P2X4嘌呤能受体缺失改变髓系特异性P2X4嘌呤能受体敲除小鼠中的巨噬细胞稳态、细胞因子分泌与吞噬作用

《Frontiers in Immunology》：P2X4 purinergic receptor loss alters macrophage homeostasis, cytokine secretion, and phagocytosis in a myeloid-specific P2X4 purinergic receptor knockout mouse

　　

引言：P2X4嘌呤能受体（purinergic receptor）在肿瘤相关巨噬细胞上高表达，但其在巨噬细胞中的功能未完全明确。为研究该受体在巨噬细胞中的功能作用，研究人员构建了髓系特异性P2X4嘌呤能受体敲除（P2X4ΔM）小鼠。方法：研究人员利用多重免疫组化（mIHC）和流式细胞术评估多组织免疫谱；通过批量RNA测序（bulk RNA sequencing）、基因集富集分析（GSEA）和基因本体过代表达分析（ORA）确定转录后果；采用阵列与酶联免疫吸附测定（ELISA）分析细胞因子分泌，吞噬实验和Seahorse细胞外流量分析评估耗氧功能。结果：雄性小鼠巨噬细胞P2X4嘌呤能受体缺失导致肝、脾、腹膜组织驻留巨噬细胞密度降低，腹膜B细胞群增加。批量RNA测序显示P2X4是小鼠巨噬细胞最主要P2嘌呤能受体，删除未引起其他P2受体补偿性表达改变。GSEA和ORA显示雄性巨噬细胞干扰素-β（IFN-β）反应和血管生成相关通路富集，雌性线粒体与代谢通路富集。P2X4缺失巨噬细胞促血管生成Lysyl Oxidase-Like 2（Loxl2）表达降低，抗血管生成Plexin-D1（Plxnd1）表达升高。功能上，P2X4删除减弱脂多糖（LPS）诱导的IL-6和MCP-1分泌，P2X4ΔM巨噬细胞吞噬活性增强。结论：巨噬细胞内P2X4嘌呤能受体信号调控巨噬细胞稳态、细胞因子分泌、吞噬作用并改变血管生成相关基因表达。

研究背景方面，P2嘌呤能受体家族包括P2X配体门控离子通道受体（P2X1–P2X7）与P2Y G蛋白偶联受体（P2Y1、P2Y2、P2Y6、P2Y12–14），可被细胞外核苷酸激活。细胞应激时ATP或UTP释放入细胞外环境，作为危险信号招募免疫细胞并激活炎症小体。巨噬细胞表达P2X4、P2X7、P2Y12等P2嘌呤能受体，既往研究提示P2嘌呤能信号参与巨噬细胞活化、细胞因子产生和吞噬，但P2X4嘌呤能受体在巨噬细胞生物学中的具体作用尚未明确定义。研究人员此前报道前列腺肿瘤微环境（TME）中巨噬细胞存在P2X4嘌呤能受体表达。为在接近生理病理微环境模型中界定其功能，研究人员利用Cre-Lox重组系统，以LysMcre转基因小鼠与P2X4 flox小鼠交配，生成髓系特异性P2X4嘌呤能受体敲除小鼠（P2X4^ΔM），以WT同窝小鼠为对照，从体内分布、转录组、代谢与功能层面开展系统研究。该研究论文发表于《Frontiers in Immunology》。

主要关键技术方法中，研究人员使用Johns Hopkins大学动物设施繁育的P2X4^ΔM与WT小鼠，通过腹膜灌洗获取腹腔细胞，从股骨胫骨分离骨髓制备骨髓来源巨噬细胞（BMDM）；以多重免疫组化分析肝、脾、脑组织免疫组成，流式细胞术与荧光激活细胞分选（FACS）分析腹腔免疫群体并分选CD11b⁺F4/80^high巨噬细胞；采用批量RNA测序、GSEA与ORA解析转录与通路变化；以细胞因子阵列和ELISA测血清及LPS刺激后培养上清IL-6、MCP-1、IL-10；以荧光微颗粒法测吞噬活性；以Seahorse XF96测氧消耗率（OCR）。样本队列来源为上述基因工程小鼠的肝、脾、脑、腹膜与骨髓，无外源临床队列。

研究结果部分，3.1 Development of P2X4^ΔM mice：通过mIHC与流式验证P2X4^ΔM在腹膜、肝、脾、脑与BMDM的F4/80⁺巨噬细胞中高效且特异性缺失P2X4嘌呤能受体，WT与P2X4^fl/fl对照间基线表达无差异，模型可用于体内巨噬细胞P2X4研究。

