石榴皮提取物双磷脂体通过多效性调节炎症、线粒体自噬、衰老和金属蛋白酶来对抗紫外线B诱导的皮肤光老化

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Pomegranate peel extract bilophytosome protects against UVB- induced skin photoaging through pleiotropic modulation of inflammation, mitophagy, senescence, and metalloproteinases

　　

摘要

光老化是导致超过80%的皮肤老化的原因，并促进皮肤癌的发展。紫外线B（UVB）辐射通过多层级损伤级联反应导致光老化，亟需针对其早期阶段的新干预措施。石榴皮提取物（PPE）具有强大的光保护特性；然而，其潜在机制在很大程度上仍未被探索，特别是关于调节光老化中炎症-线粒体自噬-衰老平衡的机制。此外，PPE成分的结构复杂性和分子量较大，限制了其外用功效。本研究通过整合分子探索的方式，研究了PPE的抗光老化机制，并通过将其纳入生物相容性双磷脂体中来优化其光保护性能。采用液相色谱-高分辨质谱法（LC-HRMS）表征PPE的成分。分子对接和生物信息学分析预测了与皮肤光老化相关的潜在分子相互作用和通路。最后，在UVB诱导的光老化动物模型中实验研究了粗PPE和PPE-双磷脂体的抗光老化机制。PPE和PPE-双磷脂体均显著抑制了细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化，降低了IL-6、iNOS和TGFβ1的水平。它们显著下调了miR-34c和p21，同时将PTEN诱导激酶1（PINK-1）恢复至接近正常范围，最终减少基质金属蛋白酶。与粗PPE相比，PPE-双磷脂体在所有测试参数中均表现更优。组织学检查显示，由于其渗透性增强（经共聚焦显微镜证实），PPE-双磷脂体能够恢复胶原和正常皮肤结构。我们的发现证明了PPE对抗光老化关键因素具有强大的多效调节作用，可通过纳入稳定的双磷脂体系统进一步优化。

引言

皮肤老化是一个复杂的生物学过程，受内在分子变化和外在环境因素的影响，其中光老化是最普遍的原因[1]。皮肤光老化主要是由长时间暴露于紫外线（UV）辐射引起的，它通过氧化应激、线粒体功能障碍、DNA损伤和细胞外基质降解等一系列事件加速皮肤老化[2]、[3]。这些紊乱显著增加了皮肤癌的易感性，表现为炎症、色素沉着和皮肤皱纹[4]。在分子水平上，与自然时序性老化不同，UVB的光子能量高于UVA，导致其在表皮中的吸收率更高，在那里它主要诱导氧化应激、触发炎症反应和DNA损伤，使其成为光致癌的关键因素[5]、[6]。

UVB诱导的光老化涉及皮肤氧化还原稳态的破坏，随后是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）炎症通路的放大信号，其中包括细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）。这进而导致过量的细胞因子产生，在成纤维细胞和角质形成细胞中延伸出促衰老微环境[7]、[8]。为控制进一步的皮肤损伤，紫外线暴露导致诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和转化生长因子β1（TGFβ-1）的表达增加。然而，它们改变的表达使平衡向细胞周期停滞方向偏移，同时通过激活基质金属蛋白酶引发凋亡蛋白和细胞外基质降解[9]、[10]、[11]。

同时，失调的微小RNA（miRNAs）的影响作为紫外线暴露时关键的应激反应细胞调节因子，被越来越多的报道所提及。在此背景下，miR-34c-5p被认为是MAPK和凋亡p53/p21信号通路的关键调节因子，这些通路驱动紫外线B应激真皮细胞的过早衰老[12]、[13]、[14]。因此，在转录组阶段针对这些通路可以呈现更早的保护，以防止光老化进展，避免不可逆损伤的积累。

同时，PTEN诱导假定的激酶1（PINK1）介导的线粒体自噬是防止细胞损伤扩大的关键保障。在健康细胞中，PINK-1选择性清除受损的线粒体，并阻止正常细胞在暴露于过量活性氧（ROS）和线粒体DNA（mtDNA）缺失时走向完全死亡[15]、[16]。最新证据表明，PINK-1的破坏也有助于光老化，其中敲低PINK1会阻止对皮肤光老化的保护，同时增加线粒体和氧化损伤[17]。

鉴于上述观察，在最早阶段解决这一相互关联的网络，因此可以呈现一种具有影响力的多层级策略，以暂停皮肤光老化并防止进一步损伤。

在此背景下，天然来源的生物活性化合物越来越被认为是安全而强大的光保护剂。植物提取物富含清除ROS的多酚类物质，同时调节涉及皮肤老化和炎症性疾病的氧化还原敏感分子通路[18]、[19]、[20]。

在这些物质中，Punica granatum L.（石榴）的果皮是一种可持续的农业工业副产品，由于其多种促进健康的特性，越来越多地被应用于营养保健品和美容医学化妆品行业[21]、[22]、[23]。石榴皮提取物（PPE）含有大量的可水解鞣质，如安石榴苷、鞣花酸衍生物和类黄酮，具有推测的抗氧化、抗炎和光保护作用[21]、[24]、[25]。

最新研究表明，PPE通过抑制胶原降解酶来减少紫外线诱导的氧化损伤，从而保护真皮结构。同时，基于石榴的制剂外用报道可改善皮肤炎症和水合，PPE录得较高的防晒系数（SPF）值[24]、[26]、[27]。

