从微生物群落到枯草假芽孢杆菌HL-1：揭示邻苯二甲酸酯生物降解的动力学、基因组学特征、代谢途径、毒性评估及环境修复

《Journal of Hazardous Materials》：Unveiling phthalate esters biodegradation from microbial community to Pseudarthrobacter scleromae HL-1: Kinetics, genomic insights, pathways, toxicity assessment and environmental remediation

　　

摘要

邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs）是普遍存在的合成增塑剂污染物，对生态环境和人类健康构成严重风险。本研究比较了两个菌群的微生物群落结构和邻苯二甲酸二丁酯（DBP）降解动力学：7天富集的MC1（50 mg/L DBP）和6轮驯化的MC7（50–1000 mg/L DBP），表明定向DBP胁迫选择产生了一个低多样性、高度特化的降解菌群，其最大降解速率（Vmax）为25.4 mg/L/h，是MC1的1.68倍。从MC7中分离出四株优势DBP降解菌株；假不动杆菌属Pseudarthrobacter scleromae HL-1表现最高效率，Vmax为17.1 mg/L/h，72小时内完全去除500 mg/L DBP，具有广泛的底物谱和经优化后较强的适应性。全基因组测序和GC-MS/MS阐明了DBP的双重平行矿化途径，该途径在Pseudarthrobacter中首次报道，整合了酯键水解和侧链β-氧化。ECOSAR和栅藻（Chlorella vulgaris）生物测定证实了毒性逐步衰减，72小时后相对毒性降低>99%，无有毒中间产物积累。含痕量背景PAEs的自然湖水试验表明HL-1成功定殖于水生环境，重塑了土著群落为协同降解菌群，并在84小时内实现了99.2%的DBP去除率。本研究从群落到单菌株层面提供了PAE生物降解机制的全面见解，并突出了HL-1作为修复PAE污染水生态系统的有前景候选菌株。

1. 引言

邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs）是全球使用最广泛的合成增塑剂类别，截至2025年，年产量超过800万吨[1]。它们被普遍添加到塑料、化妆品、医疗器械、食品包装和建筑材料中，以增强其柔韧性和耐久性[2], [3]。由于PAEs通过氢键和范德华力与聚合物基质形成非共价键合，PAEs在整个生命周期中持续释放到环境中，从生产、使用到处置[4]。因此，在全球水系统中检测到PAEs的浓度范围为ng/L至mg/L（0.1 ng/L-3.2 mg/L），土壤中为0.001 mg/kg-820 mg/kg，沉积物中为20 ng/g-763 μg/g，甚至大气中也有0.004 ng/m3-33851 ng/m3的检测浓度，使其成为全球分布最广的有机污染物之一[5]。最近的两项系统综述分别全面记录了PAEs在垃圾填埋场渗滤液和全球河流水生态系统中的发生特征、环境归趋及相关生态风险，进一步强调了这些新兴污染物在多种水环境区室中的广泛环境重要性[6], [7]。在所有PAE异构体中，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是最常用的短链PAE之一，在环境基质中表现出最高的检测频率和浓度[8]。它已被美国环境保护署（EPA）和中国生态环境部列为优先污染物[9], [10]。长期暴露于DBP会带来严重的生态和人类健康风险：它是一种强效内分泌干扰物，损害水生生物的生长、发育和繁殖，并通过食物链造成生物积累[11]；在人类中，慢性每日暴露于DBP，一般全球人群估计每日摄入量（EDIs）通常在0.1至10 μg/kg体重/天之间，暴露时间跨度从数年到终生，与生殖系统损伤、发育异常、免疫功能障碍和潜在致癌性相关[12]。此外，DBP经常与其他广泛检测到的PAE异构体共存，如邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）和邻苯二甲酸苄基丁基酯（BBP），以及在环境中的新兴污染物，导致协同毒性效应，加剧生态风险[13]。因此，开发高效和环保的DBP污染环境修复技术已成为紧迫的全球环境问题。

目前，PAE去除的主要技术包括物理吸附[14]、高级氧化工艺（AOPs）[15]和微生物降解[16]。活性炭吸附等物理方法仅实现污染物的相转移而非完全矿化，且废弃吸附剂需要进一步处置，导致二次污染[17]。AOPs可通过活性氧物种快速降解PAE，但存在固有的局限性：催化剂制备成本高、反应条件苛刻，以及产生毒性更大的中间产物，如氯化衍生物和芳烃自由基[18]。相比之下，微生物降解因其低成本、环境友好以及能够将污染物完全矿化为CO2和H2O的能力而被认为是PAE修复最有前景的策略[19], [20]。先前的研究已分离出众多PAE降解微生物菌群和纯菌株。微生物菌群通常通过种间协同作用表现出优异的降解效率和环境适应性，但其复杂的群落结构使得难以识别关键功能物种并阐明潜在的代谢机制[21]。能够降解PAEs的纯菌株主要属于鞘氨醇单胞菌属（Sphingobium）[22]、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）[23]、假单胞菌属（Pseudomonas）[24]和红球菌属（Rhodococcus）[25]，它们中的大多数通过传统的酯键水解途径降解PAEs。值得注意的是，假不动杆菌属（Pseudarthrobacter，放线菌门）广泛分布于各种环境中，并具有对难降解有机污染物较强的代谢能力[26], [27]。然而，迄今为止仅报道了两株能够降解PAEs的Pseudarthrobacter菌株：从农业土壤中分离的Pseudarthrobacter defluvii E5[28]和从植物根际分离的Pseudarthrobacter sp. NKDBFgelt[29]。尚无研究报道Pseudarthrobacter scleromae的PAE降解能力，对PAE降解微生物群落的定向驯化和关键功能菌株鉴定也缺乏系统研究。

