不同状态的分布，颜色表示不同状态。（c）CK和铝样本中表皮细胞沿伪时间轨迹分布的比较。轨迹颜色表示不同处理，饼图显示各状态中细胞的比例，颜色对应图（b）。（d）热图显示表皮分化轨迹两个分支相关的DEG。右侧显示五个基因聚类中通过KEGG富集分析鉴定的DEG功能类别。

类似地表皮的伪时间分析，皮层细胞的伪时间分析也解析出三个主要状态（状态1、状态2和状态3），其中状态1代表分叉前阶段，随后分化为两个分支：分支1（状态1到状态2）和分支2（状态1到状态3）（图6a、b）。在CK条件下，皮层细胞主要分布在状态1（44.76%），而在铝胁迫下这一比例急剧下降至11.79%。相比之下，皮层细胞在状态2和状态3中的比例分别从CK下的32.93%和22.30%增加到铝处理下的39.70%和48.50%（图6c）。分支依赖性基因聚类鉴定出五个不同的表达模块。模块5中的基因在分叉前阶段高表达，显著富集于与能量代谢相关的KEGG通路，包括氧化磷酸化和糖酵解/糖异生（图6d；表S11）。相应的GO富集分析进一步强调了与细胞代谢和呼吸链活性相关的生物学过程。值得注意的是，模块4中的基因表现出分支1特异性表达模式，富集于生物节律-植物和肌醇磷酸代谢等KEGG通路。GO富集分析进一步提示这些基因在信号转导和转录调控中的作用（图S7；表S12）。相比之下，沿分支2特异性上调的基因主要富集于核糖体、核糖体生物合成和剪接体通路，GO术语强烈关联于蛋白质翻译和核糖体功能。

**图6.** 对照和铝处理下皮层细胞的分化轨迹。（a）皮层细胞的伪时间轨迹，每个点代表一个细胞，颜色表示伪时间评分。（b）皮层细胞沿伪时间轨迹不同状态的分布，颜色表示不同状态。（c）CK和铝样本中皮层细胞沿伪时间轨迹分布的比较。轨迹颜色表示不同处理，饼图显示各状态中细胞的比例，颜色对应图（b）。（d）热图显示皮层分化轨迹两个分支相关的DEG。右侧显示五个基因聚类中通过KEGG富集分析鉴定的DEG功能类别。

**3.6. 代谢组学分析**

为进一步探究上述脂肪酸相关代谢分支的改变如何在根尖全局代谢水平上反映，我们在CK和铝处理条件下对大豆根尖进行了非靶向代谢组学分析，以CK作为对照组。

在正离子模式（POS）和负离子模式（NEG）下进行的Principal component analysis（PCA）分析显示，CK和Al处理样品之间存在明显的分离。在两种模式下，前两个主成分（PC1和PC2）分别解释了超过66%和70%的总变异，处理组之间的分离主要由PC1驱动（图7a, b）。此外，构建了一个正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）模型以进一步增强处理组之间的区分能力。OPLS-DA得分图也显示CK和Al样品之间存在显著的分离（图S8）。下载高分辨率图像（389KB）下载全尺寸图像图7. CK和Al处理的大豆根尖样品比较代谢组学分析。(a, b) CK和Al样品在POS和NEG离子模式下获得的PCA得分图，分别为。(c, d) 显示CK和Al样品在POS和NEG模式下差异表达代谢物（DEMs）的火山图，分别为。(e, f) 在POS和NEG模式下识别到的DEMs的层次聚类热图，分别为。(g, h) POS和NEG模式下排名前20的DEMs经Z分数标准化的丰度，分别为。代谢组学分析在POS和NEG模式下分别鉴定了2,122个和1,907个代谢物（表S13）。通过结合OPLS-DA得出的VIP值和t检验P值（VIP≥1且P值≤0.05）筛选差异表达代谢物（DEMs）。