采用MALDI MSI、ATR/FTIR和拉曼成像技术进行多模态成像，研究光照和SO?引起的羊皮纸降解

《Microchemical Journal》：Multimodal imaging using MALDI MSI, ATR/FTIR and Raman imaging to study light- and SO 2-induced degradation in parchment

　　摘要亮点- 一种整合光谱学和质谱成像的多模态工作流程揭示了羊皮纸中新的分子降解标志物。- 结合傅里叶变换红外（FTIR）和拉曼成像揭示了皮下蛋白降解。- 原位自下而上的蛋白质组学表征了胶原蛋白、糖蛋白和蛋白聚糖，并揭示了羊皮纸中的蛋白降解模式。- 高准确度MALDI FT-ICR MSI实现了对不同老化条件下特有脂质及相关降解产物的非靶向鉴定。引言羊皮纸自古以来一直是手稿、文化文物和法律文件的主要书写载体[1]，在造纸术确立之后仍持续使用，例如用于教皇和皇家文件，一直延续到19世纪[2]。其制造过程涉及化学和机械步骤的复杂组合，将通常来源于小牛、山羊或绵羊的原始动物皮革，通过石灰处理、脱毛、拉伸和张力干燥等工艺进行转化[1][3][4]。分步处理过程有助于去除皮下组织和表皮，最终形成以蛋白质为主的基质，包含多种胶原蛋白类型和其他大分子[5][6]，其结构与完整皮肤明显不同。尽管在石灰处理过程中大部分皮肤脂质已被去除，但最终产品中仍残留一部分脂质[7]。特别是，羊皮纸因其真皮中丰富的次级毛囊而被描述为富含脂质，相关的皮脂腺在表皮下方形成了独特的脂质层。尽管羊皮纸具有高度的耐久性，但它仍易受光线、温度波动、湿度或污染物等环境胁迫因素的影响。这些胁迫因素可能导致机械和化学性能减弱，威胁到羊皮纸文件的长期保存。包括氧化、水解或胶原蛋白变性在内的过程在多个层次上影响复杂的胶原蛋白层级结构，包括其基本结构单位——原胶原，即三条多肽链的三重螺旋组装体，具有重复的（?Gly-X-Y-）_n序列基序。早期损伤评估和对羊皮纸降解的详细理解对于保存羊皮纸文物和维护其文化价值至关重要。迄今为止，关于羊皮纸降解的分析研究主要集中于人工老化实验，并主要采用光谱分析手段。大多数研究评估温度、湿度和光照引起的降解，而关注污染物（如NO_x或SO₂）影响的研究[8]则较少受到关注。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼光谱[9][10][11]，以及色谱、热重和显微技术[12][13][14][15]已被广泛用于研究胶原蛋白的结构完整性[9][16][17][18][19][20][21][22][23][24][25]。近年来，蛋白质二级结构分析（对结构变化敏感）提供了对构象变化的更深入洞察。特别是，通过对FTIR和拉曼光谱中酰胺基团进行二级导数介导的解卷积[26][27][28][29]，提供了有用的指标。然而，光谱学羊皮纸研究缺乏分子特异性，且迄今为止空间分辨率尚不足以表征这种异质材料中的局部降解效应。在过去二十年中，组学技术已被引入羊皮纸研究领域，蛋白质组学分析已成为利用胶原蛋白肽质量指纹图谱（PMF）进行羊皮纸高通量物种鉴定的工具[30]。这些蛋白质组学方法主要聚焦于1型胶原蛋白（COL1），即真皮组织中最丰富的胶原蛋白，以提供分类学信息。降解诱导的修饰研究较为稀少，主要关注生产和降解引起的天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺作用[31]。其他胶原蛋白类型、低丰度的细胞外基质（ECM）蛋白质及其降解行为尚未得到系统研究。此外，脂质长期以来一直被认为是羊皮纸的固有组成成分，因为尚不清楚它们是在制造之前存在的还是在制造过程中引入的[7][23][24][32][33]。直到2020年，Fourneau等人通过组织学研究发现，脂质在制造过程之后被确认为羊皮纸的固有组成成分[5]。至今为止，脂质研究主要采用衍生化方法结合色谱分析对羊皮纸整体或表面采样样品进行靶向分析。本文介绍了一项关于羊皮纸降解的综合性概念验证研究，采用多模态工作流程，整合空间分辨光谱成像和质谱成像（MSI），展示了更高分辨率的分子信息如何增强对材料状况的理解和评估。