《Neurobiology of Learning and Memory》：Orphan C/D box snoRNAs are associated with fear-related memory processes in mice
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摘要C/D box小核RNA（snoRNA）是一类对细胞RNA功能具有重要调控作用的小非编码RNA。尽管已有充分证据表明snoRNA通过2'-O-甲基化协调前核糖体RNA和小核RNA的转录后修饰，从而增强RNA稳定性，但snoRNA是否参与记忆相关过程仍鲜有研究。通过靶向测序
摘要
C/D box小核RNA（snoRNA）是一类对细胞RNA功能具有重要调控作用的小非编码RNA。尽管已有充分证据表明snoRNA通过2'-O-甲基化协调前核糖体RNA和小核RNA的转录后修饰，从而增强RNA稳定性，但snoRNA是否参与记忆相关过程仍鲜有研究。通过靶向测序，我们在C57BL/6 J雄性小鼠的前额叶皮层中鉴定出超过150种C/D box snoRNA，其中31种在恐惧消退学习过程中呈差异性表达，还包括2种推测的新型C/D box snoRNA。这些snoRNA的一个子集（包括许多孤儿型）在突触区室中富集，并在学习过程中表现出亚细胞定位的动态变化。恐惧消退学习诱导的突触富集型snord64增加伴随着编码泛素连接酶RNF146的mRNA 3-UTR区域2'-O-甲基化水平升高；snord64敲低可成比例地降低该甲基化水平，为snord64作为甲基化引导分子提供了相关性证据。这些发现揭示了一群经验依赖性的、突触定位的snoRNA群体，并暗示C/D box snoRNA活性参与恐惧消退学习过程中突触mRNA的表观转录组调控。
引言
RNA除其核苷酸序列和细胞内丰度外，还具备多层信息承载能力。RNA的二级结构和共价修饰对其功能至关重要，有时充当环境响应开关，以情境和状态依赖的方式改变单个RNA分子的功能（见Wan等，2011；Mortimer等，2014；Bevilacqua等，2016综述）。这些特征在神经元中尤为重要，因为神经元需要将RNA运输到与细胞体物理距离较远的突触处，并能进行活性依赖的突触RNA局部翻译（Bieber等，2019）。因此，鉴定神经元特异性RNA修饰及其功能对于理解对传入信息的快速局部响应至关重要。
许多RNA修饰由识别靶RNA中序列或结构元件的蛋白质驱动。其他修饰则由小RNA引导，小RNA通过碱基配对作为修饰复合物与靶RNA之间的适配器。小核RNA（snoRNA）是这一机制的典型代表，snoRNA分为两类，各以其特定的序列基序定义。H/ACA box snoRNA引导特定尿苷残基异构化为假尿苷，而C/D box snoRNA则引导互补RNA的2'-O-甲基化，从而影响其稳定性和二级结构（图1）（Henras等，2017；Reichow等，2007）。大多数snoRNA引导前核糖体RNA的修饰，这些snoRNA依赖的rRNA修饰高度保守，对核糖体结构必不可少，也是生存所必需的（Henras等，2017；Reichow等，2007）。然而，相当数量的snoRNA属于孤儿型，其未被发现与核糖体序列具有互补性。孤儿型snoRNA的功能在很大程度上仍不清楚，尽管此前的研究发现其中一些在大脑中表现出特异性表达模式（Cavaillé等，2000；Rogelj，2006；Runte等，2001）。除此之外，关于孤儿型snoRNA在大脑中的作用或在学习与记忆背景下的角色所知甚少。
学习对与负面事件相关联的刺激做出恐惧反应是一种广泛保守的生存机制，而恐惧消退——即在反复呈现恐惧线索而无进一步负面后果后恐惧反应的消除——同样如此。恐惧消退是一种独特的学习形式，其中新的记忆与先前习得的恐惧反应竞争并抑制其表达；它高度依赖前额叶皮层（Bouton等，2021）。作为模型系统，恐惧消退具有临床转化意义，因为消退学习的缺陷是创伤后应激障碍（PTSD）和焦虑障碍等疾病中病理性恐惧持续存在的根本原因（Milad & Quirk，2012）。我们团队及其他团队已证明了活性依赖性基因调控对条件性恐惧的学习、回忆和消退的重要性（Baker-Andresen等，2013；Katz & Lamprecht，2015；Leighton等，2019；Li等，2019；Lin等，2011；Mizuno等，2020；Peixoto等，2015；Wei等，2022）。
