基于Cu@C-AuNPs纳米酶的pH响应性双模式比色-电化学适体传感器用于食品中黄曲霉毒素B1的检测

《Microchemical Journal》：pH-switchable dual-mode colorimetric-electrochemical aptasensor utilising cu@C-AuNPs nanozyme for the detection of aflatoxin B1 in food

　　

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  荷叶柄衍生的碳材料表现出酶样活性。
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  Cu@C-AuNPs 的多种酶样活性可通过 pH 值切换。
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  成功构建了比色 - 电化学双模式适配体传感器。
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  传感器的检测限低至 4.35 × 10^?6 ng mL^?1。
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  所开发的方法适用于控制大米中的 AFB1。

引言

黄曲霉毒素 B1 (AFB1) 是一种高毒性的真菌毒素。它主要由黄曲霉 (Aspergillus flavus) 和寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus) 等真菌合成，并经常污染谷物、坚果和香料等农产品 [1], [2], [3]。AFB1 具有强力的肝致癌性、基因毒性和免疫抑制特性。国际癌症研究机构 (IARC) 将其列为 1 类人类致癌物 [4], [5]。食用受 AFB1 污染的食物对人类健康构成严重风险。认识到这一健康风险，中国已建立 AFB1 最大残留限量标准，大米中为 10 μg/kg，牛奶中为 0.5 μg/kg。因此，有效监测和准确量化进入市场食品中的 AFB1 是防止暴露风险、确保食品安全和公共卫生的必要措施。

目前，AFB1 检测的常规分析技术包括薄层色谱法 (TLC) [6]、高效液相色谱法 (HPLC) [7]、液相色谱 - 串联质谱法 (LC-MS/MS) [8] 和酶联免疫吸附测定 (ELISA) [9]。这些方法具有高精度、可靠性和可重复性。然而，它们也存在一些缺点。局限性涉及高成本、依赖精密仪器以及需要受过专业训练的人员。此外，制备针对小分子的特定抗体非常困难。这些缺点阻碍了在资源受限条件下进行高通量、现场、快速、简单和低成本的筛选 [10]。因此，迫切需要开发简单、可视化和快速的检测平台。

针对现场检测的需求，电化学和比色传感器获得了相当多的研究关注 [11], [12]。电化学传感器实现了高灵敏度。然而，它们依赖固定的工作台且缺乏视觉读数，限制了其在现场测试中的适用性。比色传感器允许视觉定性观察。定量测量可通过紫外分光光度计进一步实现 [13], [14]。尽管如此，它们容易受到样品背景颜色、浊度和环境光的干扰。这个问题通常导致不满意的定量准确性和增加假阳性或假阴性结果的可能性。为了克服单一传感模式的局限性，可以通过整合两个独立信号构建双模式传感器，以实现交叉验证并提高检测准确性 [15], [16], [17]。例如，He 等人构建了一个基于 UiO-66-NH₂(Ce) 的无串扰双模式生物传感平台，用于灵敏检测 α-葡萄糖苷酶活性和抑制剂筛选。这种互补检测策略能够通过信号交叉验证准确量化 α-葡萄糖苷酶，并表现出显著的自校准能力，从而可以最大限度地减少假阳性信号 [18]。因此，结合高灵敏度的电化学方法和视觉比色法构建双模式传感器以准确检测 AFB1 是可行的。

