改进的全菌SELEX用于椰疫刃杆菌特异性适配体筛选：靶标鉴定与结合机制

《Microchemical Journal》：Improved whole-bacteria SELEX for specific aptamer screening of Burkholderia gladioli pv. cocovenenans: target identification and binding mechanism

　　

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  改进的SELEX技术筛选获得了一种针对B. cocovenenans的高亲和力适配体。
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  BamD同源蛋白被验证为适配体传感的一种新型细菌靶标。
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  揭示了多价非共价适配体–BamD协同结合模式。
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  该适配体为B. cocovenenans的分析检测提供了新工具。

引言

Burkholderia gladioli pv. cocovenenans（B. cocovenenans）是一种毒力极强的食源性病原菌，对人类公共健康构成严重威胁，频繁引发致死性食物中毒事件，并伴有高死亡率[1]。其强大的致病性主要源于两种具有毒性的次级代谢产物：毒素黄素（toxoflavin）和崩克酸（bongkrekic acid, BA）。作为一种耐热性线粒体毒素，BA能够抑制线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶活性，破坏细胞内能量代谢，最终导致死亡[2]。流行病学数据显示，B. cocovenenans中毒的死亡率差异很大，在30%至100%之间[3]。严重的中毒暴发事件已在莫桑比克、印度尼西亚和中国台湾地区得到证实，其中重症患者的死亡率峰值达到85.7%[4], [5], [6]。因此，迫切需要发展针对该病原体的快速、精准、可现场部署的分析检测方法，以遏制食源性疾病暴发，保障公共卫生安全。

传统的微生物培养是B. cocovenenans鉴定的金标准。然而，该方法通常需要3–5天才能得出检测结果，无法满足食物中毒紧急情况下的快速筛查需求[7]。虽然实时PCR能够实现快速且高精度的病原体检测，但该技术要求昂贵的高温循环仪和专业训练的技术人员，且其可靠的检测范围有限，仅为10³–10⁸ CFU/g [8]。这些局限性凸显了开发简单、稳定、便携的分子识别探针以实现痕量病原体定量的迫切需求。凭借低生产成本、便捷的化学修饰、良好的稳定性以及出色的特异性识别能力等独特优势，适配体已被广泛认为是有望替代传统抗体用于食源性细菌检测的理想选择。众多基于适配体的生物传感平台已实现了低于5 CFU/mL的检测限，用时仅需30分钟[9], [10], [11]。

适配体是能够特异性结合多种靶标的单链DNA（ssDNA）或RNA寡核苷酸，这些靶标包括小分子毒素、蛋白质、完整细菌细胞和病毒[12], [13]，已成为食品安全监测领域强大的分子识别工具。已开发了多种优化的SELEX方案，以提高筛选获得的适配体的亲和力、特异性和结构稳定性。然而，大多数传统靶标固定化SELEX策略依赖于纯化且预先定义的靶标分子，这限制了未被报道的细菌表面生物标志物的发现，并增加了与同源蛋白发生交叉反应的可能性。与固定化SELEX不同，全细菌系统进化可匹配配体的指数富集技术（WB-SELEX）以完整活细菌作为筛选基质，无需事先了解其表面蛋白谱。该方法保留了细菌膜靶标天然的空间构象，从而实现针对天然表面表位适配体的高效筛选[14]。然而，传统的WB-SELEX仍面临三个突出的技术瓶颈。筛选终点的判定仅依赖经验性迭代，容易导致目标序列富集不足或非特异性干扰序列过度扩增。此外，传统筛选仅针对目标菌株进行正选，通常只能得到抗干扰能力较差的适配体，从而在复杂食品基质样本检测中产生严重的假阳性信号。更重要的是，大多数传统WB-SELEX研究止步于候选适配体的亲和力验证，缺乏对适配体识别的具体膜靶标及其分子水平结合机制的深入探究，严重制约了后续生物传感识别元件的理性设计与功能优化。因此，迫切需要一种优化的、可靠的、通用的WB-SELEX策略来筛选具有高特异性的食源性病原检测适配体，并系统阐明其分子识别机制。

本研究开发了一种优化的WB-SELEX策略，以解决上述局限性，实现了靶标的特异性鉴定以及筛选所得适配体分子间结合方式的系统阐明。如图1A所示，采用定量实时PCR（qPCR）结合融解曲线分析来动态监测文库富集过程并精确定义筛选终点，同时对自然共存菌株进行负选以去除非特异性序列。经高通量测序和亲和力验证后，确定Apt-28是亲和力最高、针对完整B. cocovenenans的最佳适配体。如图1B所示，通过磁珠富集和蛋白质组质谱技术，首次确认外膜蛋白BamD同源蛋白是Apt-28的特异性靶标。此外，通过分子对接、圆二色性光谱和共聚焦激光扫描显微镜系统探究了Apt-28与BamD同源蛋白之间的多价协同结合机制。本研究不仅为快速病原检测提供了一种高特异性识别探针，还建立了一个针对食源性病原体的适配体筛选通用升级版WB-SELEX平台。Apt-28潜在的抗菌活性将在未来研究中加以探索，而本工作重点聚焦于其在快速病原检测中的分析应用。

部分摘要

细菌菌株与培养条件

本研究使用的所有细菌菌株均来自美国菌种保藏中心（ATCC）、中国医学文化物保藏中心（CMCC）和中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。B. cocovenenans ATCC 33664被用作正选的目标菌株。几种常见的食源性病原菌株，包括大肠杆菌（E. coli）ATCC 35150、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）ATCC 14028、金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC

WB-SELEX预筛选关键参数的优化

PCR扩增是整个WB-SELEX流程中最关键的步骤之一。不当的扩增设置，尤其是过多的热循环次数，通常会引发严重的非特异性扩增和PCR偏差，这不可避免地会降低文库多样性，最终导致适配体筛选失败[25]。因此，在正式开展全细菌筛选之前，系统优化了ssDNA文库的PCR扩增条件。如图S1所示，

结论

采用优化的WB-SELEX策略成功筛选出针对B. cocovenenans的高亲和力ssDNA适配体。Apt-28表现出优异的性能，其K_d值为270.2 ± 20.9 nM，并具有良好的特异性。通过表面成分消耗、免疫沉淀实验和质谱分析，确认外膜蛋白BamD同源蛋白是Apt-28的特异性识别靶标。分子对接模拟进一步验证Apt-28通过

CRediT作者贡献声明

黄承宝：初稿撰写、方法学、调查研究、数据整理。石瑞然：软件、方法学、调查研究。梁加建：审稿与编辑、数据整理。程灵燕：数据整理。胡力楷：数据整理。涂昭：数据整理。王晓南：数据整理。王莉：验证、监督、经费获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能对本研究所报告的工作产生影响的经济利益或个人关系等已知利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号 32572521）和广东省重点研发计划（资助编号 2025B0202120003）的支持。

Chengbao Huang|Ruiruan Shi|Jiajian Liang|Lingyan Cheng|Likai Hu|Zhao Tu|Xiaonan Wang|Li Wang