结果在每种离子化模式下鉴定出186个DEMs（POS：90个上调和96个下调；NEG：76个上调和110个下调）（图7c, d；表S14）。利用标准化代谢物丰度构建的层次聚类热图显示了清晰的依赖处理的聚类模式（图7e, f）。在前20个按Z分数排名的DEMs中，几种有机酸在Al胁迫下显著诱导，包括壬二酸（子类：脂肪酸及其共轭物）、富马酸和D-苹果酸（图7h），而柠檬酸含量在Al毒性下显著降低（表S14）。此外，2-丁烯酸（子类：脂肪酸及其共轭物）在Al胁迫响应中也显著减少（图7g）。对DEMs进行KEGG注释显示，Al诱导的代谢变化主要富集在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及柠檬酸循环等途径中（图8a, b）。鉴于KEGG富集分析依赖于显著改变的代谢物数量，可能会忽略代谢物群体间的协调但适度的变化，我们进一步使用所有检测到的代谢物进行了代谢物集富集分析（MSEA）。值得注意的是，MSEA鉴定出脂肪酸生物合成是最显著富集的途径（图S9），这与表皮拟时间分析获得的结果一致。整合代谢组学和snRNA-seq结果，我们进一步检查了属于脂肪酸酯和脂肪酸及其共轭物子类的DEMs的丰度变化。值得注意的是，己酸和棕榈油酸均参与脂肪酸生物合成，在Al胁迫下显著增加，而2-丁烯酸显著减少。此外，在角质、木栓和蜡生物合成途径中，佛罗油酸和16-羟基十六酸分别显著上调和下调。同时，在Al胁迫下，壬二酸在根尖明显积累（图8c）。此外，基于拟时间分析显示皮层细胞在不同分支上表现出与能量代谢、信号调节和翻译相关的功能，我们检查了核苷酸相关代谢物的丰度。结果显示嘌呤核糖核苷酸：黄嘌呤单磷酸（XMP）、腺嘌呤单磷酸（AMP）和鸟嘌呤单磷酸（GMP）；嘧啶核糖核苷酸：尿苷5′-单磷酸（UMP）、UDP-D-木糖和CDP；嘌呤脱氧核糖核苷酸：脱氧腺嘌呤单磷酸（dAMP）和嘧啶脱氧核糖核苷酸：5-胸苷酸（TMP）在Al胁迫下均显著减少（图S10a）。为了探索下调的皮层细胞周期基因与改变的核苷酸代谢之间的潜在联系，我们对皮层细胞周期相关基因（CYCD1-1、CYCU2-1和XTH23）的表达与根尖中8个差异积累核苷酸代谢物的丰度进行了Spearman相关性分析。结果显示三个基因与八种核苷酸的积累之间呈一致的正相关（图S10b）。值得注意的是，CYCU2-1表达与UMP含量呈显著正相关（P < 0.001），与GMP和CDP呈显著正相关（P < 0.01），与TMP、XMP和dAMP呈显著正相关（P < 0.05）。XTH23表达与TMP含量呈显著正相关（P < 0.01）。下载高分分辨率图像（369KB）下载全尺寸图像图8. Al响应代谢物的KEGG途径富集以及脂肪酸相关代谢的变化。(a, b) POS和NEG离子模式下识别到的DEMs富集的Top 10 KEGG途径；(c) Al胁迫下脂肪酸相关代谢物的相对丰度变化，包括参与脂肪酸生物合成途径的代谢物（上方面板）和参与角质、木栓和蜡生物合成途径的代谢物（下方面板）。CK和Al处理各包含六个独立生物学重复。柱状图表示平均值±标准差（SD）。统计学显著性通过Student's t-test评估，*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001。3.7. WGCNA揭示参与Al胁迫响应的细胞类型相关基因共表达模块为阐明大豆根系在Al胁迫下的动态响应模式和单核水平的转录调控网络，我们对CK和Al处理下源自九种细胞类型的基因进行了WGCNA分析。