构建大肠杆菌细胞工厂以实现没食子酸的高效生产

《Process Biochemistry》：Engineering Escherichia coli cell factory for efficient production of gallic acid

　　

摘要

没食子酸（GA）是一种天然芳香族化合物，具有优异的抗氧化、抗菌和防腐特性，广泛应用于食品加工、功能食品开发及食品安全保鲜领域。然而，其工业生物合成受限于酶催化效率低及中间代谢物积累引起的代谢瓶颈。为应对这些挑战，本研究以3-去氢莽草酸（3-DHS）为前体构建用于GA合成的微生物细胞工厂。建立了由3-DHS脱氢酶（ApAroZ）和原儿茶酸羟化酶（PobA^M2）组成的酶级联反应体系，在最优质量比15:1（PobA^M2/ApAroZ，摩尔比18:1）条件下实现了81%的转化率。随后，通过蛋白质工程将限速酶PobA^M2的催化活性提高了2.1倍。最终，将优化后的途径导入高产量3-DHS底盘菌株中。通过对核糖体结合位点（RBS）强度的精细调控和发酵条件的优化，在5升生物反应器中实现了40.7 g/L的GA产量，其生产速率为1.13 g/L/h，为目前报道的最高水平。这一多维优化策略突破了GA生物合成的瓶颈，为食品级没食子酸的工业生产奠定了坚实基础。

引言

没食子酸（GA）是一种天然酚类芳香族化合物，广泛存在于茶叶、葡萄、浆果和坚果等各种食品原料中，因其具有强抗氧化、抗菌和保鲜活性，被广泛应用于食品防腐、功能性食品添加剂、食用油抗氧化及食品安全控制等领域[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]。研究表明，GA可有效清除自由基，从而保护细胞免受氧化损伤。此外，GA还具有显著的抗炎、抗菌和抗病毒活性，对心血管系统和神经系统具有保护作用[9], [10], [11]。由于其广泛的生物活性，GA被广泛应用于药物开发和食品保鲜[12], [13], [14]。全球对GA的年市场需求量约为8,000吨[15]。目前工业生产主要依赖单宁的化学或酶促水解。然而，原料供应和加工成本方面的限制使得人们迫切需要寻找更具成本效益的替代生产方法。

近年来，利用微生物细胞工厂生物合成芳香族化学品取得了显著进展[16]。据报道，大肠杆菌中莽草酸的产量已达126 g/L[17]，而L-酪氨酸的产量已超过100 g/L[18]。基于高产莽草酸底盘菌株，已构建了3-去氢莽草酸（3-DHS）和对羟基苯甲酸（PCA）的细胞工厂[19]。类似地，L-酪氨酸生产菌株已作为从头合成各种高价值化学品的底盘，包括羟基酪醇[20]、咖啡酸[21]和绿原酸[22]。在GA生物合成方面，研究长期聚焦于挖掘新型途径酶和拓展底物特异性[23], [24]。例如，在葡萄中鉴定的两种新型莽草酸脱氢酶被认为参与GA合成[25]。此外，紫丁香酸可通过紫丁香酸O-脱甲基酶和3-O-甲基没食子酸O-脱甲基酶催化转化为GA[26]。最近，来源于芽孢杆菌属和酿酒酵母的酶成功将木质素衍生的阿魏酸和对香豆酸转化为GA[27]。然而，由于成本或效率方面的限制，这些方法距离工业化应用仍有较大差距。目前，最具前景的GA工业生产途径是依赖PobA突变体催化对羟基苯甲酸的转化[28]。然而，由于PobA的原生功能是将对羟基苯甲酸转化为对羟基苯甲酸，其催化GA合成的活性本质上较低，这阻碍了该途径的发展[29]。因此，迫切需要开发更高效的生物合成技术，以加速实现经济、高产的GA生产。

在本研究中，我们首先验证了多酶级联反应将3-DHS转化为GA的可行性，并确定了途径酶的最优配比。基于对途径瓶颈的评估，我们对关键限速酶进行了蛋白质工程改造。最后，将工程化途径酶导入本实验室先前开发的高产3-DHS底盘菌株中。通过结合表达水平精细调控与发酵条件优化，我们在5升生物反应器中实现了从葡萄糖出发从头生产GA的突破，为工业化大规模生产提供了有价值的参考。

章节摘要

材料

本研究使用的菌株、质粒和引物分别列于表1和表2。大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)用于质粒扩增和蛋白表达。3-DHS高产底盘菌株DHS02为本文作者实验室先前构建[19]。

PCR扩增使用2× Phanta Max Master Mix（Dye Plus）高保真DNA聚合酶（Vazyme Biotech，南京，中国）进行。质粒提取和PCR产物纯化试剂盒购自

3-去氢莽草酸合成没食子酸途径的构建

在此前工作中，我们工程改造了一种可积累101 g/L 3-DHS的大肠杆菌菌株，并从阿奇氏菌（Acinetobacter pittii）PHEA-2中鉴定出一种高效ApAroZ酶[19]。在本研究中，我们首先通过向含100 g/L 3-DHS的发酵液中分别加入20 g/L（湿重）过量表达该酶的大肠杆菌细胞，验证了ApAroZ的催化潜力。30分钟内检测到75 g/L的对羟基苯甲酸（图1A）。基于上述结果，我们以该酶为中心构建双酶级联反应

讨论

在本研究中，我们系统评估了生物催化和从头生物合成两种GA生产策略，确定了起源于关键代谢节点3-DHS的途径为最优路线。对PobA进行蛋白质工程显著提高了3-DHS至GA级联反应的效率。随后，通过采用高产3-DHS菌株作为底盘并整合系统代谢工程策略，我们成功构建了能够

资助来源

本工作得到国家自然科学基金重点项目（项目编号22538006）、国家自然科学基金面上项目（项目编号22478158）以及江苏省科技重大专项（项目编号BG2025045）的资助。

CRediT作者贡献声明

罗一帆：论文撰写——初稿撰写、方法论、形式分析、概念构思。王腾宇：验证、形式分析。宋伟：可视化呈现。魏万青：方法论。胡桂萍：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿撰写、项目管理。吴静：指导、资源、基金获取。

利益冲突声明

本工作未以全部或部分形式发表或提交至其他期刊，所有作者声明不存在利益冲突。本手稿符合《过程生物化学》期刊的所有伦理和出版政策。

致谢

作者感谢所有团队成员对本研究的宝贵贡献。罗一帆和王腾宇构思了研究内容，设计了实验方案，并完成了所有实验工作。宋伟和魏万青在整个研究过程中提供了必要的技术协助。胡桂萍和吴静监督了整个项目，并提供了全面的科学指导。罗一帆和胡桂萍分析了实验数据并撰写了手稿。所有作者

罗一帆|王腾宇|宋伟|魏万青|胡桂萍|吴静

江南大学生命科学与健康工程学院，无锡 214122，中国