《Modern Pathology》：Cross-Platform Concordance in DNA Methylation Based Classification of CNS Tumors
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DNA甲基化谱分析能够实现对儿童中枢神经系统（central nervous system, CNS）肿瘤的精准分类。Oxford Nanopore Technologies（ONT）可提供当天、单样本的甲基化读取结果，但其在常规诊断任务中与Illumina
DNA甲基化谱分析能够实现对儿童中枢神经系统（central nervous system, CNS）肿瘤的精准分类。Oxford Nanopore Technologies（ONT）可提供当天、单样本的甲基化读取结果，但其在常规诊断任务中与Illumina EPIC芯片的一致性仍未完全明确。研究人员使用EPIC芯片和ONT对23例儿童肿瘤（18例CNS，5例非CNS）进行了分析。两个平台产生的甲基化谱均使用crossNN（脑肿瘤模型或泛癌模型）进行分类；ONT数据还使用Rapid-CNS2和Sturgeon进行了分类。研究人员比较了（i）分类器与整合组织学（不含NGS）在家族水平（family level）和类别水平（class level）上的一致性，（ii）高于平台特异性评分阈值的通过率，（iii）拷贝数变异（copy-number variation, CNV）和MGMT启动子甲基化状态的跨平台一致性。在CNS病例中，ONT与EPIC甲基化谱显示出强相关性，唯一例外是1个离群样本（P2），该样本被排除在进一步分析之外。对两个平台的比较评估显示：（a）使用crossNN分类器进行的CNS肿瘤分子分类在所有病例的家族水平上与组织学（不含NGS）一致。（b）拷贝数谱在两个平台间高度一致。（c）MGMT启动子甲基化状态在94%（16/17）的病例中一致。在使用ONT数据比较ONT特异性分析流程时，Rapid-CNS2流程产生了最可靠的类别水平分配，与组织病理学诊断的一致性为94%（16/17），略高于crossNN和Sturgeon分类器。在非CNS肿瘤中，泛癌模型产生的低置信度输出与组织学（不含NGS）的一致性较差（仅1/5一致），表明这些实体瘤的临床应用准备度有限。总之，ONT能够实现当天、临床可靠的家族水平CNS肿瘤分类，且与芯片高度一致，而EPIC在类别水平上仍保留一定优势。ONT的一个关键局限性是依赖新鲜冷冻DNA以及基于芯片来源CpG位点构建的分类器，而非基于ONT数据原生开发的模型。
研究背景与目的
儿童中枢神经系统（central nervous system, CNS）肿瘤需要精准分子诊断以指导治疗和预后判断，但传统组织病理学在异质性或疑难病例中常存在局限。2021年世界卫生组织（World Health Organization, WHO）CNS肿瘤分类已将分子和表观遗传标志物，尤其是全基因组DNA甲基化谱（DNA methylation profile），纳入诊断标准。目前多数甲基化分类流程依赖Illumina Infinium MethylationEPIC芯片（v1/v2），并通过机器学习分类器如Heidelberg分子神经病理学（Molecular Neuropathology, MNP）分类器进行解读；芯片工作流程通常批量进行，可能造成报告延迟。Oxford Nanopore Technologies（ONT）可实时、单样本产生甲基化数据，但ONT与EPIC芯片在常规诊断中的一致性尚未充分明确。研究人员在23例儿童肿瘤中对两种平台进行配对比较，以评估ONT能否在不牺牲诊断准确性的前提下提供快速分类，并比较不同ONT专用分类器的性能。该研究发表于《Modern Pathology》。
方法概要
研究依托Sidra儿科癌症生物样本库（Sidra Pediatric Cancer Biobank），为回顾性单中心研究，纳入2018年1月至2024年12月间确诊的23例儿童（年龄<15岁）肿瘤：18例CNS肿瘤（颅咽管瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤）和5例非CNS肿瘤。配对的新鲜冷冻（fresh-frozen, FF）及甲醛固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）样本分别进行Illumina Infinium MethylationEPIC v1/v2芯片分析和ONT PromethION测序；使用crossNN（脑肿瘤模型/泛癌模型）对两种数据统一分类，ONT数据额外用Rapid-CNS2和Sturgeon流程分析；以Heidelberg MNP分类器作为芯片参考，通过Pearson相关、t分布随机邻域嵌入（t-SNE）和层次聚类评估一致性，并比较拷贝数变异（copy-number variation, CNV）和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）启动子甲基化状态。
主要结果
1. 队列与流程：23例均完成EPIC芯片和ONT测序；18例CNS中6例使用EPIC v1.0、12例使用v2.0，7例有匹配FF样本；非CNS均使用FF样本v2.0。ONT平均CpG覆盖度为14–88，测序深度约30X。
2. ONT与EPIC甲基化一致性：两个平台均呈双峰甲基化分布；在最具变异的32,000个CpG位点上，除P2外CNS肿瘤的配对相关性为0.75–0.95，非CNS为0.55–0.94；FF与FFPE的EPIC值高度一致（0.85–0.99）。t-SNE嵌入显示各患者配对样本位于相同参考亚型簇，例外包括P2（ONT落入“炎症对照”簇）和P6（落在低级别胶质瘤簇）。P2因平台间明显不一致被排除。
3. crossNN脑肿瘤分类比较：EPIC数组在家族水平达到阈值≥0.4的比例为94%（16/17），类别水平为76%（13/17）；ONT在家族水平≥0.2的比例为88%（15/17），类别水平为65%（11/17）。与整合组织学（±