C/D box snoRNA具有若干特征，使其在经验依赖性基因调控的背景下尤为引人注目。多种C/D box snoRNA（尤其是包括孤儿型在内）表现出脑特异性表达模式，且其引导的2'-O-甲基化是一种化学稳定的修饰，其在非核糖体靶标上的功能仍知之甚少。尽管如此，很少有研究探讨C/D box snoRNA是否参与记忆相关过程。我们着手通过检查成年小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）中C/D box snoRNA的经验依赖性表达来解决这一问题。我们鉴定出超过150种snoRNA，其中31种在恐惧消退学习过程中表现出动态活性，相当数量属于孤儿型。进一步研究表明，其中一种snoRNA——snord64——动态进入突触区室，并引导学习诱导的编码神经保护性泛素连接酶Rnf146的mRNA的2'-O-甲基化。snord64敲低可成比例地降低小鼠前额叶皮层中Rnf146转录本的甲基化水平。综合来看，这些发现表明局部神经元snoRNA活性参与记忆相关过程。
章节摘要
动物
所有涉及动物的实验均经昆士兰大学动物伦理委员会批准。C57BL/6 J雄性小鼠（10–20周龄）用于所有行为学实验。小鼠每笼两只，以透明塑料隔板分隔饲养，并提供筑巢材料，食物和水可自由获取（ad libitum）。小鼠饲养于12小时光/暗循环中，所有行为学实验均在光照期进行。
内侧前额叶皮层C/D box snoRNA的深度测序与鉴定
为探索C/D box snoRNA表达的丰度和多样性，我们对5只接受恐惧消退学习的雄性小鼠和5只记忆保持对照小鼠的前额叶皮层小RNA进行了深度测序。样本来源于整体组织，因此代表了前额叶皮层的所有细胞类型，并富集了约50–110个核苷酸的核内RNA（图2A）。164种小RNA通过了丰度过滤条件（在某一实验组的五个样本中每百万至少1个读段），且具有
讨论
尽管2'-O-甲基化日益被认为是rRNA的重要内部修饰，但相对较少的研究探讨了snoRNA引导mRNA甲基化的可能性。在此我们展示了snoRNA——通常被认为具有组成性功能——在成年大脑中也表现出经验依赖性的表达模式，且孤儿型snoRNA snord64修饰编码神经保护性泛素连接酶Rnf146的mRNA。
我们检测到了已注释的小鼠C/D box的84.7%
CRediT作者贡献声明
Laura J. Leighton：撰写 – 初稿、方法论、调查研究、形式化分析、数据整理、概念构思。Qiongyi Zhao：形式化分析、数据整理。Paul R. Marshall：调查研究。Sachithrani U. Madugalle：调查研究。Angelo H.C. Chan：形式化分析。Mason R.B. Musgrove：调查研究。Haobin Ren：调查研究。Ambika Periyakaruppiah：调查研究。Janette Edson：方法论。Wei Wei：调查研究。Xiang Li：调查研究。Timothy W. Bredy：撰写 – 审稿与
利益冲突声明
作者声明，不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢以下资助机构的支持：美国国立卫生研究院（NIH）（R01MH109588，资助TWB）、国家健康与医学研究委员会（NHMRC）（GNT1181359，资助TWB）和澳大利亚Prader-Willi研究基金会（1424-PWRFA，资助LJL）。LJL和SUM获得Westpac学者信托基金研究生奖学金支持。LJL获得昆士兰大学博士后资助。感谢Rowan Tweedale女士对稿件进行有益编辑。
Laura J. Leighton|Qiongyi Zhao|Paul R. Marshall|Sachithrani U. Madugalle|Angelo H.C. Chan|Mason R.B. Musgrove|Haobin Ren|Ambika Periyakaruppiah|Janette Edson|Wei Wei|Xiang Li|Timothy W. Bredy
