《Microchemical Journal》：Discovery of bioactive inhibitors from complex natural products based on nanozyme biosensor
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•开发了一种基于人工酶检测XOD活性的方法。•开发了一种用于酶抑制剂筛选的生物传感器辅助计算机分析技术。•从复杂的天然产物中筛选出了一种XOD抑制剂。引言黄嘌呤氧化酶作为体内嘌呤代谢的关键酶，可以催化次黄嘌呤和黄嘌呤的氧化生成尿酸[1]。其异常活性与痛风和高尿酸血症等多种疾病的发
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开发了一种基于人工酶检测XOD活性的方法。
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开发了一种用于酶抑制剂筛选的生物传感器辅助计算机分析技术。
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从复杂的天然产物中筛选出了一种XOD抑制剂。
引言
黄嘌呤氧化酶作为体内嘌呤代谢的关键酶，可以催化次黄嘌呤和黄嘌呤的氧化生成尿酸[1]。其异常活性与痛风和高尿酸血症等多种疾病的发展密切相关[2],[3]。黄嘌呤氧化酶是治疗痛风、高尿酸血症及相关疾病的有希望的目标[4],[5]。典型的黄嘌呤氧化酶抑制剂，如别嘌醇和非布司他，具有显著的降尿酸效果，但这两种药物也会引起不可避免的副作用和安全隐患[6],[7]。别嘌醇可能导致发热、腹泻、肝炎和肾功能衰竭[8]，而非布司他可能增加心血管疾病、急性肾损伤和过敏反应的风险[9]。由于天然产物具有新颖的结构、多样的生物活性和良好的安全性，从天然产物中筛选生物活性分子引起了越来越多的关注[10],[11]。因此，复杂的天然产物基质被认为是发现安全有效酶抑制剂的理想来源。然而，天然产物系统的固有复杂性以及传统筛选方法的局限性，使得开发高效、灵敏和高特异性的筛选方法成为药物发现领域的一个关键且紧迫的挑战。
生物传感器将生物分子识别元件与物理化学信号转导相结合，有效地克服了传统方法在检测复杂基质方面的局限性，为便捷地检测生物活性天然产物成分提供了可靠的手段。例如，使用装饰有穿梭形状α-Fe?O?纳米粒子的多壁碳纳米管构建了一种电化学传感器，能够高灵敏度地检测复杂中药基质中的黄芩素[12]。然而，生物传感器的性能在很大程度上取决于信号传导材料的功能特性。因此，开发新型高性能材料已成为这一领域的关键要求[13],[14],[15],[16],[17],[18],[19],[20]。对其结构的精确调控已成为实现功能优化的核心策略，并为生物传感和精准医学的集成发展开辟了新的途径。共价有机框架（COFs）是一类新型晶体多孔聚合物，具有高比表面积、定义明确的规则孔隙、可调的功能性和在恶劣介质中的优异稳定性，这使得它们在生物传感器领域得到广泛应用[21],[22],[23]。此外，金属共价有机框架（MCOFs）由于其能够在稳定的COFs中整合共价键和金属配位，从而引入活性金属位点，因此具有显著的酶模拟特性[24]。这不仅提高了活性金属中心的稳定性，还增强了它们的催化活性，使其在仿生酶生物传感器领域得到广泛使用[25],[26],[27],[28]。例如，Li等人利用发光COFs作为荧光指示剂，构建了一个简单的传感平台来筛选α-Glu和β-Glu抑制剂[29]。因此，基于COFs的生物传感技术在筛选酶抑制剂复杂系统中展现了强大的应用潜力。然而，应该注意的是，生物传感技术在快速识别复杂系统中的生物活性分子方面仍面临挑战。
我们的研究小组建立了一系列基于亲和层析的目标筛选技术，以实现复杂系统中活性化合物的高效分析[30],[31],[32],[33]。天然产物的基质非常复杂，共存成分会产生显著的基质效应，使得难以准确量化目标活性成分[34]。计算机辅助的虚拟筛选能够识别更有前景的化合物，有效减少药物筛选的试错性质，缩短开发周期并降低成本。主要方法包括分子对接、反向分子对接、药效团搜索、QSAR建模、机器学习方法和综合策略。与基于全局网络拓扑的优先级排序框架（如Li等人的基因介导的三部分异质复合网络模型[35]）相比，分子对接专注于化合物与目标蛋白之间的直接结合相互作用，当目标结构已知时，可以快速进行初步筛选并降低计算成本。由于在可访问性和预测效率方面的显著改进，这种方法逐渐应用于药物发现研究[36],[37],[38],[39]。