尽管PAE生物降解研究取得了显著进展，但仍有三个关键知识缺口未得到解决。首先，PAE降解的分子机制仍知之甚少。大多数先前的研究仅关注分离菌株的降解性能，而全面的基因组分析以鉴定关键降解基因簇和功能酶则鲜有报道[30]。此外，几乎所有报道的PAE降解途径都基于传统的酯键水解途径，而替代的侧链β-氧化途径仅在少数菌株中有记载，其分子基础和生理优势仍不清楚[31]。其次，PAE降解中间产物的生态毒理风险在很大程度上被忽视。大多数研究仅评估污染物去除效率，而未评估降解过程中的毒性变化[32]。一些化学和生物降解过程已被证明会产生比母体化合物毒性更高的中间产物，构成潜在的生态威胁[33]。因此，结合计算机模拟预测和活体生物测定的综合毒性评估对于确保生物修复技术的环境安全性至关重要。第三，PAE降解菌株的实际应用潜力在很大程度上尚未得到验证。大多数菌株仅在最佳实验室条件下进行测试，它们在复杂自然环境中的定殖能力、稳定性和降解性能尚不清晰[34]。特别是，外源降解菌株与土著微生物群落之间的相互作用，这对原位生物修复的成功至关重要，在很大程度上仍未得到探索[35]。

为解决这些挑战，本研究从微生物群落到单菌株水平系统研究了DBP的生物降解（图1）。首先从塑料厂废水中富集和驯化了两个DBP降解菌群（MC1和MC7），随后对其群落结构和降解动力学进行了比较分析。随后从MC7中分离出四株优势DBP降解菌株，其中降解效率最高的P. scleromae HL-1进行了降解条件的系统优化和针对各种PAEs的底物谱评估。此外，还进行了全基因组测序和联用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）分析以表征DBP矿化途径。另外，通过ECOSAR预测和栅藻生长抑制试验评估了DBP降解中间产物的生态毒性。最后，在自然湖水中进行了生物修复试验，以检验菌株HL-1的实际降解能力及其对土著微生物群落的影响。本研究不仅为PAE生物修复提供了一个有前景的微生物候选株，还推进了我们对PAE生物降解机制从群落到基因组水平的全面理解。

下载：下载高分辨率图片（754KB）下载：下载全尺寸图片

图1. 本研究的研究路线示意图。

2. 材料与方法

2.1 化学品和培养基

纯度99%的邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸苄基丁基酯（BBP）、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）、邻苯二甲酸二辛酯（DOP）和邻苯二甲酸二异十二酯（DIDP）购自麦克林试剂公司（中国上海）。甲醇、乙醇、戊二醛和正己烷购自阿拉丁化学股份有限公司（中国上海）。所有其他分析级化学品均直接使用，未进行进一步纯化。无机盐培养基（MSM）和Luria-Bertani（LB）培养基的详细成分见附表S2。固体培养基通过在相应液体培养基中补充1.5%（m/v）琼脂制成。

2.2 微生物群落的富集和驯化

将10 mL取自中国安徽省合肥市某塑料厂的废水样品接种到含有终浓度为50 mg/L DBP的90 mL MSM中，在30 ℃、150 rpm振荡条件下培养进行富集。富集培养7天后形成的微生物群落被命名为MC1。MC1每隔7天以10%（v/v）的接种比例连续转接至含有逐步递增的DBP浓度（100、200、400、600、800和1000 mg/L）的新鲜MSM中进行驯化，最终得到驯化群落MC7。MC1和MC7样品立即在液氮中急冻，并在冷冻条件下运送至通用生物有限公司（中国安徽）在Illumina NovaSeq 6000平台上进行16S rRNA基因高通量测序。原始测序数据使用R 4.5.0进行加工和分析，柱状图和网络图分别使用Origin 2024和Gephi 0.10进行可视化。MC1和MC7的DBP降解效率通过高效液相色谱（HPLC）进行定量，详细分析方案见补充文本S1.1。

2.3 DBP降解菌株的分离和鉴定

MC7经梯度稀释后涂布于含500 mg/L DBP的固体MSM上，在30 ℃培养48 h。随后挑取具有不同形态特征的单菌落，转接至LB培养基中培养至指数生长期。此外，配制50%（v/v）无菌甘油保存液，并与对数期细菌培养物按1:1（v/v）混合，最终甘油浓度为25%（v/v）。所得甘油菌保存在?80 ℃进行长期保存。纯化分离株的形态学表征使用超高分辨率低温场发射扫描电子显微镜（UHR CFE-SEM Regulus 8230）和革兰氏染色进行，样品制备方法如前所述[36]。对于DBP降解分离株的分类鉴定，使用通用引物27F和1492R通过聚合酶链反应（PCR）扩增其16S rRNA gene序列。使用BLASTn（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列比对以确定最接近的系统发育亲缘关系，并使用MEGA 11（https://www.megasoftware.net/）的邻接法构建系统发育树。每株分离菌株的DBP降解性能通过HPLC进行评估。

