合成原弹性蛋白多肽 - 羟丙基甲基纤维素混合物的混溶性及碳水化合物水解酶抑制活性

《Polymer》：Miscibility and Carbohydrate Hydrolytic Enzyme Inhibition Activity of Synthetic Tropoelastin polypeptide-Hydroxypropyl Methylcellulose Commingles

　　

## 摘要

将基于肽的聚合物与基于纤维素的聚合物混合，可制备出具有多样化物理化学性质的材料。通过经典溶液相方法合成了源自原弹性蛋白的多聚(AAGVP)，并通过13C和1H核磁共振波谱进行了表征，其逆转变温度(Tt)为64.9°C。利用稀溶液粘度法在多种浓度下评估了多聚(AAGVP)与羟丙基甲基纤维素(HPMC)的相容性。由粘度推导的相互作用参数(β、α、Δβ、μ、Δk和ΔB)表明，当多肽含量超过60%时(25°C)，共混物具有相容性。采用FTIR-ATR、DSC、TGA、XRD和AFM进一步考察了溶液浇铸膜片的固态相容性。相容共混物在FTIR光谱中表现出酰胺带的频率位移，且仅显示一个介于两种纯聚合物之间的单一玻璃化转变温度(Tg)，表明热稳定性增强，Fox关系和Gordon-Taylor关系之间的良好吻合也进一步证实了这一点。XRD分析显示从半结晶态向更具非晶态形貌的转变。AFM测量结果表明，相容共混物的均方根表面粗糙度值(79.3至88.41)低于不相容共混物(113至131)。体外实验显示α-淀粉酶抑制活性(IC50: 4.63–7.06 μg)和α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC50: 7.12–5.49 μg)，两者均优于标准抑制剂阿卡波糖(分别为5.78和6.77 μg)。通过Michaelis-Menten和Lineweaver-Burk分析确定的酶动力学参数(Km和Vmax)支持了这些结果。总体而言，多聚(AAGVP)/HPMC共混物在生物医学应用方面可能具有显著潜力。

## 引言

糖尿病影响着全球超过7亿人，每年约有1860万人发展为糖尿病足溃疡(DFUs)。糖尿病足溃疡是非创伤性下肢截肢的主要原因，并伴随死亡率的升高。糖尿病足溃疡的发病机制涉及周围神经病变、缺血、伤口愈合受损、感染和血糖控制不足。这些因素增加了发病率，并大幅推高了医疗支出。糖尿病足溃疡的有效管理十分复杂，通常需要多学科方法以促进愈合、降低截肢率并加强感染控制。尽管糖尿病管理取得了重大进展，但糖尿病足溃疡仍是全球面临的主要健康挑战[1]、[2]、[3]、[4]。

糖尿病伤口渗出液中升高的葡萄糖浓度会刺激细菌增殖、加速晚期糖基化终末产物的形成、增加氧化应激并维持促炎环境。这些特征共同阻碍了再上皮化和血管新生[5]。因此，调节伤口微环境中的葡萄糖水平被指定为一种有前景的治疗策略。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶依次将多糖水解为葡萄糖。抑制这些酶可以降低饮食残留物和微生物淀粉代谢所产生的局部葡萄糖产量[6]。许多抑制剂还表现出抗氧化和抗炎特性。然而，全身性α-葡萄糖苷酶抑制剂(如阿卡波糖)与胃肠道不良反应相关。相反，局部给药可以实现局部作用，全身吸收极少[7]。先进的聚合物贴片支架，包括电纺纳米纤维、水凝胶和微针系统，提供了通用的支架。这些框架可以共同递送酶抑制剂、抗菌剂、抗氧化剂和湿度调节剂，在单一治疗敷料中实现多种功能[8]。伤口愈合的关注点紧密涉及那些极易遭受细菌侵入的步骤，这会加剧炎症并阻碍组织康复。传统棉纱布绷带由于孔隙较大，无法有效防止微生物进入和增殖。先进的伤口敷料必须同时阻止感染、维持平衡湿度、允许气体交换并最大限度减少机械应力，同时保持弹性、无抗原性、生物相容性、无害和可生物降解。鉴于慢性伤口的日益普遍和护理成本的巨大支出，选择合适的物质对于改善伤口愈合效果至关重要[9]。