3.2 Myeloid-specific P2X4 purinergic receptor loss did not affect overall animal growth but reduced fecundity：6至12周生长曲线两组无别，但P2X4^ΔM种配对三个月产仔数、窝数与窝仔数均显著低于WT，提示髓系P2X4缺失降低繁殖力。

3.3 P2X4 purinergic receptor loss in myeloid cells reduced F4/80⁺ resident macrophage density in liver, spleen and peritoneal tissues：mIHC与流式显示雄性P2X4^ΔM肝、脾F4/80⁺巨噬细胞面积减少，腹腔CD11b⁺髓系细胞与F4/80^high巨噬细胞比例下降，B细胞（CD19⁺）增加；雌性无此变化；脑F4/80⁺巨噬细胞有上升趋势。

3.4 The P2X4 purinergic receptor was the predominant P2 purinergic receptor expressed in murine macrophages：RNA-seq与qRT-PCR显示P2X4为巨噬细胞最丰富P2受体，敲除后其他P2X7、P2Y2等无补偿性转录改变，验证模型特异性。

3.5 P2X4 purinergic receptor deletion induced more transcriptional changes in macrophages from female compared to male mice：差异表达基因（DEG）分析中雌性额外29个DEG、雄性仅3个额外DEG，Lyz2下调与LyZ1上调在两性出现，提示P2X4信号在雌性巨噬细胞调控网络更广。

3.6 P2X4 purinergic receptor deletion resulted in enrichment of interferon-β response and angiogenesis-related pathways in macrophages from male mice：GSEA见雄性IFN-β反应通路富集，ORA见血管生成基因集（GO:0001525）显著富集。

3.7 P2X4 purinergic receptor deletion reduced Loxl2 and increased Plxnd1 expression in macrophages：RNA-seq、qRT-PCR与Western blot一致显示促血管生成Loxl2/LOXL2降低，抗血管生成Plxnd1/PLXND1升高，Col18a1与Chil1变化有性别差异。

3.8 P2X4 purinergic receptor deletion was associated with enrichment of metabolic pathways related gene sets in female macrophages：雌性GSEA富集NADH脱氢酶复合体组装、氧化还原酶活性和线粒体呼吸链组分，提示线粒体与代谢通路重塑。

3.9 P2X4 purinergic receptor deletion reduced CIV-MTCO1 and HSP60 expression in female macrophages：Western blot显示雌性P2X4^ΔM中复合体IV亚基MTCO1与线粒体分子伴侣HSP60蛋白降低，雄性无显著变化。

3.10 Oxygen consumption rate profiles are largely unchanged in P2X4^ΔM and WT：Seahorse显示雌雄BMDM在寡霉素、FCCP、鱼藤酮/抗霉素A处理下OCR反应完整，基础呼吸无组间功能差异。

3.11 P2X4 purinergic receptor deletion attenuated LPS-induced IL-6 and MCP-1 secretion in macrophages：血清阵列显示雌雄系统因子变化方向不同；ELISA显示静息期IL-10、MCP-1、GDF-15无别，LPS刺激后P2X4^ΔM BMDM的IL-6与MCP-1分泌显著减弱，IL-10不变。

3.12 P2X4 purinergic receptor deletion enhances macrophage phagocytic activity：荧光E. coli生物颗粒吞噬实验显示雌雄P2X4^ΔM BMDM吞噬活性较WT提高约21.5%与23.6%。

讨论部分总结中，研究人员指出LysMcre主要在巨噬细胞实现重组，单核与中性粒细胞本底P2X4低故变化小，B/T细胞不受影响。P2X4^ΔM生长正常但繁殖力下降，可能与巨噬细胞介导的卵巢与生殖组织免疫稳态有关。雄性多组织驻留巨噬细胞减少，可能由于P2X4作为高敏ATP门控通道缺失后丧失ATP介导的生存信号，进而减少成熟巨噬细胞维持，并间接使B细胞抑制解除而比例上升。脑内Iba1⁺P2Y12⁺小胶质细胞不表达P2X4，阳性Iba1⁺F4/80⁺多为浸润巨噬细胞或活化小胶质细胞。雌性DEG更多，与已知巨噬细胞性别差异及P2X4在脊髓小胶质细胞痛觉、卒中损伤中的性别依赖作用一致。雄性IFN-β反应增强可能是对P2X4–mtDNA–cGAS–STING轴来源IFN-β减少的补偿。雌性线粒体/氧化磷酸化（OXPHOS）通路富集伴MTCO1与HSP60蛋白下降，但OCR未变，说明基线代谢功能保留、蛋白稳态改变需非基线状态进一步研究。

结论部分翻译：总体而言，这些发现表明巨噬细胞内P2X4嘌呤能受体信号调控巨噬细胞稳态、细胞因子分泌、吞噬作用，并改变血管生成相关基因的表达。