共鉴定出12个模块，并用不同颜色进行可视化，模块大小范围为60至3,682个基因（图9a）。模块与处理之间的相关性分析显示，模块在CK和Al条件下存在清晰的聚类模式。其中，三个模块（绿松石色、棕色和紫色）与Al胁迫呈显著正相关，而其余十个模块与CK呈正相关（图9b）。此外，红色和洋红色模块在CK和Al处理下均与柱细胞类型呈正相关，表明这些模块可能代表在处理间相对稳定的核心转录程序。值得注意的是，不同的Al相关模块表现出不同的细胞类型偏好。绿松石色模块在Al处理下与表皮呈正相关，而紫色模块在Al胁迫下与内皮层和皮层呈正相关。基于k-ME排名，在绿松石色和紫色模块中分别鉴定出排名前15的枢纽基因，表明根尖外层细胞层在Al胁迫下存在两个主要的结构性响应方向。具体而言，绿松石色模块中的15个枢纽基因与在Al胁迫下根尖全局上调的DEGs大幅重叠，包括AOX1、GSTU9、多个ABC转运蛋白基因以及ESP3。这些基因主要与Al胁迫下的代谢防御调节相关，包括抗氧化代谢、离子转运和解毒以及蛋白质稳态（图9c）。此外，NAC家族转录因子NAC073被鉴定为一个枢纽基因，表明NAC转录因子在介导表皮对Al胁迫的响应中具有重要调控作用（图S11）。相比之下，紫色模块中的枢纽基因主要与细胞内核糖体生物合成、翻译和核仁功能相关。其中包括两个核糖体蛋白编码基因（RPL15和RPL17B）和四个核仁蛋白编码基因（如NOP5-2和NOP56），反映了内皮层和皮层在Al胁迫下以细胞内遗传信息处理为中心的调控响应（图9d）。下载高分辨率图像（701KB）下载全尺寸图像图9. 通过加权基因共表达网络分析鉴定关键基因共表达模块。(a) WGCNA鉴定的不同共表达模块中的基因数量分布。(b) 每个模块中的基因在CK和Al处理条件下不同细胞簇中的表达模式。(c) 绿松石色模块内枢纽基因的相关性网络，显示了高度连接的基因之间的共表达关系。(d) 紫色模块内枢纽基因的相关性网络，展示了该模块中关键基因的相互作用模式。4. 讨论土壤酸化以严重程度加剧和地理范围扩大为特征，已成为严重制约作物生产力的全球性挑战，相关的Al胁迫现在被认为是影响植物生长最具破坏性的非生物胁迫之一[5]。为了应对Al胁迫，植物进化出了两种主要抗性策略：外部排除机制（如向根际分泌有机酸）和内部耐性机制（包括液泡区隔化储存Al）[49], [50]。通过涉及不同物种和组织中Al处理的大规模转录组学、蛋白质组学、代谢组学以及其他分子生物学研究，已鉴定出许多赋予Al抗性的关键信号通路、功能基因和潜在靶标[51]。尽管大豆并非Al积累植物，但与大麦等作物相比，其表现出相对较高的Al耐性[52]，使其成为阐明Al胁迫响应和培育Al耐受品种的重要模式植物。特别是，由于根尖是Al感知和损伤的主要部位，详细描述Al胁迫下大豆根系的响应图谱对于推进Al耐受育种策略至关重要。在本研究中，我们采用基于细胞核分离的snRNA-seq方法，构建了Al胁迫下首个大豆根尖单核转录组图谱。通过分析约9万个根细胞核（每种处理条件下45,000个），我们在28个注释聚类中鉴定出9种不同的细胞类型（图1c），为大豆根尖对Al胁迫的细胞类型特异性响应提供了高分辨率洞察。在分子水平上，根系对Al胁迫的响应始于细胞水平上对Al3?的快速感知。当Al3?被根尖细胞质中的特异性受体结合后，胞外Al化学信号通过磷酸化-去磷酸化开关、钙信号和活性氧（ROS）爆发被转换为细胞核转录重编程。