将羊皮纸样品分别暴露于光照和二氧化硫（SO₂）中。SO₂是一种具有历史意义的大气污染物[34]，由自然和人为过程产生，包括基于燃烧供暖和照明以及有限的烟雾排放，这些都是羊皮纸在现代档案和博物馆受控条件之前储存期间可能暴露的环境。制备羊皮纸薄切片以获取微尺度水平的空间信息，包括从材料更深层获取信息，而不仅限于样品表面。为了实现在不同模态之间的关联，实验在连续切片上进行，使用（1）FTIR光谱成像、（2）拉曼光谱成像（RSI）、（3）自下而上的蛋白质组学基质辅助激光解吸电离（MALDI）MSI和（4）脂质组学MALDI MSI。为扩展蛋白质组覆盖范围，使用两种具有不同蛋白序列切割位点的互补蛋白酶——胰蛋白酶/LysC和胶原酶III（COLase III）[35]。COLase III因其对独特的（?Gly-X-Y-）_n基序的高特异性而广泛用于富含胶原蛋白的组织[36]。尽管脂质有可能作为降解标志物并在羊皮纸中引入进一步的氧化物种，但迄今为止脂质研究仍然有限。因此，非靶向脂质分析增加了对固有脂质种类及其局部降解行为的了解，对损伤评估前景可期。章节摘要化学品和试剂乙醇（HPLC级）、三氯甲烷（HPLC级）和乙酸（>99.8%）购自Honeywell（美国新泽西州莫里森）。碳酸氢铵、α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、1,5-二胺萘（1,5-DAN）、聚-L-赖氨酸和IGEPAL? CO-630购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。甲酸钠（>99%）购自VWR（美国宾夕法尼亚州拉德诺）。硫酸钾（K₂SO₄，>99.99%）购自chemPUR（德国卡尔斯鲁厄）。质谱级光谱成像揭示羊皮纸深层蛋白质二级结构的局部构象变化ATR/FTIR光谱成像和RSI被用于追踪羊皮纸蛋白超分子组织中的降解诱导变化。重点分析了特征酰胺I、II和III基团，这些基团主导中红外（MIR）和拉曼光谱的指纹区。尽管三个酰胺基团均与蛋白质中的肽键相关，但它们来源于不同的振动：酰胺I基团代表C=O伸缩振动以及蛋白质结论这项概念验证研究展示了利用综合性多模态方法研究羊皮纸组成及其降解的优势。整合（1）ATR/FTIR和（2）RSI，辅以（3）蛋白质组学和（4）脂质组学MALDI MSI，提供了从分子到中观尺度的结构和化学转变的连贯视图。ATR/FTIR和拉曼成像解析了光照和SO?老化后蛋白质基质中的构象变化，从有序的螺旋结构向CRediT作者贡献声明Antonia Malissa：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿撰写，可视化，方法学，调查研究，形式分析，数据管理，概念化。Jan Kleibl：方法学。Ji?i Vnou?ek：方法学。Federica Cappa：撰写——审阅与编辑，监督。Manfred Schreiner：撰写——审阅与编辑，监督。Martina Marchetti-Deschmann：撰写——审阅与编辑，监督，资源，形式分析，数据管理，概念化。资金来源Antonia Malissa是奥地利科学院DOC基金的获得者，任职于维也纳工业大学（TU Wien）化学技术与分析研究所。作者感谢TU Wien图书馆通过其开放获取基金计划提供的资金支持。利益冲突声明作者声明他们不存在任何已知可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。致谢感谢Monika Debreczeny在FTIR和拉曼显微镜实验中的帮助。LUMOS II和XploRA? INV拉曼显微镜由BOKU核心设施多尺度成像中心提供。本研究由TU Wien和奥地利联邦教育、科学与研究部（2016）资助（拨款编号：HRSM20）。Antonia Malissa | Jan Kleibl | Ji?i Vnou?ek | Federica Cappa | Manfred Schreiner | Martina Marchetti-Deschmann