2.4 降解和生长动力学研究

在初始DBP浓度为500 mg/L的条件下，通过在不同预定时间间隔取样监测残余DBP浓度和600 nm处光密度（OD600）来研究不同微生物群落和菌株的降解和生长动力学。实验数据分别使用四参数Logistic模型（(1)、(2)；[37]、[38]）进行拟合。

(1) Ct = C0 + (Cmin - C0) / (1 + (t/t50)^p)

其中Ct为时间t时DBP的残余浓度，C0为初始DBP浓度，Cmin为DBP的最终残余浓度，t50为半降解时间（h，降解50% C0所需的时间），p为斜率因子。最大比降解速率（Vmax，mg/L/h）代表DBP的峰值瞬时降解速率，tlag为滞后期时间（h，降解10% C0所需的时间）。

(2) St = S0 + (Smax - S0) / (1 + (t/K0.5)^P)

其中St为时间t时的OD600值，S0为初始OD600值，Smax为最大生物量，K0.5为半生长时间（h，达到50% Smax所需的时间），P为斜率因子。比生长速率（μ，h?1）代表微生物的瞬时增殖速率，tlag为滞后期时间（h，达到10% Smax所需的时间）。

2.5 降解条件优化和对其他PAEs的降解效果

分批降解实验在含有10 mL MSM并补充指定量DBP和细菌接种物的25 mL锥形烧瓶中进行。为了研究不同条件对DBP降解性能和细菌生长速率的影响，进行了单因素实验，涵盖温度（16、25、30、37和42 ℃）、pH（5、6、7、8、9和10）、初始底物浓度（500、750和1000 mg/L）和接种量（0.5%、1%、2%、4%和6%）。

所有单因素试验的基准条件设定如下：培养温度30 °C、初始pH 7.0、初始DBP浓度500 mg/L以及接种量2% (v/v)。在每个梯度试验中，仅调整目标变量，其余三个参数保持在基准水平不变。具体而言，在pH梯度试验中，使用无菌过滤的1 M HCl和1 M NaOH溶液调节MSM的初始pH值。每个复样的pH值在每个取样时间点均进行验证，整个实验过程中未检测到显著的pH漂移（> 0.3个单位）。此外，还评估了菌株HL-1对其它短链（DMP和DEP）和长链（BBP、DEHP、DOP和DIDP）PAEs的降解能力，以及对混合PAEs（DMP、DBP和DIDP）的降解能力。对于单一PAEs处理组，各化合物的初始浓度均设定为500 mg/L；而对于混合PAEs处理组，各组分浓度调整为250 mg/L，总浓度为750 mg/L。所有样品均在150 rpm恒温旋转振荡器中培养。在预定时间间隔，将锥形瓶从振荡器中取出，加入等体积正己烷，剧烈振荡以进行完全萃取。萃取液随后通过0.22 μm尼龙膜滤器过滤以去除颗粒杂质。残余PAEs浓度通过HPLC定量测定，细菌生物量则通过UV-Vis分光光度计测量OD600进行监测。所有实验均进行三次独立重复，未接种的MSM（含DBP）作为空白对照。

2.6 全基因组表征与功能注释

将菌株HL-1培养至指数生长期，用磷酸缓冲生理盐水（PBS）洗涤三次，在4 ℃下以9000 rpm离心5 min以获得细菌沉淀，随后立即在液氮中速冻，用于后续DNA提取。菌株HL-1的全基因组测序由安徽全生物公司使用Illumina NovaSeq 6000和PacBio RS II单分子实时（SMRT）测序平台完成。基于测序数据，使用Hifiasm（版本0.13-r308，https://github.com/chhylp123/hifiasm）和Canu（版本1.7，https://github.com/marbl/canu）软件进行草图基因组组装。环形基因组图谱使用Circos（版本0.69，https://www.circos.ca/software/download/circos/）生成。此外，使用京都基因与基因组百科全书（KEGG，https://www.kegg.jp/）、直系同源基因簇（COG，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/）、基因本体（GO，http://geneontology.org/）和碳水化合物活性酶（CAZy，http://www.cazy.org/）数据库对编码序列（CDSs）进行功能注释。

2.7 代谢途径解析与生态毒性评估

为检测菌株HL-1在降解DBP过程中产生的中间代谢物，将最适降解条件下培养24 h的菌液用等体积正己烷充分萃取。萃取液通过0.22 μm尼龙膜滤器过滤后，使用GC-MS/MS系统进行检测，详细的仪器参数和分析方法见补充文本S1。2。生态毒性评估结合了计算机预测与生物试验。使用基于定量构效关系（QSAR）的毒性评估软件ECOSAR 2.2（美国环境保护署，EPA）预测DBP降解中间产物对水生生物的急性和慢性毒性。按照GB/T 21805–2008进行衣藻（*Chlorella vulgaris*）生长抑制试验，将藻初始密度调整为OD680 = 0.1（1 × 10? cells/mL），将不同时间点收集的无菌降解产物在25 ℃、3000 lux光照强度和12 h:12 h光暗周期条件下以三倍重复、预先确定的浓度进行测试，通过测量OD680值计算相对初始毒性。