石榴皮提取物（PPE），特别是在水-醇制剂中，显示出有前景的外用护肤和化妆品使用的安全特性，多项体外研究报告了不同测试浓度下水-乙醇PPE对真皮成纤维细胞的细胞毒性最小[24]、[28]。在动物研究中，外用石榴皮软膏促进了伤口愈合、上皮化、胶原合成和组织修复，没有任何明显的治疗相关风险，表明良好的局部耐受性[29]。同时，在人角质形成细胞试验中，PPE的应用显示出没有细胞毒性或可观察到的形态学刺激迹象[30]。此外，最近的临床试验表明，含有PPE提取物的精华面膜产生了明显的皮肤美白效果，并在人类志愿者中没有引起刺激[31]。这些报道鼓励进一步研究PPE对各种皮肤疾病的潜力。

然而，有限的体内研究调查了PPE成分抗光老化特性所涉及的机制见解，特别是在炎症-线粒体自噬-衰老轴的相互关联调控网络背景下。此外，PPE的治疗功效仍然受到其多酚成分的结构复杂性和高分子量所挑战，这些因素极大地限制了皮肤渗透性、吸收和生物利用度[32]。

基于纳米技术的递送系统现在提供了有效的解决方案来克服这些挑战并增强植物成分的外用性能[33]、[34]。植物磷脂体是一种先进的脂质基囊泡系统，通过植物化学物质与磷脂之间的分子络合形成，与传统草本制剂相比，具有更高的装载效率和更好的皮肤亲和力。在我们最近的研究中，我们证明了所开发的植物磷脂体递送系统通过植物化学物质与磷脂之间建立的分子络合，显著增强了葡萄籽提取物的抗光老化功效[35]。

为了进一步增强真皮渗透，胆盐被纳入以增加囊泡的变形能力和膜流动性。胆盐促进在角质层上的更深渗透，同时增加稳定性并改善包封生物活性成分的真皮滞留[36]。在这方面，双磷脂体代表了一种新型混合纳米载体系统，它结合了植物磷脂体的结构优势与胆盐的渗透增强特性[37]。这种混合结构预计将增强囊泡的柔韧性、皮肤渗透和多酚类化合物的细胞内递送，从而最大化其对抗光老化相关分子目标的生物功效。

新兴研究表明，双磷脂体可以安全地包封多种治疗药物，组织病理学和体内研究通常确认了其外用甚至眼部给药的安全性和良好耐受性[38]、[39]。因此，双磷脂体越来越多地被认为是美容医学化妆品应用中合适的纳米载体。

在本研究中，我们使用LC-HRMS分析表征了PPE的主要生物活性成分。其次，我们开发了PPE-双磷脂体纳米配方，以增强PPE的真皮递送和生物活性。分子对接发现了已鉴定的植物成分与相关光老化关键靶点之间的可能分子相互作用。最后，为探索PPE的潜在机制作用，使用整合的生化、分子和组织病理学分析，在UVB诱导的皮肤光老化模型中检查了粗PPE和PPE加载双磷脂体的抗光老化作用。评估的参数聚焦于与炎症、细胞衰老、线粒体稳态、黑色素生成、胶原重塑和细胞外基质降解相关的网络，以及应激反应调节因子miR-34c-5p。

本研究的呈现是首次将植物化学特征分析、双磷脂体制剂、分子对接和PPE及PPE加载双磷脂体在这一相互关联网络背景下抗光老化活性的机制评估相结合。

材料

埃及石榴（Punica granatum L.）的新鲜果皮采购自埃及市场，并经埃及开罗大学理学院植物学与微生物学系Ibrahim El-Garf教授 graciously 鉴定。在植物材料上进行的实验研究程序遵循相关的机构、国家和国际规范与法规。Lipoid AG，德国，慷慨地提供了卵磷脂（PC）（Lipoid E80）作为免费样品。

PPE中的总酚类和黄酮类含量

PPE中的总酚含量测定为188.81 ± 10.64 μg没食子酸当量/每mg提取物，而总黄酮含量为30.87 ± 2.29 μg芦丁当量/每mg提取物。

PPE的抗氧化活性

PPE表现出良好的DPPH自由基清除活性，IC??值为29.87 ± 2.1 μg/mL，以及ABTS•+自由基阳离子的推测清除潜力，IC??值为11.9 ± 0.63 μg/mL，与Trolox（IC??值分别为7.3和3.2 ± 0.2 μg/mL）相比。

讨论

皮肤光老化是导致超过80%的皮肤老化的原因。UVB暴露损害皮肤微环境，增强癌前角化病变和包括癌和黑色素瘤在内的恶性肿瘤[80]。最新研究表明，不同石榴提取物在皮肤损伤、银屑病、色素沉着和皮肤癌方面有效，因其抗菌、抗氧化和抗炎特性[81]、[82]、[83]。然而，其潜在分子机制……

生成式AI及AI辅助技术在稿件准备过程中的声明

在准备本稿件期间，作者使用ChatGPT来增强语言并在图5部分B的图表中进行部分准备。作者随后严格审查和编辑了所有所需内容。作者对已发表文章的内容承担全部责任。

CRediT作者贡献声明

Hanan Refai：写作——审阅与编辑，写作——原稿，可视化，项目管理，方法学。Mona Elhabak：写作——原稿，方法学，调查。Doaa H. Hassan：方法学，调查，形式分析，概念化。Omar S. Ahmed：写作——原稿，方法学，调查，数据整理。Esraa M. Mohamed：可视化，方法学，调查，概念化。Lina M.A. Abdel Ghany：写作——原稿，可视化，……

未引用参考文献[56]、[119]

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

无。

Hanan Refai | Mona Elhabak | Doaa H. Hassan | Omar S. Ahmed | Esraa M. Mohamed | Lina M.A. Abdel Ghany | Nesrine S. El Sayed | Mariam K. Ahmed | Pierre Waffo-Téguo | Josep Valls | Nermeen Z. Abuelezz

药物制剂学系，药物科学与制药学院，Misr科学与技术大学，埃及吉扎6·10城市，邮政信箱77