《Methods》：A 29-plex MOL-PCR assay for simultaneous detection of selected major, non-typing, and accessory virulence genes in
Clostridium perfringens
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摘要产气荚膜梭菌是人类和动物的重要病原菌，其通过多种毒素和毒力因子引发广泛谱系疾病。精确且覆盖广泛的毒素基因谱分析对于菌株表征和分子流行病学监测具有重要意义。本文描述了一种29重多重寡核苷酸连接PCR（MOL-PCR）检测方法的开发，该方法可同时检测27个重要且关键的产气荚膜
摘要
产气荚膜梭菌是人类和动物的重要病原菌，其通过多种毒素和毒力因子引发广泛谱系疾病。精确且覆盖广泛的毒素基因谱分析对于菌株表征和分子流行病学监测具有重要意义。本文描述了一种29重多重寡核苷酸连接PCR（MOL-PCR）检测方法的开发，该方法可同时检测27个重要且关键的产气荚膜梭菌毒素相关基因——涵盖主要分型毒素以及扩展的非分型及辅助毒力基因面板——从而突破了传统毒素分型框架的限制。该检测方法通过与六种多重实时定量PCR（qPCR）方法进行比较评估。在两种体系中，编码产气荚膜梭菌特异性丝氨酸O-乙酰转移酶（EpsC）的基因被用作物种确证分子标志物，并设置了内部扩增对照以检测潜在假阴性结果。分析特异性测试证实仅在产气荚膜梭菌中发生特异性扩增，测序确认了参考菌株的毒素基因谱。对72株参考菌株和现场分离株（共1944个数据点）的比较分析显示，637个阳性检测结果完全一致，相对于比较用qPCR方法的阳性一致率为100%，阴性一致率为99.7%。qPCR的检测限为100 fg/μl（约3×101个基因组当量；GE），MOL-PCR的检测限为1 pg/μl（约3×102个GE）。尽管具有高多重检测水平，MOL-PCR与qPCR表现出高度一致性。所开发的MOL-PCR方法为产气荚膜梭菌分离株的扩展毒素基因谱分析提供了一种快速、高通量和经济有效的工具，可靶向主要分型毒素及选定的非分型和辅助毒力基因。因此，该方法可支持高级毒素基因表征、分子流行病学以及面向"同一健康"理念的不断演变的毒力景观监测。
引言
产气荚膜梭菌（CP）是人类和动物肠道微生物群中广泛存在的成员，但它也是一种重要病原体，可引起临床表现和严重程度各异的广泛疾病谱系。CP的细胞毒性作用已被广泛研究，疾病结果主要归因于强效毒素和细胞外酶的产生。各分离株的产毒谱存在差异，产生不同的毒素组合或组合形式[1]。基于六种关键毒素的存在或缺失——α毒素（CPA）、β毒素（CPB）、ε毒素（ETX）、ι毒素（ITX）、肠毒素（CPE）和NetB——CP菌株被分为七种毒素型（A-G）。这些毒素型在宿主范围和疾病关联方面存在差异。在人类中，毒素型A主要与气性坏疽有关，而毒素型F与食物中毒和抗生素相关性腹泻有关。其他毒素型主要与动物疾病相关[2]。
除分型毒素外，CP还产生多种具有临床意义的其他毒素，包括穿孔素O、λ毒素、β2毒素、坏死性肠炎样毒素等[2]。这些非分型毒素通过与主要分型毒素协同作用，破坏宿主细胞完整性、损伤组织、触发促炎反应、在细胞膜上形成孔道等机制发挥作用。此外，CP还产生大量细胞外降解酶，主要包括胶原酶、透明质酸酶（μ毒素）、唾液酸酶（神经氨酸酶）和蛋白酶[3]。这些因子共同加剧肠道和全身性感染，从而放大CP的总体致病潜力[3]，[4]。
CP的主要毒素基因大多由质粒编码。例外包括编码α毒素（CPA）的plc基因，该基因在所有菌株中均位于染色体上，以及编码肠毒素的cpe基因，该基因可能位于染色体或质粒上[5]。在非分型毒素中，编码穿孔素O的pfoA也是染色体编码的[6]。相比之下，β毒素（cpb）、ε毒素（etx）、ι毒素（iap/ibp）、质粒型肠毒素（cpe）和NetB（netB）基因已被鉴定存在于45至超过140 kb的质粒上[7]。这些质粒通常携带tcp位点，可实现接合转移，以及插入序列元件，促进菌株间的水平基因交换[8]。实验研究表明，质粒可在分离株间高效转移，驱动毒力决定因子在CP群体内的快速传播[9]，[10]。这种新毒素基因的水平获取不仅解释了疾病表现的变异，也奠定了新型毒素型（如F和G型）出现的基础[1]，甚至CP菌株携带了潜在的新的分型与非分型毒素组合[11]。