2.8 实际水样评估

现场水样采集自安徽省合肥市的翡翠湖（东经117.20°，北纬34.77°），该湖周围有多个居民区。样品首先通过定性滤纸过滤以去除大颗粒杂质，然后加入定量菌株HL-1菌液，以研究微生物群落结构的变化，数据分析方法参考第2.2节。在降解试验前，通过HPLC测定了原始湖水中背景PAEs浓度，痕量水平为3.72 μg/L（以DBP为主），对实验无显著干扰。PAEs标准品用甲醇溶解配制成储备液，再按目标初始浓度加入水样中；甲醇最终体积分数控制在0.1%以下，以避免对细菌活性产生不利影响。菌株HL-1对PAEs的实际降解效率通过HPLC测定。

2.9 统计分析

本研究的所有统计分析和可视化均使用R编程语言和Origin 2024完成。采用单因素方差分析（ANOVA）后接Duncan多重范围检验比较不同处理组间的数据，而两组间的成对比较则采用Wilcoxon符号秩检验。p值 < 0.05的差异被认为具有统计学显著性。所有实验均进行三次独立重复。

3. 结果与讨论

3.1 MC1与MC7在微生物群落和降解特性上的差异

本研究比较了两种富集细菌群落（MC1和MC7）在微生物群落结构和DBP降解性能上的差异。在属和种水平上，与MC1组相比，MC7组中与PAEs降解最密切相关的变形菌（如鞘氨醇单胞菌属*Sphingobium*、德氏菌属*Delftia*和假单胞菌属*Pseudomonas*）的比例显著增加（图2A和2B）。经过多次驯化过程后，微生物共现网络结构趋于简化（图2C和2D）：MC1样品的网络包含171个节点，而MC7样品仅包含50个节点；MC1网络的连接数为1698，显著高于MC7网络的556条连接。MC1的所有四个Alpha多样性指数（Chao1、Simpson、Shannon和PD whole tree）均显著高于MC7（p < 0.01）（图2E-H），表明驯化过程中的富集作用降低了细菌种群的丰富度，同时提高了其均匀度[39]。此外，Beta多样性分析显示两个群落完全分离，基于非重叠的非度量多维标度（NMDS）聚类和未加权组间平均法（UPGMA）聚类树可以得到证实（图2I和图S1），确认了PAEs驯化导致了明显的群落分化。线性判别分析效应量（LEfSe）结果显示，富集的MC1和MC7群落组在所有分类水平上均存在显著差异（图S2和S3，LDA ≥ 4，p < 0.05）。功能注释结果一致表明，与外源化合物生物降解、芳香化合物降解、膜转运和能量代谢相关的通路在MC7中明显富集（图S4-S6），这与其微生物群落组成完全一致。

图2. MC1与MC7在微生物群落结构、多样性和DBP降解性能方面的比较。细菌群落在门水平（A）和属水平（B）的相对丰度。MC1（C）和MC7（D）中细菌群落的共现网络。Alpha多样性指数，包括Chao1（E）、Simpson（F）、Shannon（G）和PD whole tree（H）指数。**p < 0.01，***p < 0.001。（I）基于Bray-Curtis距离对MC1和MC7细菌群落组成进行的NMDS分析。MC1（J）和MC7（K）在500 mg/L DBP条件下的DBP降解动力学和相应的细菌生长曲线。

与其专业化的群落特征一致，MC7表现出更优越的DBP降解性能和细菌生长速率（图2J和2K，表1，表2）。其最大降解速率（Vmax = 25.4 mg/L/h）是MC1（Vmax = 15.1 mg/L/h）的1.68倍；半衰期（t50 = 25.52 h）缩短了33.82%，滞后期（tlag = 16.72 h）更短，且相应的比生长速率和最大生物量也高于MC1。上述结果表明，DBP胁迫下的定向选择消除了非功能性类群并富集了高效降解菌，最终形成了一个低多样性但高度专业化的群落，在PAEs生物修复领域具有巨大的应用潜力[40]。

表1. 不同微生物群落和菌株的DBP降解Logistic模型动力学参数。

| | t50 (h) | Vmax (mg/L/h) | p | tlag (h) | R2 |
|---|---|---|---|---|---|
| MC1 | 38.56 | 15.1 | 4.67 | 24.08 | 0.993 |
| MC7 | 25.52 | 25.4 | 5.19 | 16.72 | 0.996 |
| HL-1 | 31.23 | 17.1 | 4.26 | 18.65 | 0.995 |
| HL-2 | 46.54 | 10.8 | 4.03 | 26.99 | 0.988 |
| HL-3 | 40.57 | 12.5 | 4.05 | 23.64 | 0.993 |
| HL-4 | 44.50 | 11.0 | 3.92 | 25.41 | 0.993 |
| HL-1（实际湖水中） | 46.42 | 13.0 | 4.88 | 29.58 | 0.991 |

表2. 不同微生物群落和菌株的Logistic模型拟合生长曲线。

| | μ (h?1) | Smax (OD600) | p | tlag (h) | R2 |
|---|---|---|---|---|---|
| MC1 | 0.017 | 1.06 | 2.89 | 19.47 | 0.987 |
| MC7 | 0.027 | 1.37 | 4.00 | 14.84 | 0.978 |
| HL-1 | 0.022 | 1.16 | 3.29 | 16.12 | 0.989 |
| HL-2 | 0.014 | 0.85 | 2.64 | 21.54 | 0.995 |
| HL-3 | 0.015 | 0.87 | 2.94 | 21.50 | 0.989 |
| HL-4 | 0.015 | 0.79 | 2.96 | 22.70 | 0.986 |