生物医学应用中使用的先进生物材料主要包括具有多样化表面和体相性质的精密工程聚合物。天然聚合物材料已被广泛应用于生物医学研究。尽管合成聚合物因其可加工性和可定制性而越来越受欢迎，但天然聚合物仍因其固有的生物相容性和可生物降解性而至关重要。合成与天然聚合物的共混是一种广泛采用的方法，用于提高聚合物生物材料的性能。对适应性生物材料的需求推动了复杂聚合物系统的发展，这些系统通常结合合成与天然聚合物。然而，这些系统易受相分离的影响，这可能对它们在生理环境中的性能产生负面影响。因此，在聚合物共混物中实现有效相容性对于保持功能完整性和推进生物医学应用至关重要。

近年来，人们对设计混合聚合物系统越来越感兴趣。聚合物共混物是一种有前景的材料类别，与各自的组分相比，具有增强的物理化学性质和改善的生物相容性。这些共混物由两种或更多聚合物组合而成，产生具有优异或全新性质的材料，类似于金属合金。共混可以增强多种物理化学特性，通常成本低于使用单一聚合物。聚合物共混物的性质取决于聚合物的相容性及其各自的体积或重量分数。相容性是一种热力学性质，描述了聚合物溶液在溶剂、聚合物类型和温度等因素促进π-π堆积、离子相互作用、氢键、偶极-偶极相互作用、范德华力和电荷转移络合物等交换作用时的自缔合能力[10]。无数研究已在分子水平上考察了聚合物共混物的相容性，因为它显著影响最终材料的性质。无论制备方法如何(溶液态或熔融态)，聚合物共混物的热力学相容性直接受分子量或体积、温度以及所用聚合物类型的影响。然而，许多聚合物混合物由于其高粘度而处于亚稳态，而非真正热力学相容[11]。

研究人员探索了多种天然聚合物，包括芦荟和蜂蜜，以及丝蛋白、角蛋白和壳聚糖，以期获得更好的伤口愈合解决方案[12]。尽管这些材料很有前景，但它们也带来了诸如气味难闻、过敏反应和污染风险等挑战[13]、[14]、[15]。为了克服这些障碍，科学家们现在正在制造创新的共混聚合物水凝胶，将天然和合成成分相结合，包括普鲁兰酸-桂皮酸纳米颗粒等先进选择[16]。为了说明聚合物研究的多样性，研究人员探索了广泛的聚合物共混体系。例如包括壳聚糖/PVA/羧甲基纤维素[17]、PVA/海藻酸钠[18]、PVA/糊精[19]、PVA/淀粉和羟乙基淀粉[20]、PVA/葡聚糖[21]、PVA/壳聚糖[22]、PVP/壳聚糖[23]、PVA/明胶[24]、PVA/PVP[25]、PVA/聚乙二醇[26]、PVA/聚(N-异丙基丙烯酰胺)[27]，以及透明质酸/胶原蛋白[28]。与天然聚合物相比，能够在伤口敷料中抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶能力的合成聚合物开发仍然有限。抑制这些酶可以减少伤口部位多糖向葡萄糖的转化，从而可能降低感染风险并改善伤口管理。合成材料在伤口愈合性能方面表现优越，尤其是在热学和力学性能方面。将生物活性成分掺入生物材料支架中进一步促进了伤口愈合反应，从而有助于有效的伤口护理[29]、[30]、[31]。仍需要更多研究以确定最有效的合成聚合物组合。