该过程实现了对参与有机酸外排基因的精确上调，从而促进根生长的快速解毒和保护[49], [50], [53]目前的研究已描述了植物中Al3?感知和信号转导涉及的若干早期事件，其中Al3?受体ALR1/PSKR的鉴定和C?H?型锌指转录因子SENSITIVE TO PROTON RHIZOTOXICITY 1（STOP1）的核心调控作用代表了植物Al毒性响应理解方面的两大进展[17], [54]。STOP1诱导多类靶基因的mRNA表达，包括负责有机酸外排的ALMTs和MATEs，以及涉及细胞壁修饰或内部区隔化的STAR1/ALS3，从而协调介导外部排除和内部耐性机制[54], [55]。Al胁迫以细胞类型特异性的方式影响基因表达，其中SCN、内皮层和中柱是DEGs富集程度最高的三种细胞类型（图2a）。这一观察结果表明，在3天Al胁迫下，大豆根尖可能主要在这三种细胞类型内对Al毒性进行响应。有趣的是，我们的结果偏离了Al感知和调控的经典模型。例如，在本研究中，两个ALR1（PSKR）基因——Glyma.19G100700和Glyma.19G100800——在八种细胞类型中被检测到（除木质部外）。具体而言，Glyma.19G100700在除内皮层和中柱外的六种细胞类型中上调，而Glyma.19G100800在内皮层、形成层和SCN中上调（表S15）；然而，这两个基因均未表现出统计学显著变化。这种差异可能归因于Al处理时长的不同。在大多数关注早期Al感知和信号的研究中，Al暴露时间通常为几小时至24小时。因此，我们的发现可能反映了一种与短期Al胁迫不同的响应模式。鉴于DNA损伤是植物长期Al毒性公认的标志[50]，我们观察到核心DNA损伤响应转录因子SUPPRESSOR OF GAMMA RESPONSE 1（SOG1）的编码基因在除形成层和木质部以外的所有细胞类型中显著上调（表S5）。这一结果表明，本研究基于3天的Al处理，捕获了长期Al毒性特征性的转录响应。值得注意的是，在所有九种鉴定到的细胞类型中，没有STOP1基因表现出显著的mRNA表达变化。相比之下，SENSITIVE TO PROTON RHIZOTOXICITY 2（STOP2），一种与STOP1同源的C?H?型锌指转录因子，仅在皮层细胞中特异性且显著地上调（图3c）。STOP2编码的蛋白定位于细胞核，在拟南芥中已被证明能激活一部分STOP1调控基因，特别是在低pH和Al3?毒性条件下，从而有助于维持细胞壁稳定性和离子稳态[56]。

与此同时，在stop1突变体中，STOP2的表达显著降低，这表明其转录受到STOP1的正向调控，提示存在一个潜在的STOP1–STOP2调控级联[57]。因此，在我们的结果中，皮层特异性诱导的STOP2可能反映了长期铝胁迫下STOP1活性的增强或替代性调控信号的输入。此外，Dai等人的一项研究表明，油菜（Brassica napus）中的BnaSTOP2在硫代谢和病原抗性中发挥调控作用，提示STOP2可能作为多效性调控节点发挥作用[58]。综合以上结果，我们的数据谨慎地指向大豆根尖中存在一个以STOP2为核心的潜在调控模块，介导长期铝毒害响应，且这一调控特征独特地发生在皮层细胞中。这种长期适应的特异性也体现在有机酸外排系统上。先前的研究报告指出，根的外层组织（包括表皮和皮层）通过ALMT1介导的苹果酸外排实现快速的初始解毒[59]。然而，我们的数据表明，在长期铝胁迫下，ALMT4和ALMT10在相对靠内的细胞层——内皮层和中柱鞘中显著上调，而非ALMT1（表S5）。