近年来，碳基纳米酶为突破电化学和比色传感器中单信号输出的局限性提供了材料基础。这一进展促进了双模式检测的发展 [19], [20]。碳基纳米酶可以使用食品加工残留物进行绿色合成。典型的例子包括来自稻草的类过氧化物酶荧光碳量子点 (CQDs) [21] 和来自玉米芯的类过氧化物酶 CQDs [22]。然而，纯碳纳米酶表现出微弱的酶样活性。这种活性不足以构建高灵敏度的现场传感器。因此，研究人员将碳材料与其他功能材料结合以调节其催化性能。相应地，制备复合纳米酶已成为一种重要策略。例如，通过表面杂化与金属纳米粒子（如 AgNPs 和 PtNPs）结合，可以增强来自油棕果柄的碳点的类过氧化物酶活性 [23]。同样，在来自浒苔 (Enteromorpha prolifera) 的碳上生长 MoO₃ 纳米棒也被证明能显著增强其类过氧化物酶活性 [24]。这些例子证明复合改性有效地解决了纯碳纳米酶的固有缺陷。复合工程带来的好处不仅仅是提高催化活性。它还可以通过合理的结构设计实现可控和多用途的功能。一个典型的例子是在某些碳基复合纳米酶中发现的 pH 依赖催化行为。Ga 等人报道了一种虾壳衍生的磁性 NiFe₂O₄/N、O 共掺杂多孔碳纳米酶，具有可切换的催化功能 [25]。该材料在 pH 4.6 时表现出类氧化酶和类过氧化物酶活性。在 pH 7.4 时，它表现出类过氧化氢酶活性。这种 pH 响应、可切换的催化模式允许一种材料驱动不同的化学反应。这些反应包括在匹配 pH 条件下的电化学和比色过程。这种特性极大地扩展了其在复杂传感系统中的应用潜力。

在此，我们报道了一种基于 Cu@C-AuNPs 纳米酶的比色 - 电化学双模式适配体传感器，用于高度灵敏和准确地检测 AFB1。该纳米酶表现出 pH 可切换的双酶样活性。具体而言，在酸性条件下 (pH 4.0)，它表现出类过氧化物酶活性，催化 H₂O₂ 氧化 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 (TMB) 以产生比色信号。在弱碱性条件下 (pH 7.4)，该纳米酶表现出类过氧化氢酶活性。它将 H₂O₂ 分解为氧气。该过程加速了电极界面的电子转移并大大增强了电化学响应信号。与单信号检测相比，这种双模式适配体传感器支持多维信号的相互验证和互补。该策略有效提高了针对 AFB1 的可靠性、抗干扰能力和检测准确性。同时，它扩展了在复杂真实食品基质中的适用性和检测灵活性。

部分摘录

材料与试剂

本研究中使用的所有化学试剂均为分析纯，且未经进一步纯化直接使用。TMB 和 6-巯基 -1-己醇 (MCH) 购自上海阿拉丁生化科技有限公司 (中国上海)。二水合氯化铜 (CuCl₂·2H₂O)、羧甲基纤维素 (CMC) 和四氯合金酸四水合物 (HAuCl₄·4H₂O) 购自国药集团化学试剂有限公司 (中国上海)。柠檬酸钠 (C₆H₅Na₃O₇·2H₂O) 购自西陇科学

Cu@C-AuNPs 的表征

通过 SEM、TEM 和 EDS 分析了合成复合材料的形态特征和化学成分。TEM 显示 LPC (图 2A) 具有光滑、致密的片状结构，确认了清洁碳载体的形成，而图 2B 显示 AuNPs (约 20 nm) 在碳片上均匀分散，验证了 AuNPs 的成功固定。SEM 成像 (图 2C) 进一步确认了复合材料保留了复杂的分级片状

结论

总之，成功开发了一种具有多酶活性的 pH 可切换 Cu@C-AuNPs 纳米酶，用于构建双模式适配体传感器，以高度灵敏地检测大米中的 AFB1。该适配体传感器通过纳米酶卓越的 pH 可切换双酶活性实现有效的信号放大，同时通过适配体 (Apt) 与靶分子之间的特异性识别确保检测选择性。此外，AuNPs 作为传感底物，有效

作者贡献声明

任春燕：写作 – 初稿，监督，方法论，调查，形式分析。 丁国良：监督，方法论，调查。 陈梦如：方法论，调查，形式分析。 陈晓军：写作 – 审阅与编辑，概念化。 彭刚：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，监督，调查，资金获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到安徽省高校自然科学研究项目 (编号：KJ2021A0887)、安徽省自然科学基金 (编号：2008085QC157)、安徽科技学院人才引进基金 (编号：SPYJ202002)、2024 年安徽省高校优秀研究与创新团队 (2024AH010007) 以及安徽科技学院科技创新团队项目的资助

任春燕 | 丁国良 | 陈梦如 | 陈晓军 | 彭刚