例如，分子对接可用于预测小分子配体与大分子受体之间的相互作用，并可与分子动力学模拟结合，以提高区分活性和非活性化合物的能力，从而提高筛选效率[40]。分子对接和分子动力学模拟的结合已被用于分析严重急性呼吸综合征冠状病毒2蛋白酶（SARS-CoV-2 M）的潜在抑制剂[41],[42]、具有治疗2型糖尿病潜力的α-葡萄糖苷酶抑制剂[43]，以及具有抗炎和抗癌特性的微粒体前列腺素E2合成酶-1（mPGES-1）抑制剂[44]。这种策略可以显著减少发现过程所需的时间和成本，并增加成功识别抑制剂的机会。尽管现有的计算机辅助药物筛选技术在药物发现方面展现了前所未有的速度和规模，但仅使用单一计算方法实现高精度、低假阳性的筛选仍然具有挑战性。因此，将计算筛选与现有实验技术相结合是识别复杂系统中生物活性成分的一种时间高效且实用的方法。
在这项研究中，提出了一种生物传感器辅助的计算机虚拟筛选策略，以开发和验证一种用于筛选复杂系统中活性化合物的有效模型。通过将快速生物传感器检测与成本效益高的计算机辅助筛选相结合，这种组合方法在识别生物活性化合物方面具有显著优势，尽管在这一领域仍很少被探索。为了验证这一策略，选择黄嘌呤氧化酶作为研究目标，并建立了一种基于共价有机框架（Fe-COF）酶模拟策略的比色传感分析方法。图1展示了Fe-COF的制备和工作原理。在该系统中，黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶催化生成过氧化氢（H?O?），随后Fe-COF将其转化为羟基自由基（·OH），氧化TMB产生蓝色[45]。基于此，开发了一种用于监测黄嘌呤氧化酶的生物传感分析方法。使用所提出的生物传感方法，可以快速筛选抑制黄嘌呤氧化酶的复杂系统。同时，采用了计算机辅助的药物筛选策略进一步识别目标生物活性分子。在本筛选研究中，橡实提取物表现出显著的黄嘌呤氧化酶抑制活性。随后通过分子对接和分子动力学模拟，最终确定紫黄素是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂。这一综合模型旨在为从复杂系统中快速筛选生物活性成分提供新的参考，有望作为传统单一筛选方法的有效补充。
章节片段
材料和试剂
黄嘌呤氧化酶（XOD）、黄嘌呤、1,3,5-三(4-氨基苯)苯（TAPB）、间苯三烃、1,4-二氧杂环和二氟甲磺酸铁（II）（Fe(OTf)?）从Energy Chemical有限公司（上海，中国）购买。3,3′,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）、醋酸、聚达汀、扎那米韦、氨苄西林钠和阿加曲班从Aladdin生物技术有限公司（上海，中国）获得。3,3′-联吡啶-6,6′-二羧醛（BPA）从Macklin生物技术公司获得
Fe-COF的制备和表征
使用TAPB和BPA作为原料，在Fe(OTf)?和醋酸的存在下，Fe-COF在室温下快速聚合（图S1）。扫描电子显微镜图像和透射扫描电子显微镜（图S1B，C）显示制备的Fe COF具有堆叠的纳米块结构。能量色散X射线光谱图像表明Fe、C和N元素在TEM元素映射区域内均匀分布（图S1D）。傅里叶变换红外光谱
结论
总之，本研究通过将基于纳米酶的比色生物传感器与计算机辅助虚拟筛选相结合，建立了一个针对XOD抑制剂的筛选平台。该平台能够简单快速地监测XOD活性，并成功应用于样品水平上识别橡实提取物中的XOD抑制活性。通过计算机辅助虚拟筛选，从橡实提取物的化学成分中鉴定出紫黄素作为XOD抑制剂。
CRediT作者贡献声明
赵 wangyan:撰写 – 原始草稿、方法学、概念化。张 shuxian:可视化、软件、概念化。范 Xiaoxuan:资源、调查。杨 lingling:方法学、数据管理。刘 keshuai:软件、正式分析。梅 rui:软件、正式分析。韩 qiang:监督、数据管理。何 xin:调查、正式分析。艾 yongjian:方法学、资金获取。梁 qionglin:方法学、资金获取。马 xueqin:监督、资金
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文报道工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFC3504401, 2022YFA1103403）、国家自然科学基金（82360684, 82574366）、宁夏自然科学基金（2025AAC040008）、宁夏医科大学关键研究项目最佳候选人公开竞争机制（XJKF240330）以及六盘山区药用资源保护、开发和利用重点实验室的研究项目的财政支持
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