内皮层和中柱鞘是调控离子进入中柱的关键屏障，因此在这类细胞中ALMT基因的持续激活可能表明，在长期铝胁迫期间，根系加强了已进入内部组织的Al3?的外排。值得注意的是，先前的研究报道了单子叶植物和双子叶植物在铝解毒过程中分泌有机酸类型上的差异。与主要分泌柠檬酸的玉米和水稻不同，已有报告表明大豆在铝胁迫下优先外排苹果酸[50]，尽管其他研究提出柠檬酸是大豆根系作为离子防御策略释放的主要有机酸[19], [60]。与此复杂性一致，我们的非靶向代谢组学分析显示，在铝胁迫3天后，大豆根尖中苹果酸显著积累，而柠檬酸水平明显降低（表S14）。有趣的是，我们发现MATE家族的一个成员DTX43在所有九种细胞类型中普遍上调（图2c）。这一观察与先前的报道一致，表明大豆主要依赖柠檬酸外排，并进一步暗示MATE转运蛋白表达的全局性增强。这种上调可能显著增加向根际的柠檬酸外运，从而加速细胞内柠檬酸的耗竭。尽管我们没有直接测量柠檬酸外排，但转录和代谢模式的综合结果与有机酸外排增强相一致。我们推测，ALMTs和MATEs的不同表达模式可能反映了大豆在长期铝胁迫下采用的两种协调适应策略：在全局水平上，通过MATE活性的增强维持持续的柠檬酸外排；而在关键内部检查点（内皮层和中柱鞘），细胞类型特异性地激活ALMT基因微调苹果酸介导的内部稳态。作为根的最外层细胞，表皮被认为更直接地暴露于Al3?之下，并对铝毒害产生更早且更强的响应。我们的单核RNA测序结果在细胞分辨率水平揭示了长期铝胁迫下大豆表皮的响应特征。细胞壁是离子相互作用的主要场所之一[61], [62]，先前的研究表明铝可与果胶和半纤维素结合，从而改变细胞壁特性并抑制细胞伸长[63]。因此，细胞壁长期以来被视为铝毒害的早期靶标[64]。在本研究中，我们观察到一组与细胞壁增强、脂质代谢和防御响应相关的基因在铝处理组中显著上调（图3b）。这些结果表明，植物不仅通过强化细胞壁刚性来限制Al3?的进入，还通过调整代谢过程来减轻铝毒害，这些响应似乎在表皮中占主导地位而被激活。在根尖组织中，该发育阶段的大多数细胞类型主要以单核状态存在。因此，在本研究所分析的根尖区域内，不同细胞类型核数量的变化在很大程度上反映了细胞数量或细胞类型比例的变化。通过考察铝胁迫下细胞类型特异性的核丰度变化，我们发现表皮表现出显著增加的核数量，这在九种已识别的细胞类型中是独特的（图3a）。有趣的是，与细胞死亡相关的基因（如ACD6）在表皮中被抑制。这种抑制可能表明铝胁迫抑制了表皮细胞中的细胞死亡相关通路，从而有助于表皮细胞丰度的增加。值得注意的是，有毛原基标记基因Glyma.06G039600（WEB1）和Glyma.04G048100（CSLC12）在簇7中高表达，表明有毛原基细胞在我们的单核RNA测序数据集中被成功捕获[45]。作为表皮的专门亚型，有毛原基在分生区和早期伸长区中与无毛原基具有大部分重叠的转录组特征，其在铝胁迫下的比例变化与其他表皮亚型一致。因此，在本研究中，有毛原基未被单独分离为一种独立的细胞类型，而是包含在更广泛的表皮细胞类型中进行下游分析。伪时间轨迹分析进一步揭示了铝胁迫下表皮细胞的分化特征，特别是铝诱导的发育轨迹转变。铝处理特异性的表皮细胞分支在脂肪酸合成以及角质素、木栓素和蜡合成相关通路中显著富集（图5d），这与我们观察到的表皮细胞物理表面屏障特性增强的结果一致。脂肪酸除了作为角质层形成的前体外，在非生物胁迫条件下维持膜完整性方面也发挥着至关重要的作用，并且已被证明与植物对干旱[65]、盐碱[66]和低温胁迫[67]的耐受性相关。