毒素基因的水平转移可能使CP分离株的诊断和毒素分型复杂化。产毒CP的检测依赖于表型和分子方法的组合。传统方法包括在选择性培养基上培养后进行毒素活性的体外检测，如细胞毒性试验[12]或免疫分析（如ELISA；[13]）。由于缺乏灵敏度和特异性，这些方法已被分子生物学方法取代，尤其是基于PCR的检测方法，该方法已成为毒素分型的标准。针对多个毒素基因的多重PCR可同时对分离株进行快速且特异性的分型区分[14]。第一个多重PCR实现了五种最初确定的毒素的检测，即α、β、ε、ι毒素和肠毒素[15]。后来，其他非分型毒素如β2毒素[16]或作为新定义分型毒素的NetB被纳入分类系统[1]。目前，Rood等人（2018年）的CP分类系统被普遍接受[1]；但目前尚不存在全面表征CP菌株的官方标准化方法[17]。
多重实时定量PCR（qPCR）提供了灵敏且可靠的选择。然而，由于同时检测目标数限制在最多五个、最多六个，其应用通常仅限于主要产毒基因。虽然许多其他非分型毒素基因和额外毒力相关酶可影响致病性、毒力和菌株多样性[3]，但其纳入需要组合使用多个多重检测。此外，由于大多数CP毒素基因携带于接合质粒上[5]，[8]，任何菌株都有可能获取新的毒力基因或成为新型毒力因子组合的储库[10]。这对流行病学和公共卫生具有深远影响，也对基于毒素基因谱的分型系统的可靠性和适用性产生影响[9]。
多重qPCR方法的局限性可通过多重寡核苷酸连接PCR（MOL-PCR）结合xTAG珠阵列技术来克服，该技术可在单次反应中同时检测大量目标[18]。在该方法中，成对的合成寡核苷酸（MOLigos）被设计为结合特定基因组序列的相邻区域。当两个MOLigos正确退火时，它们被DNA连接酶共价连接，产生独特的连接产物，作为后续扩增的模板。这些连接片段随后通过与携带荧光标记的通用引物对进行扩增。所得PCR产物杂交至xTAG编码的磁性微球上，每种珠型对应于特定目标序列。信号采集在悬浊液阵列读取器上进行，如MAGPIX平台（Luminex Corp.），该平台解码珠的身份并定量荧光强度。该方法提供了高水平的多重检测能力，可在单次检测中以短时间处理量和适中成本检测数十种细菌物种或其他任何目标。
本工作的目的是开发并优化一种29重MOL-PCR检测方法，用于同时检测CP分离株中27个选定的毒素编码基因，并辅以六种多重qPCR方法进行比较评估MOL-PCR结果。检测方法包括CP特异性丝氨酸O-乙酰转移酶EpsC基因作为阳性对照，以确认所分析分离株的CP身份，以及内部扩增对照（IAC）以检测潜在的qPCR和MOL-PCR抑制。MOL-PCR的开发和优化建立在此前建立的概念基础上，纳入了关键改进，如预扩增步骤和新型连接产物纯化程序，这些改进已被证明可显著降低悬浊液阵列检测平台的背景噪声[19]。这些改进确保了该检测方法适用于毒素基因谱分析的特定需求。检测方法的优化和分析评估包括使用具有确认毒素基因谱的参考菌株对qPCR和MOL-PCR的分析特异性（包容性/排他性）和灵敏度的评估。MOL-PCR和多重qPCR检测方法的最终版本使用72株参考菌株和现场分离株面板进行了评估。这种双体系方法使得能够在单一分析工作流程中对CP分离株进行可靠且扩展的毒素基因表征。
章节摘要
样本特征
本研究分析了两个主要的CP样本组，用于评估所开发检测方法的分析特异性（包容性/排他性）和分析灵敏度。第一组包括一株CP参考菌株和40株额外参考菌株，代表了一个分类学上多样化的面板，涵盖系统发育相关的梭菌属物种以及不相关的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌（表1）。非CP菌株被专门选择以反映常见微生物类群
结果与讨论
通过分析CP特异性丝氨酸O-乙酰转移酶EpsC基因在CP菌株、其系统发育相关物种和不相关类群中的存在情况，确认了靶向该基因的qPCR和MOL-PCR的分析特异性（表1，表2）。这种方法确保了检测方法排他性的稳健评估，并有助于排除复杂实际样本背景中可能的交叉反应。丝氨酸O-乙酰转移酶EpsC序列在此首次被用于
结论
总之，本研究介绍了一种29重MOL-PCR检测方法，用于同时检测CP分离株中27个选定的毒素相关基因。该MOL-PCR方法通过与六种多重qPCR方法进行比较进行了评估。两种方法均显示出高分析特异性，丝氨酸O-乙酰转移酶（EpsC）基因被确认为可靠的CP标志物。对72株参考菌株和现场分离株（1944个数据点）的比较测试显示，所有637个q-PCR阳性目标检测结果均一致，
资金支持
本工作由捷克共和国农业部国家农业研究局资助，项目编号QK22010086。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢Gabriela Kalinová在DNA分离和qPCR分析方面提供的杰出技术支持。
Michaela Nesvadbova｜Radka Dziedzinska｜Martin Klanica｜Petr Kralik
布拉格兽医科学大学动物来源食品与美食科学系，捷克共和国布拉格