3.2 四株DBP降解菌的鉴定与性能

为鉴定MC7菌落中负责优异PAEs降解性能的关键功能菌种，以DBP为唯一碳源从该驯化菌落中分离纯化出四株优势降解菌株，分别命名为HL-1、HL-2、HL-3和HL-4。在30 ℃下于LB平板上培养48 h后，菌株HL-1、HL-2和HL-4形成乳白色菌落，而菌株HL-3形成淡黄色菌落。所有菌落均为圆形、凸起，表面光滑湿润（图S7）。SEM观察显示这些菌株之间存在明显的形态学差异（图3A、D、G、J）：菌株HL-1为短杆状、两端圆润的细胞，而菌株HL-2、HL-3和HL-4则呈长杆状。此外，革兰氏染色结果表明，菌株HL-1为革兰氏阳性菌，其余三株菌株为革兰氏阴性菌（图3B、E、H、K）。后续的16S rRNA基因测序和系统发育分析确认了所有分离菌株的分类学身份（图3B、E、H、K）。菌株HL-1、HL-2、HL-3和HL-4分别鉴定为硬地假诺卡氏菌（*Pseudarthrobacter scleromae*）、霍氏肠杆菌（*Enterobacter hormaechei*）、睾酮康通斯菌（*Comamonas testosteroni*）和蟾蜍假单胞菌（*Pseudomonas plecoglossicida*）。

图3. 从MC7中分离的四株纯细菌菌株的形态学表征、系统发育鉴定和DBP降解性能。菌株HL-1（A）、HL-2（D）、HL-3（G）和HL-4（J）的SEM图像。四株分离菌株的革兰氏染色结果和系统发育树（B、E、H、K）。四株菌株在500 mg/L DBP条件下的DBP降解动力学和相应的细菌生长曲线（C、F、I、L）。

四株菌株均能以DBP为唯一碳源生长并完全降解500 mg/L DBP，但在降解动力学上存在显著差异（图3C、F、I、L）。其中，菌株HL-1表现出最高的降解效率，最大降解速率（Vmax）为17.1 mg/L/h，分别是HL-2（10.8 mg/L/h）、HL-3（12.5 mg/L/h）和HL-4（11.0 mg/L/h）的1.58倍、1.37倍和1.55倍（表1）。同时，菌株HL-1在四株分离菌株中也具有最短的半衰期（t50 = 31.23 h）和滞后期（tlag = 18.65 h）。与其卓越的降解性能一致，菌株HL-1表现出最快的比生长速率（μ = 0.022 h?1）和最高的最大生物量（Smax = 1.16）（表2）。值得注意的是，迄今为止仅有少数属于假诺卡氏菌属且能降解PAEs的菌株被报道，即Chen等[26]从农业土壤中分离的河泥假诺卡氏菌（*Pseudarthrobacter defluvii* E5）和Yastrebova等[27]从植物根际土壤中鉴定的假诺卡氏菌（*Pseudarthrobacter* sp. NKDBFgelt）。这两株细菌的DBP降解速率分别为4.17 mg/L/h和2.09 mg/L/h，均明显低于硬地假诺卡氏菌HL-1（6.94 mg/L/h）。这证实了硬地假诺卡氏菌HL-1代表一种新型PAEs降解细菌分离株。此外，与以往报道的其他DBP降解分离菌株相比，菌株HL-1展现出卓越的降解效率，在增塑剂去除和环境修复领域具有更广泛的应用潜力（表S3）。

3.3 菌株HL-1对DBP降解条件的优化及广谱降解性

为确定菌株HL-1的最适降解条件，进行了一系列单因素实验以系统优化影响其降解性能的关键环境参数。同时，还研究了其对单一和混合PAEs的降解效率。不同温度对菌株HL-1的DBP降解能力和生物量的影响见图4A和4D。菌株HL-1在30 ℃和37 ℃下对500 mg/L DBP的降解速率最高，在72 h内实现完全降解。此外，菌株HL-1在25 ℃和42 ℃下培养72 h后仍保持91%以上的DBP降解率。细菌生长趋势与其降解性能一致，在30 ℃下观察到最大生物量。这些结果表明30–37 ℃是菌株HL-1降解DBP的最适温度范围，且该菌株具有一定的温度适应性。不同初始pH值对菌株HL-1的DBP降解和生长的影响见图4B和4E。菌株HL-1在pH 7.0时降解速率最快，在72 h内实现500 mg/L DBP的完全去除。

此外，虽然菌株HL-1的DBP降解率在反应环境酸性或碱性增强时有所下降，但在pH 6–9范围内仍能在84小时内实现完全降解，这可能归因于其DBP降解相关酶对pH的广泛耐受性[41]。总体而言，菌株HL-1能够在弱酸性至弱碱性条件（pH 5.0–9.0）下高效降解DBP，这对于pH条件多变的PAEs污染环境的生物修复具有重要实用价值。不同初始DBP浓度对菌株HL-1降解性能和生长的影响如图4C和4F所示。在500 mg/L、750 mg/L和1000 mg/L的初始底物浓度下，菌株HL-1在72小时内的DBP降解效率分别达到100%、95.7%和77.5%，表明DBP降解速率随底物浓度的增加而降低。值得注意的是，当DBP浓度达到1000 mg/L时，菌株HL-1的生物量生长受到显著抑制，这可能是由于高浓度DBP对微生物生长的抑制作用所致[42]。此外，在所有测试的温度、pH值和底物浓度下，经84小时培养后，未接种菌株HL-1的对照组均未观察到明显的DBP损失，从而排除了底物自发水解对DBP去除的贡献（图S10）。此外，在DBP浓度为500 mg/L时，菌株HL-1的最佳接种量为2%（v/v），该接种量实现了最快的DBP降解速率和最高的生物量产量（图S11）。较低的接种量（0.5%和1%）导致延长的滞后期和较慢的降解速率，而较高的接种量（4%和6%）则导致种内竞争加剧[43]。

