腺病毒不同型别颗粒粒径的动态光散射法测定

《Molecular Genetics, Microbiology and Virology》：Determination of the Particle Size of Adenoviruses of Different Types Using Dynamic Light Scattering Method

　　

腺病毒载体疫苗在埃博拉出血热与COVID-19预防获批后，已成为一类重要疫苗。腺病毒载体生产过程收集的质量数据包括病毒颗粒数及其与感染性颗粒比值（病毒粒子与感染粒子比）的测定。病毒颗粒粒径测定是表征制剂均一性的重要质量参数。本研究建立了用于腺病毒颗粒粒径测定的动态光散射（DLS）方法；此前该方法曾用于研究腺病毒颗粒，但未用于制剂质量特征监测。材料与方法方面，腺病毒在HEK 293细胞贴壁培养中扩增，经氯化铯密度梯度超速离心浓缩纯化；病毒颗粒数采用分光光度法测定；病毒颗粒粒径采用Malvern Nano ZS zetasizer测定。结果方面，研究人员确定两个重要参数：在pH 7.5缓冲液中，1×1010至1×1011 virus particles/mL的腺病毒制剂浓度可正确测定100至127 nm的粒径，且与腺病毒种属和型别无关。结论方面，DLS法是评估腺病毒颗粒尺寸和所得制剂纯度水平的快速高效分析手段；所需试剂体积少、分析速率高、操作简便，使其适于常规使用；DLS检测外源杂质的能力是重要优势，因为杂质存在会降低终制剂效力并对性质产生负面影响。

《Molecular Genetics, Microbiology and Virology》刊发的该文围绕腺病毒（adenovirus）载体疫苗与基因治疗制剂生产中的质量控制需求展开。研究背景上，腺病毒因生物学特性清楚、遗传稳定、转导效率高、可诱导体液与细胞免疫、2–8°C及冻存条件下较稳定，被广泛用作载体；现行质量控制涵盖重组基因组真实性、病毒粒子（virus particles, vp）数、病毒粒子与感染性粒子比、残留宿主DNA与蛋白等，但病毒颗粒粒径作为反映聚集态和制剂均一性的关键质量属性，此前缺乏适于例行的、无需复杂前处理的监测手段。电子显微镜（EM）、原子力显微镜（AFM）、分析型超速离心（AUC）或可提供形貌与粒径信息，但前处理时间长、可能破坏病毒颗粒或耗时长；动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）可基于布朗运动引起的散射光强涨落获得扩散系数并算出流体动力学直径（hydrodynamic diameter），适合例程监测，但此前未系统用于腺病毒制剂质控。因此，研究人员开展研究，建立并验证DLS测定不同种属与型别腺病毒颗粒粒径的条件，并评估其用于聚集与外源杂质检出的价值。

主要关键技术方法上，研究人员使用来自国家病毒保藏中心的9种人腺病毒（HAdV-1、HAdV-2、HAdV-5、HAdV-3、HAdV-7、HAdV-55、HAdV-19、HAdV-26、HAdV-37）与3种猴腺病毒（SAdV-22、SAdV-23、SAdV-25）样本队列；以HEK293细胞扩增病毒并经CsCl梯度纯化；用A260分光光度法计算vp数；用Malvern Nano ZS zetasizer在25°C进行DLS测定；用AlphaFold Server预测纤维（fiber）三聚体结构、ICM-PRO测量纤维尺寸；并以Gam-COVID-Vac三个批次的色谱纯化HAdV-26与HAdV-5载体作为终产品验证对象。

研究结果部分，首先为纤维二级与三级结构分析。研究人员基于GenBank纤维基因序列用AlphaFold Server构建M. caesari、M. blackbeardi、M. dominans、M. exoticum等种属纤维三聚体模型，发现“core”域由β-片层伪重复单元组成；M. caesari纤维最长、M. blackbeardi最短，理论顶点到顶点总直径约106–169 nm。

其次为DLS测定参数确定。研究人员对HAdV-5设10个浓度（1×10³至1×10¹² vp/mL）并考察pH 4.0–8.0，发现低中浓度呈多峰、多分散指数（Polydispersity Index, PI）高，因散射光统计不足并显示大聚集体；1×10⁹ vp/mL时PI仍偏高；1×10¹⁰至1×10¹² vp/mL呈单峰且PI<0.1；其中1×10¹⁰至1×10¹¹ vp/mL、pH 7.5时粒径约120 nm、分布最均匀，故确定最佳条件为pH 7.5、1×10¹⁰–1×10¹¹ vp/mL、25°C。

再次为不同型别腺病毒粒径测定。研究人员在优化条件下测得其种内型别差异不显著：M. blackbeardi约105 nm，M. caesari约121 nm，M. dominans约108 nm，M. exoticum约113 nm；DLS测得的是capsid表面流体动力学直径，短纤维型别测算值接近“capsid 92–95 nm+纤维长度”的预测值，长纤维因弯曲、不贴近capsid表面而测算值小于理论顶端到顶端长度。

随后为DLS检外源杂质。研究人员对CsCl纯化后HAdV-3、HAdV-7进行0.22 μm过滤前后比对，过滤前出现~105 nm主峰及1000–1300 nm、>5000 nm大聚集体峰，过滤后仅剩腺病毒主峰，说明DLS可敏感指示聚集与外源大颗粒。

继而为Gam-COVID-Vac终产品表征。研究人员测三个批次中HAdV-26组件平均120.7 nm、HAdV-5组件平均131.6 nm，PI约0.1，提示存在轻度聚集；说明DLS可用于重组腺病毒载体终产品的粒径与聚集监控。

讨论部分中，研究人员指出传统质控偏重vp数与感染比，而粒径和聚集状态会影响滴度判定与制剂稳定性；DLS优势在于少量试剂、快速、无需复杂前处理、可检出聚集体与大颗粒杂质。M. caesari实测约122 nm而非166–169 nm，可用纤维弯曲、三聚体纤维（trimeric fiber）非完全伸直及流体动力学直径只计入贴近capsid水化层来解释；除M. dominans外，多数纤维末段共识基序与β-repeat插入还会导致轴弯曲，从而降低实测粒径。DLS不能替代高分辨结构学方法，但适合生产流程中的例行质量监测。

结论部分译为：动态光散射是快速测定腺病毒颗粒粒径和制剂质量控制的的有效工具。所需试剂体积少、分析速率高、操作简便，使该方法适于常规使用。DLS检测病毒聚集体等外源杂质的能力尤其重要，因为其存在会降低终产品质量并限制治疗潜力。