植物可以通过调节饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例来在逆境环境中维持质膜稳定性[68], [69]。Ou等人报道，在铝胁迫下，小麦根中不饱和脂肪酸的积累有助于维持脂肪酸合成并增强根细胞的质膜流动性[70]。在大豆根尖中，我们鉴定到铝处理后不饱和脂肪酸棕榈油酸显著积累（图8c）。这种积累可能代表表皮细胞在长期铝胁迫期间维持质膜流动性的一种机制。值得注意的是，这种响应似乎涉及对特定不饱和脂肪酸的精细调控，因为并非所有不饱和脂肪酸都在铝胁迫响应中上调；例如，反丁烯酸未表现出类似的增加（图8c）。此外，代谢组学分析显示，16-羟基十六酸（一种已知的角质素和木栓素合成前体[71]）在铝处理后显著耗竭，同时其下游产物黄酮酸积累（图8c）。值得注意的是，绿松石色模块在很大程度上重现了差异表达基因（DEG）和伪时间分析所鉴定的表皮特异性防御和脂质相关的转录程序（图9b, c）。这些代谢变化共同指向表皮细胞中疏水屏障合成的增强。综合而言，这些结果表明，在长期铝毒害下，根表皮细胞可能通过调节脂肪酸代谢网络采用双重响应策略，同时维持膜稳态并强化物理防御屏障[72]。皮层细胞位于表皮和内皮层之间，构成主要的根组织，参与水和溶质的径向运输、营养储存和渗透调节，并在植物对离子胁迫的响应中发挥关键作用。Kinraide等人（2005）报道，铝毒害对根伸长的抑制主要发生在根的过渡区，该区域主要由皮层组织组成[73]。此外，在铝敏感小麦根中，铝的积累被发现在皮层中优先富集，而非在表皮中[74]。这些发现共同表明，皮层是铝毒害的关键靶组织。作为溶质运输的主要质外体途径，皮层细胞壁和细胞间隙可能特别容易直接暴露于外源Al3?之下。在本研究中，单核RNA测序数据揭示了铝胁迫下皮层细胞数量的显著减少（图3a）。值得注意的是，解剖学观察显示，尽管皮层细胞数量减少，但皮层区域表现出显著增大的面积（图4a, b），这至少部分归因于铝胁迫下单个体皮层细胞体积的增大（图4c）。对皮层特异性差异表达基因的进一步分析发现，与细胞分裂和动态细胞壁重塑密切相关的基因显著下调，包括CYCD1-1、CYCU2-1和XTH23（图3c）。先前的研究表明，D型环蛋白的抑制可直接使根分生组织细胞阻滞在G1/S转换期，从而抑制细胞分裂[75], [76]。同时，木葡聚糖末端葡糖基转移酶/水解酶（XTHs）被广泛认为是细胞壁延伸性和重塑的关键调节因子[77]。其中，XTH23在根发育和细胞壁修饰中发挥重要作用，其表达在盐胁迫下受油菜素内酯信号调控，表达增强促进侧根形成，而功能丧失突变体则表现出根发育受损和细胞壁特性改变[78]。值得注意的是，本研究中皮层细胞周期基因的下调与核苷酸代谢物的减少呈现一致趋势（图S10b）。核苷酸是DNA复制和RNA合成所必需的底物，其可用性直接影响细胞周期的进行。Spearman相关分析显示，CYCU2-1的表达与UMP含量显著正相关（P < 0.001）。UMP作为从头嘧啶合成途径的初始产物和所有嘧啶核苷酸的前体，UMP水平的降低可能反映了铝胁迫下皮层细胞核苷酸合成能力的整体下降，这进一步支持了铝胁迫对皮层细胞分裂活性的抑制作用。基于这些观察，我们提出铝胁迫下皮层细胞数量的减少和皮层面积的增大可能与铝诱导的正常皮层细胞分裂抑制有关，导致细胞周期阻滞在G1/S期。然而，我们的伪时间轨迹分析显示，受铝胁迫的皮层细胞向更晚的分化状态转变（图6），暗示除了细胞周期阻滞外，分化加速和随后的分生组织活性丧失也可能导致核数量减少。