图4. 菌株HL-1的DBP降解条件优化及广谱底物降解范围。菌株HL-1在不同温度（A, D）、pH值（B, E）和初始DBP浓度（C, F）下的DBP降解曲线及相应细菌生长曲线。（G）72小时后菌株HL-1对七种典型PAEs的降解率和（H）各PAEs在500 mg/L浓度下的降解曲线。（I）菌株HL-1在250 mg/L浓度下对混合PAEs的降解曲线。

菌株HL-1对不同烷基链长度的PAEs表现出广泛的降解谱。在单一PAEs处理（初始浓度500 mg/L）中，HL-1对DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP、DOP和DIDP的降解率在72小时分别达到99.4%、98.4%、100%、98.0%、93.7%、94.6%和89.9%（图4G）。当培养时间延长至84小时时，所有测试的PAEs均实现了完全降解（图4H）。在混合PAEs体系（每种组分250 mg/L，总浓度750 mg/L）中，HL-1能够同时降解所有三种测试的PAEs，其中短链PAEs的降解速度快于长链PAEs，所有化合物在84小时内均被完全去除（图4I）。综上所述，这些结果表明菌株HL-1具有优异的环境适应性、高底物耐受性和广泛的PAEs降解谱。其能够在广泛的环境条件下高效降解单一和混合PAEs的能力，使其成为PAEs污染水土环境生物修复的高度有前景的候选菌株。

3.4 菌株HL-1的功能基因组分析

为阐明栖慢杆菌HL-1卓越PAEs降解能力的分子机制，本研究进行了全基因组测序和综合功能基因组分析。该菌株的测序基因组全长为4,416,438 bp，GC含量为65.69%，其编码区域占整个基因组的89.64%（图5A和表S4）。其染色体共编码4101个基因，包括4016个蛋白编码基因（占97.93%）和85个RNA基因（占2.07%）。KEGG通路注释结果显示，数量最多的基因（共2619个）被归入"代谢"主类别（图5B）。值得注意的是，参与异生物质降解与代谢、芳香族化合物降解和脂质代谢的基因丰度极高，这与该菌株卓越的PAEs降解能力直接相关。COG功能分类进一步表明，与碳水化合物运输和代谢、氨基酸运输和代谢以及无机离子运输和代谢相关的基因构成了最丰富的功能组（图5C）。此外，大量基因被注释为与转录、复制和修复以及信号转导相关的功能；这些基因对细菌适应环境胁迫和高效利用底物是必不可少的[44]、[45]。GO功能注释验证了菌株HL-1强大的代谢潜力（图S12）。在生物过程类别中，"代谢过程"（943个基因）和"细胞过程"（594个基因）是主要的注释术语。在分子功能类别中，"催化活性"（1380个基因）占比最大，反映了该菌株对污染物转化的强大酶促能力。针对CAZy数据库的注释在HL-1基因组中鉴定出六类碳水化合物活性酶（图S13），其中糖基转移酶（GT）和糖苷水解酶（GH）丰度最高。这一发现表明该菌株具有多样的碳水化合物代谢能力，有助于其在复杂环境中存活[46]、[47]。

图5. 菌株HL-1的基因组特征。（A）环状基因组图谱，（B）KEGG代谢通路注释，（C）COG功能分类，以及（D）菌株HL-1中与PAEs降解相关的关键基因。

最重要的是，基因组挖掘揭示了散布在HL-1整个基因组中的多个完整的PAEs降解专用基因簇（图5D和表S5）。这些基因簇包含DBP完全矿化所需的所有关键基因，具体包括：(1)负责DBP酯键初始水解的酯酶基因（如yvaK和pnbA）[48]；(2)编码芳香环羟化酶和邻位裂解酶的苯甲酸盐降解基因（如ben和cat家族）[49]；以及(3)用于后续降解脂肪族侧链的β-氧化基因（如fad和pca家族）[50]。这些成簇且功能完整的降解基因的存在为菌株HL-1快速高效降解DBP提供了直接的分子基础。综合而言，功能基因组分析表明菌株HL-1拥有全面的PAEs降解和环境适应的基因库。这些基因组特征与其实验观察到的降解效率高、底物谱广和胁迫耐受性强的结果完全吻合。完整PAEs降解基因簇的鉴定不仅阐明了栖慢杆菌HL-1生物降解DBP的分子机制，还为构建具有增强生物修复性能的工程菌株提供了宝贵的遗传资源。