肽类材料是重要的生物大分子，因其多样化的生物医学应用而备受重视。其多样的功能性和强结构稳定性赋予了它们独特的吸引力[32]。这些生物大分子能自发折叠成有序的二级结构，如α-螺旋和β-折叠。这一特性使其结构、组装和生物功能可定制化。合成多肽以其生物相容性而著称，使其成为组织工程、药物递送和再生医学的理想选择。通过策略性设计实现的结构和功能精确控制，使其能够动态响应温度、pH值和特定分子等条件[33]、[34]。Urry及其同事展示了多肽在药物递送和组织工程中的应用[35]、[36]。从天然来源提取多肽是一个耗时耗力的过程，需要大量溶剂。修饰功能性多肽也面临着重大挑战。国际上减少化学品对健康和环境影响的倡议增加了对限制或替换肽研究和制造中常用试剂、溶剂和树脂的迫切需求。因此，聚合物共混已成为一种更高效和实用的方法，用于生产具有定制化性质的生物医学应用材料。对聚合物共混物进行全面的物理和结构表征，对于发现新型生物材料性能和阐明分子水平上相容性的影响至关重要。

研究人员展示了聚(γ-甲基-L-谷氨酸)(PMLG)、聚(γ-乙基-L-谷氨酸)(PELG)、聚(γ-苄基-L-谷氨酸)(PBLG)和多聚酪氨酸(PTyr)与聚(苯基乙烯)(PVPh)和酚醛树脂的共混[37]、[38]。Mahesh等人报道了原弹性蛋白样序列多聚(GVGVP)、多聚(GVGIP)、多聚(AVGVP)、多聚(AVGIP)、多聚[0.8(AVGVP), 0.2(AEGVP)]的合成与共混，以及它们与商业聚合物的共混。他们证明了与其他聚合物的20%-100%相容性[34]，或某些序列不相容[39]。为了全面了解物理化学特性并推进生物医学应用，设计和合成多种多肽序列并考察它们与其他功能性聚合物的相容性至关重要。

羟丙基甲基纤维素(HPMC)是一种亲水性半合成聚合物，由天然纤维素通过醚化反应衍生而来，在此过程中羟基被羟丙基和甲基取代[40]。其物理化学性质主要由取代度和分子量决定。HPMC含有-OH、-OCH3和-O-CH2-CH(OH)-CH3等功能基团，通过多种次级分子间相互作用促进与多肽的相容性。由于其强成膜性、弹性、生物相容性和可生物降解性，HPMC被广泛使用。该化合物在各个行业有多种应用。它在食品、化妆品、眼科制剂、黏膜黏附剂、药物递送系统、农业和纺织品中作为增稠剂、乳化剂和稳定剂发挥作用[41]。在制药领域，它作为片剂和薄膜包衣粘合剂。它还用于建筑材料，包括瓷砖粘合剂和水泥基涂层，以增强保水性和工作性[42]。

先前的研究考察了HPMC与合成和天然聚合物的组合。例如，Zaccaron等人报道了HPMC/聚(1-乙烯基吡咯烷酮-共-醋酸乙烯酯)共混物，突出了其相容性和热稳定性，但范围仅限于相容性和降解性能[43]。涉及HPMC/普鲁兰的研究侧重于相容性、热学和力学表征，但未涉及酶抑制潜力[44]。关于HPMC/壳聚糖体系的研究主要关注酶固定化和功能膜应用，强调催化性能和形貌，而非相容性、热性能、表面特性和酶抑制的全面分析[45]。其他工作涵盖了基于肽的共混物的相容性和物理化学行为[46]、[47]、[48]。Hussain等人主要关注相分离，缺乏在这些指标之间的全面定量比较[49]。尽管取得了这些进展，但对于聚合物相容性、表面特性、热行为和酶抑制如何在单一系统中相互交联的合理解释仍然不足(表S1)。