需要进一步研究以阐明皮层细胞核数量如何受铝毒害影响。本研究中观察到的皮层细胞数量减少并非铝胁迫所独有。离子胁迫通常对皮层产生高度靶向性的影响，因为Na?和Al3?等离子倾向于在皮层细胞壁中积累，与细胞壁组分如果胶和半纤维素发生强烈相互作用[79], [80]，从而加剧植物的离子毒害。近年来，多项单细胞转录组学研究证明，皮层细胞在盐碱等离子胁迫下同样表现出细胞数量显著减少或分化受损。例如，拟南芥根的单细胞转录组分析显示，盐胁迫显著抑制皮层和根毛细胞的增殖，并重塑根毛细胞的发育轨迹[45]。类似地，棉花根的研究表明，盐胁迫伴随皮层细胞分裂活性降低和组织更新减缓[28]。这些发现共同表明，皮层可能作为根中广泛保守的"缓冲带"发挥作用，对离子稳态的扰动高度敏感，且皮层细胞丰度对离子毒害表现出一致性的负向响应。然而，植物中的离子胁迫常伴随渗透胁迫。本研究的一个局限是我们没有设置平行的非离子胁迫对照，如渗透胁迫，这使我们无法确定观察到的皮层响应是特异性针对离子胁迫还是代表对生长抑制的一般性响应。最近一项关于拟南芥根尖渗透胁迫的单细胞转录组研究报告指出，渗透胁迫主要影响有毛原基的发育和分化，而皮层细胞丰度未表现出相应的减少，反而略有增加[46]。

这一观察结果间接支持了以下观点：在铝胁迫下皮层细胞数量的明显减少可能更具体地归因于离子毒性。尽管如此，未来研究中纳入适当的非离子对照将对于直接区分皮层对离子胁迫与非离子胁迫的特异性响应至关重要。此外，Wang等人报告指出，在高温胁迫下，玉米根尖的皮层区域同时表现出组织面积和细胞数量的增加，且皮层面积与根的热耐受性呈正相关[29]。这些观察结果表明，离子胁迫（如铝胁迫和盐胁迫）与非离子胁迫（如高温和渗透胁迫）可能通过根本不同的方式影响皮层细胞的命运。在离子胁迫条件下，皮层区域中Al3?或Na?的过度积累可能会破坏细胞周期进程、细胞壁完整性和离子稳态，从而优先抑制皮层细胞分裂。相比之下，在非离子胁迫条件下，皮层细胞可能转而采取涉及细胞膨胀和结构重塑的适应策略，以适应改变后的代谢需求。

**5. 结论**

基于单核RNA测序，本研究构建了铝胁迫下大豆根尖的细胞类型解析转录组图谱，并系统表征了根尖在铝暴露3天后的细胞类型特异性响应特征。我们的分析表明，铝胁迫不仅在根尖内各细胞类型间诱导了共享的转录响应，还通过重塑表皮细胞和皮层细胞的丰度及转录状态，显著改变了组织水平的结构组织。值得注意的是，皮层细胞数量的变化与组织水平的结构表型不一致，反映了根尖适应长期铝胁迫过程中细胞分裂调控与组织重塑之间的复杂关系。功能分析进一步表明，表皮细胞主要通过激活转运和防御相关的转录程序，以及增强的脂质屏障相关通路来应对铝胁迫，而皮层细胞则以细胞周期调控的改变和细胞分裂受限为特征。总体而言，本研究揭示了大豆根尖通过不同细胞类型间的功能特化和层级调控来适应长期铝毒性的响应模式。此处生成的单核转录组图谱为深入解析作物根系铝耐性的细胞基础提供了高分辨率的参考资源。

**环境意义**

土壤酸化和铝毒害严重限制了全球作物产量。通过揭示不同根细胞类型如何协同响应长期铝胁迫，本研究为大豆铝耐受机制提供了新的细胞和代谢层面的见解。这些发现为培育具有改善酸性土壤适应性的作物品种提供了有价值的参考，有助于在日益严重的土壤酸化条件下实现可持续农业生产。

柳秋萍 | 王书伟 | 闫瑞媛 | 徐克东 | 张屹 | 魏云敏
周口师范学院 生命科学和农学院，中国 周口 466001