3.5 DBP的降解产物与降解途径

为阐明栖慢杆菌HL-1生物降解DBP的代谢途径，使用GC-MS/MS鉴定了不同降解时间点的中间代谢产物。通过与标准化合物和已发表文献对比其保留时间、质谱图和分子式，共检测到并确认了七种中间产物（表S6和图S14），包括邻苯二甲酸单丁酯（MBP）、丁基乙基邻苯二甲酸酯（BEP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸单乙酯（MEP）、邻苯二甲酸（PA）、原儿茶酸（PCA）和儿茶酚。其中，MBP、PA、PCA和儿茶酚是PAEs传统酯水解途径的典型中间体，而BEP、DEP和MEP的检出则明确证实了侧链β-氧化途径的存在，这与 Streptomyces sp. FZ201在降解DBP过程中同时检测到脱酯和β-氧化中间体的结果一致[29]。基于GC-MS/MS鉴定的中间体和全基因组测序先前鉴定出的PAEs降解相关基因，合理提出了菌株HL-1完整的DBP降解途径（图6A）。此外，在DBP诱导的细菌细胞中检测到羧酸酯酶、酰基-CoA脱氢酶和原儿茶酸3,4-双加氧酶的特异性活性显著升高（表S7），为所提出的双并行矿化途径提供了互补的生物化学证据。与大多数仅采用单一降解途径的PAEs降解细菌不同，HL-1拥有两条功能完整且独立的并行降解途径，这种途径冗余在伪慢杆菌属中尚未见报道。

图6. 菌株HL-1提出的完整DBP生物降解途径及其中间代谢产物的生态毒性评估。（A）基于基因组分析和代谢物鉴定提出的完整DBP降解途径。（B）和（C）DBP及其13种中间代谢产物对三种水生生物（鱼类、水蚤和绿藻）的急性毒性和慢性毒性。（D）以小球藻为指示生物时，DBP降解过程中相对初始毒性的变化。

值得注意的是，HL-1通过两条并行途径实现DBP的完全矿化：传统的酯水解途径：DBP被酯酶依次水解为MBP和PA；PA随后脱羧为PCA，经双加氧和开环生成3-羧基-cis,cis-粘康酸，再经一系列酶促反应生成丙酮酸和乙酰-CoA。与菌株FZ201不同，后者PA可通过PCA邻位裂解或苯甲酸（BA）脱羧两条下游途径降解[29]，HL-1中的PA仅脱羧为PCA并进入邻位裂解途径，且未检测到BA等脱羧中间体，表明其下游代谢途径更具特异性。独特的侧链β-氧化途径：DBP的丁基侧链首先通过β-氧化被氧化为乙基，依次产生BEP、DEP和MEP；MEP随后被水解为PA，与第一条途径进入相同的下游降解途径。侧链β-氧化先于脱酯的降解顺序具有重要的生理优势，因为这样可以避免直接脱酯释放的长链丁醇与细胞膜反应造成的毒性[51]，这也可能是HL-1能够耐受高浓度DBP并保持高降解效率的重要原因之一。两条途径最终汇聚入三羧酸（TCA）循环，使DBP完全矿化为CO?和H?O。两条并行途径汇聚入TCA循环实现完全矿化以及代谢网络的冗余性，不仅增强了菌株对环境胁迫的适应性，也为其高效降解各种PAEs提供了生化基础。这一特征与放线菌门物种的典型代谢特性高度一致[52]。

3.6 DBP降解产物的毒性风险评估

为评估菌株HL-1生物降解DBP的环境安全性，采用计算机预测与体内生物测定相结合的方法对所有已鉴定和推测的中间产物的毒性进行了评估。使用ECOSAR软件预测了DBP及其降解产物对三种代表性水生生物（鱼类、水蚤和绿藻）的急性和慢性毒性（图6B-C）。结果显示，中间产物的毒性沿降解过程逐渐降低。虽然中间产物P7（儿茶酚）的预测毒性较其前体产物略有升高，但仍远低于母体化合物DBP，且最终进入TCA循环的中间体对所有测试生物的毒性均可忽略不计。

此外，通过小球藻生长抑制实验进一步证实了该降解过程的解毒效果（图6D）。降解系统的相对初始毒性随时间迅速降低，从0小时的100%降至72小时的不到1%。这表明在整个降解过程中没有产生更具毒性的中间产物积累，菌株HL-1实现了DBP的近乎完全解毒。综合而言，这些结果表明菌株HL-1不仅能够高效降解DBP，还能显著降低其整体生态毒性，为PAEs污染水环境的修复提供了一种环境友好且可行的方案。

3.7 实际水样分析

为验证栖慢杆菌HL-1在复杂自然环境中的实际生物修复潜力，使用实际PAEs污染的湖水进行了生物修复实验。在门水平上，变形菌门是对照组（CK）和HL-1接种组中的优势门，而HL-1接种组中拟杆菌门的相对丰度显著增加（图7A）。拟杆菌门与PAEs降解密切相关，能够通过协同降解PAEs中间产物和改善微环境来维持微生物群落的稳定性[53]。

此外，在属水平上，两组表现出不同的群落组成特征：CK组以无已知邻苯二甲酸酯降解能力的土著菌属为主，而HL-1组则显著富集了多个直接或间接参与邻苯二甲酸酯降解的多功能菌属，包括金黄杆菌属、柄杆菌属和肠杆菌属。α多样性分析表明，HL-1接种显著提高了实际水样中微生物群落的多样性。HL-1组的Chao1、Simpson和PD whole tree指数均显著高于CK组（p < 0.05，图7C-E），表明HL-1的引入促进了土著微生物的生长并提高了群落的整体丰富度和均匀度。β多样性分析进一步证实了两组之间完全的结构分离，主坐标分析中不重叠的聚类和UPGMA聚类树中明显的分组模式即为证据（图7F，图S15）。LEfSe共鉴定出59个差异富集类群（图S16和S17，LDA评分 ≥ 4，p < 0.05）。共现网络分析表明，HL-1组形成了以伪棒杆菌属为中心的高度互联微生物网络，伪棒杆菌属与其他邻苯二甲酸酯降解菌属之间表现出强正相关，表明形成了协同降解联合体（图S18）。