本研究旨在填补这一空白，通过例示另一种塑料基多肽——多聚(AAGVP)的理性设计和合成，其中将多聚(AVGVP)中的主链缬氨酸(V)替换为丙氨酸(A)，以调节其结构和物理化学性质。该多肽通过1H和13C核磁共振波谱进行了结构表征，随后与HPMC共混，以评估其在水相和固相中的相容性。在溶液相中，选择稀溶液粘度法作为理解聚合物-聚合物相容性的最合适策略。与其他整体共混物表征方法相比，它也是一种简单、快速且经济的方法。在固相中，对于整合了相容性、玻璃化转变、热稳定性和表面粗糙度分析的共聚(AAGVP)/HPMC共混物，采用FTIR、XRD、DSC、TGA和AFM对膜片进行了表征。对这些共混体系进行了体外α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制实验，Lineweaver-Burk图显示其抑制效果与阿卡波糖相当，表明它们有潜力成为用于糖尿病伤口护理的下一代聚合物基质。为了全面证明其生物医学相关性，需要进行广泛的调查以阐明其结构-性能关系、细胞反应变化、组织修复能力和长期生物相容性。

## 片段章节

### 前体

### 化学试剂

包括氨基酸的叔丁氧羰基(Boc)、苄基酯(OBzl)衍生物、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)、三氟乙酸(TFA)和1-羟基苯并三唑(HoBt)，均购自瑞士Aldrich公司。除甘氨酸外，所有氨基酸均为L-构型，另有说明除外。按照已建立的方案合成了分子量约为50 kDa的多聚(AAGVP)[50]、[51]。所有溶剂

### 二元和三元溶液的粘度

采用石英USLV(Ubbelohde悬液式毛细管粘度计)测量纯HPMC、多聚(AAGVP)及其共混溶液在恒定温度298 ± 0.05 K下的流动时间，毛细管直径为0.5 mm，长度为15 cm。粘度计设计可最小化压力差并减少表面张力对测量的影响。每种聚合物溶解于蒸馏水中，配制成浓度为1.0013 g/dL的溶液。

此外，配制了1%（w/v）的混合溶液。在298 ± 0.1 K的精确恒温水浴中，使用石英超声液体振动器（USLV）对多肽、HPMC及其混合溶液（c = 0.1%）进行粘度测量。释放时间的捕获精度极高，可达±0.01秒。为考虑零溶质浓度下的动能，通过外推至无限稀释确定固有粘度。

利用粘度法评估稀溶液中聚合物-聚合物相容性是基于

**抗糖尿病活性：α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制试验**

抑制碳水化合物水解酶α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶（统称为糖苷修剪酶）是管理2型糖尿病的成熟策略。这些酶催化肠道内复杂碳水化合物水解为可吸收的葡萄糖。通过抑制这些酶，碳水化合物消化减慢，葡萄糖吸收减少。这一作用降低了餐后高血糖[82]，[83]。阿卡波糖是最常用的抑制剂。

**结论**

通过溶液相法合成了一种基于弹性蛋白的多五肽，并与HPMC混合。采用多种分析技术表征了混合物在溶液相和固相中的相容性。粘度参数（β、α、Δ[?]m、μ、Δk和ΔB）证实了在25°C下高达60% HPMC时两种聚合物之间具有良好的相容性。FTIR分析显示吸收带发生位移，表明官能团之间存在氢键相互作用。DSC热图显示了玻璃化转变温度（Tg）的变化。

**CRediT作者贡献声明**

Lokesh H R：撰写—初稿、验证、软件、调查。
Channabasaveshwar V. Yelamaggad：撰写—审阅与编辑、可视化、项目管理。
Rekha N D：撰写—审阅与编辑、软件、项目管理、形式分析。
Mruthunjaya K：撰写—审阅与编辑、形式分析、数据整理。
Alina Sionkowska：撰写—审阅与编辑、可视化、验证、项目管理、资金获取。
Mahesh B：撰写—审阅与编辑、

**利益冲突声明**
? 作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

Lokesh H R | Mahesh B | Alina Sionkowska | Mruthunjaya K | Rekha N D | Divakara S G | Channe Gowda D | Sangesh P. Zodape | Channabasaveshwar V. Yelamaggad

印度班加罗尔-560060，德赖什纳瓦达南路，JSS技术教育学院化学系