图7. 菌株HL-1在实际邻苯二甲酸酯污染湖水中的生物修复效果及其对土著微生物群落的影响。（A）对照组（CK）和HL-1添加组中细菌群落在门水平的相对丰度；（B）属水平的相对丰度。（C）Chao1指数；（D）Simpson指数；（E）PD whole tree指数。*p < 0.05，**p < 0.01。（F）基于Bray-Curtis距离的CK组和HL-1组细菌群落组成的主坐标分析。CK组和HL-1组的KEGG代谢通路差异分析（G）、COG功能分类统计（H）和FAPROTAX生态功能预测（I）。菌株HL-1在实际湖水中对DBP的降解动力学（J）和混合邻苯二甲酸酯的降解曲线（K）。

此外，KEGG功能注释揭示，与对照组相比，HL-1接种组富集了与外源化合物降解和代谢、膜转运、氨基酸代谢、脂质代谢和碳水化合物代谢相关的通路（图7G），为高效降解邻苯二甲酸酯提供了关键的功能基础[54]。COG功能分类表明，HL-1组中与能量产生和转换、氨基酸转运和代谢、次级代谢产物合成、转运和分解代谢以及脂质转运和代谢相关基因的相对丰度高于CK组（图7H），反映出菌株接种后微生物群落代谢活性整体增强[55]。FAPROTAX生态功能预测证实，HL-1组显著富集了芳香烃降解、芳香化合物降解、烃类降解和塑料降解等污染物降解相关功能（图7I），而增强的有氧化能异养功能为协同降解联合体提供了充足的能量支持[56]。

此外，虽然HL-1在实际湖水中的Vmax相比最适降解条件下有所下降，但仍表现出优异的降解性能（表1）。该菌株在84小时内高效降解了500 mg/L DBP的99.2%，并在同一时间范围内同步去除了混合体系中的邻苯二甲酸酯（DMP、DBP和DIDP），仅残留1.3%的DIDP（图7J-K）。综合以上结果，菌株HL-1能够成功定殖于复杂自然水体环境，重塑土著微生物群落形成协同降解联合体，并保持高效的邻苯二甲酸酯降解能力，确认其在邻苯二甲酸酯污染水体生态系统生物修复中的巨大应用潜力。然而，邻苯二甲酸酯的微生物生物降解仍面临固有的局限性和实际挑战，包括功能菌株在复杂自然环境中的长期定殖不稳定、易受波动理化因素影响以及共存污染物可能的抑制效应，这些都需要在未来研究中进一步系统探讨。

**4. 结论**

本研究揭示了DBP驱动的方向性选择产生了一个低多样性但高度特化的联合体（MC7），其最大降解速率为25.4 mg/L/h。从MC7中分离出HL-1菌株，经系统优化后，在72小时内完全去除500 mg/L DBP，Vmax为17.1 mg/L/h。结合基因组学和GC-MS/MS分析阐明了DBP的双重平行降解途径，据我们所知，这一途径在伪棒杆菌属中尚未被报道过。毒性评估证实，72小时后毒性减少超过99%，且无毒性中间产物积累。在湖水试验中，HL-1表现出定殖潜力，调控了土著微生物群落，并在84小时内去除99.2%的DBP。本研究从群落到单菌株水平为细菌邻苯二甲酸酯代谢提供了机制性见解。尚需进一步开展长期田间试验和直接矿化验证，以评估其作为前景生物接种剂的全规模应用。

**环境意义**

本研究表明，从塑料厂废水中分离出的HL-1菌株能够高效降解邻苯二甲酸二丁酯及多种邻苯二甲酸酯，具有重要的环境效益。在HL-1菌株中鉴定的新型双重平行矿化途径为邻苯二甲酸酯的生物降解机制提供了关键的新见解。值得注意的是，HL-1菌株对环境波动具有优异的适应性，且能显著降低DBP的毒性，证实其具有环境适用性。这些发现为修复邻苯二甲酸酯污染的水体系统提供了一种高效、低成本且环保的解决方案，同时突显了微生物方法在减轻增塑剂污染及相关生态风险方面的巨大潜力。

**研究意义声明**

本研究表明，从塑料厂废水中分离出的HL-1菌株能够高效降解邻苯二甲酸二丁酯及多种邻苯二甲酸酯，具有重要的环境效益。在HL-1菌株中鉴定的新型双重平行矿化途径为邻苯二甲酸酯的生物降解机制提供了关键的新见解。值得注意的是，HL-1菌株对环境波动具有优异的适应性，且能显著降低DBP的毒性，证实其具有环境适用性。这些发现为修复邻苯二甲酸酯污染的水体系统提供了一种高效、低成本且环保的解决方案，同时突显了微生物方法在减轻增塑剂污染及相关生态风险方面的巨大潜力。

**作者贡献声明**

唐惠良：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、方法学、数据整理、概念化。王awei：验证、调查、形式分析。邓国智：验证、软件、调查。王千念：监督、资源、方法学。吴超：撰写—审阅与编辑、监督、资源、项目管理、经费获取。

唐惠良 | 王awei | 邓国智 | 王千念 | 吴超

安徽大学资源与环境工程学院，安徽省矿山生态修复工程实验室，安徽合肥230601，中国